谷胱甘肽转硫酶的制备及动力学研究.ppt课件

1、谷胱甘肽转硫酶的制备谷胱甘肽转硫酶的制备及动力学研讨及动力学研讨 实验内容：实验内容： 一亲和层析法制备谷胱甘肽转硫酶一亲和层析法制备谷胱甘肽转硫酶 二测定酶活力、米氏常数和最大反二测定酶活力、米氏常数和最大反响速度响速度 三三Folin-酚法测定蛋白质含量，计酚法测定蛋白质含量，计算比活力算比活力一测定酶活力的原理一测定酶活力的原理 酶促反响速度：酶促反响体系复杂，影响酶促反响速度的要素酶促反响速度：酶促反响体系复杂，影响酶促反响速度的要素很多，包括底物浓度、酶浓度、产物浓度、很多，包括底物浓度、酶浓度、产物浓度、pH、温度、抑制剂和激、温度、抑制剂和激活剂等影响要素。酶促反响速度通常用在一

2、定条件下，以单位时间活剂等影响要素。酶促反响速度通常用在一定条件下，以单位时间内底物的减少量或产物的生成量来表示，用产物浓度对反响时间作内底物的减少量或产物的生成量来表示，用产物浓度对反响时间作图，得到酶促反响速度曲线。图，得到酶促反响速度曲线。 从图中可以看到，反响速度只在最初一段时间内坚持恒定，随着反响时间的延伸，由于底物浓度降低，产物反响抑制，逆反响速度加快，酶本身失活等要素，使酶促反响速度逐渐下降，最后完全停顿。在测定酶促反响速度时，要防止以上干扰要素，必需在酶促反响初期进展，在最初这段时间内的反响速度称之为反响初速度，在过量的底物存在下，反响初速度与酶浓度成正比。在酶促反响速度曲线上

3、，过原点做切线，其斜率即为初速度。 酶促反响速度的单位是：浓度/单位时间。 酶活力 是指酶催化一定化学反响的才干。酶活力单位定义为：在一定条件下，一定时间内，将一定量的底物转化为产物所需求的酶量，酶活力的大小即酶含量的多少。通常用最适条件下酶所催化的某一化学反响的反响速度来衡量酶活力的大小，酶催化的反响速度越大，酶活力越高，反之，酶活力越低，所以酶活力的测定就是测定酶促反响的速度，即单位时间内底物或产物的浓度变化。 国际单位 酶活力单位一致用国际单位international unit，简写为IU来表示，规定：在最适反响条件25，最适缓冲液离子强度和pH值，最适底物浓度下，每分钟内催化1 mo

4、l底物转化成为产物所需求的酶量为一个国际单位，即1IU = 1mol/min。 比活力 为每毫克蛋白质所具有的酶活力单位数，普通用酶活力单位/mg蛋白质表示。酶的比活力在酶学研讨中用来衡量酶的纯度，对于同一种酶来说，比活力越大，酶的纯度越高。利用比活力的大小可以用来比较酶制剂中单位质量蛋白质的催化才干，是表示酶的纯度高低的一个重要目的。 酶活力的测定酶活力的测定 酶活性的测定应贯穿于酶分别纯化过程的一直。在酶酶活性的测定应贯穿于酶分别纯化过程的一直。在酶的分别纯化过程中的每一个步骤前后，经过测定酶活力，了解总活力的回的分别纯化过程中的每一个步骤前后，经过测定酶活力，了解总活力的回收和比活力提高

5、的倍数，为我们选择适当的分别纯化的方法和条件提供直收和比活力提高的倍数，为我们选择适当的分别纯化的方法和条件提供直接的根据。酶分别纯化的效果可以用总活力的回收率和比活力提高的倍数接的根据。酶分别纯化的效果可以用总活力的回收率和比活力提高的倍数作为目的，总活力损失少、比活力提高倍数多即为有效的纯化方法。作为目的，总活力损失少、比活力提高倍数多即为有效的纯化方法。 酶活力的测定普通是经过测定酶促反响的速度而确定，而酶催化的反酶活力的测定普通是经过测定酶促反响的速度而确定，而酶催化的反响速度可用单位时间内产物的添加量或底物的减少量来表示。测定方法主响速度可用单位时间内产物的添加量或底物的减少量来表示

6、。测定方法主要是根据产物或底物的物理化学特性来决议详细的测定方法，分光光度法要是根据产物或底物的物理化学特性来决议详细的测定方法，分光光度法具有操作简便，时间短，灵敏度高等优点，是一种最重要的酶活力的测定具有操作简便，时间短，灵敏度高等优点，是一种最重要的酶活力的测定方法。方法。 本实验采用1-氯2，4-二硝基苯CDNB和复原型谷胱甘肽作为酶的底物，分光光度法记录酶促反响生成产物GS-DNB引起的光吸收添加值，经过在340nm延续测定反响过程中产物光吸收值的变化，做出光吸收时间曲线，从而计算出酶活力。反响式为：二测定二测定Km Km 和和V V的原理的原理 Km Km和最大反响速度是酶的特征常

7、数，不同的酶和最大反响速度是酶的特征常数，不同的酶KmKm和和 V V不同，不同，受底物、受底物、pHpH、温度、离子强度等要素的影响。将米氏方程的方式、温度、离子强度等要素的影响。将米氏方程的方式加以改动，可以得到几种方程方式，在特定条件下测得不同底物加以改动，可以得到几种方程方式，在特定条件下测得不同底物浓度浓度SS时相应的初速度时相应的初速度v v，用作图法测定，用作图法测定KmKm和和V V。米氏方程是从单。米氏方程是从单底物酶促反响推导出来的，但实践上这种反响很少。在多底物反底物酶促反响推导出来的，但实践上这种反响很少。在多底物反响中，假设只需一种底物浓度发生变化，其他底物浓度坚持不

