基因工程实验讲义

1、实验一 已知序列基因的克隆 【实验目的】掌握已知序列基因克隆的原理、流程及操作方法，包括目的基因的分离，与载体的连接，重组DNA的转化及重组子的鉴定。【实验原理】1973年Cohen等人发明了基因克隆技术，其中一项关键技术是重组DNA技术。该技术是用酶学方法，将不同来源的DNA分子在体外进行特异切割、重新连接，组成新的杂合DNA分子。这个杂合分子能够在一定的宿主细胞中进行扩增，形成大量的子代分子。基因克隆的路线包括以下几个基本程序：1.分离制备待克隆的外源DNA片段；2.外源DNA及载体的限制性酶切；3.将靶DNA片段与载体连接，组装成杂合DNA 分子；4.重组DNA分子转入宿主细胞

2、；5.筛选重组子；6.目的基因的确认和分析。1已知序列基因的分离分对于已知序列的基因主要采用化学合成和生物化学两种方法合成目的基因。化学法是将要合成DNA片段3端的第一个核苷酸固定于不溶性的载体上，然后核苷酸开始与另一个核苷酸进行缩合反应，不断重复进行。该方法虽然准确性高，但反应速度慢，且合成的成本高、合成的片段小，所以主要用于合成PCR反应的引物。而实验室合成已知序列基因的主要方法是聚合酶链式反应（PCR）技术。在四种脱氧核苷三磷酸（dNTP）存在下，以寡聚核苷酸为引物及单链DNA为模板，经DNA聚合酶催化合成DNA互补链的过程谓之聚合酶链反应。PCR的基本反应步骤和原理：（1）变性：将反应

3、系统加热至94左右，使模板DNA完全变性成为单链；（2）退火：将温度下降至50左右，使引物与模板DNA退火结合；（3）延伸：将温度升至72，DNA聚合酶以dNTP为底物催化DNA的合成反应。上述三个步骤为一个循环，经2530次循环后，可将模板DNA扩增达百万倍。2目的基因和载体的限制性酶切切目的基因定向克隆到质粒载体，首先要将目的基因与载体经过特定的限制酶消化后，形成匹配末端。虽然在基因克隆时，也可