8、变，响中，假设只需一种底物浓度发生变化，其他底物浓度坚持不变，那么就可以将它看成单底物反响，利用米氏方程的几种方式测定那么就可以将它看成单底物反响，利用米氏方程的几种方式测定KmKm和和V V值。值。 本实验采用终止法，即在酶和底物反响到达预定的时间本实验采用终止法，即在酶和底物反响到达预定的时间1min1min时，立刻参与强酸终止酶促反响，在这段反响时间里产时，立刻参与强酸终止酶促反响，在这段反响时间里产物的生成量根本呈线性添加，用这段反响时间内的平均速度替代物的生成量根本呈线性添加，用这段反响时间内的平均速度替代反响初速度，利用作图法，可以很方便地求出反响初速度，利用作图法，可以很方便地求

9、出KmKm和和V V。 dabc操作步骤操作步骤实验器具一组：实验器具一组： 加样器加样器(200L)：CDNB、GSH(60mmol/L)、酶、酶 1mL注射器塑料：注射器塑料：TCA 测定测定Km和和V 时运时运用用 比色杯：比色杯：2个个 秒表：秒表：1块测定块测定Km和和V 时运用时运用 试剂一台：试剂一台： PB：40m L CDNB、GSH60mmol/L、TCA：小离心管：小离心管 GSH2mmol/L：10m L调整分光光度计的参数：调整分光光度计的参数： wavelength：338nm delay time：30秒秒 cycles：8 一酶活力的测定一酶活力的测定 室温条件

10、下测定，调好紫外分光光度计，取两个室温条件下测定，调好紫外分光光度计，取两个比色杯，按下表加样：比色杯，按下表加样：010.1mol/L PB(pH6.5)2.9mL2.9mL*60mmol/L CDNB50L50L60mmol/L GSH 50L50L混匀，放入分光光度计校零 酶液0 x L加入酶同时按“run”，立即混匀，进行反应测定步骤1.两个比色杯分别参与PB 、底物CDNB和GSH60mmol/L，混匀；2. 放在分光光度计中的空白和“1位上，留意光路方向，按“zero base，等待仪器校零；3. 将“1位上的比色杯拿出，参与酶的同时按“run，立刻混匀，放入分光光度计中；4. 仪

11、器自动读8个数30s读一次，共反响4min。本卷须知本卷须知1. 酶液的稀释：取部分酶液用酶液的稀释：取部分酶液用PB稀释稀释510倍，混匀。倍，混匀。2. 磷酸缓冲液：参与磷酸缓冲液：参与PB的量与酶量有关，要求终体积为的量与酶量有关，要求终体积为3mL。 3. 加酶量：要求加酶量：要求A340nm/min第二个数在第二个数在0.20.5之间，否那么需求调整加酶量重新测定。之间，否那么需求调整加酶量重新测定。4. 空白：第二组或重做时，空白比色杯不动，只需将空白：第二组或重做时，空白比色杯不动，只需将“1位上比色杯重新测定。位上比色杯重新测定。5. 重做：只需将重做：只需将“1位比色杯洗净，

12、参与缓冲液和底物，位比色杯洗净，参与缓冲液和底物，混匀，校零，加酶，混匀，校零，加酶，“run，混匀，测定。，混匀，测定。数据处置数据处置做出时间-光吸收关系曲线，过原点做切线，求出A340nm/min，计算酶活力。酶活力的定义：在一定反响条件下，每分钟内催化1 mol底物转化成为产物所需求的酶量为一个单位，即1IU = 1mol/min。计算公式为： 式中A为每分钟光吸收的变化值，v为酶促反响体积(3mL)，为产物的消光系数(9.6L/mmolcm)，L为比色杯的光程(1cm)。LvAIUGST )(活活力力单单位位 二二Km和和V的测定的测定 取六支试管，按下表加样：取六支试管，按下表加样

13、：0123452mmol/L GSH/mL00.150.300.601.202.4060mmol/L CDNB/L5050505050500.1mol/L PB/mL2.852.702.552.251.650.45酶液/Lxxxxxx反应1min后加入50%的TCA 100L终止反应A340nm/min测定步骤测定步骤 1. 每根试管参与CDNB、GSH2mmol/L、PB后，参与酶，同时用秒表计时，立刻混匀，静置，1分钟时参与50%的TCA，混匀，终止反响； 2. 将仪器 delay time调为0，cycles调为1，空白同酶活性测定，用0试管溶液放在“1位上校零，测定其他各管的吸光值。本卷须知本卷须知1. 酶液的稀释：酶液的稀释： 酶的稀释倍数与酶活力测定一致酶的稀释倍数与酶活力测定一致 。2. 磷酸缓冲液：参与磷酸缓冲液：参与PB的量与酶量有关，要求终体积为的量与酶量有关，要求终体积为3mL。 3. 加酶量：根据前面酶活力的测定决议加酶量，使加酶量：根据前面酶活力的测定决议加酶量，使A340nm/min在在0.050.5之间。之间。4. 仪器参数调整：将仪器参数调整：将delay time调为调为0，cycles调为调为1。5. 空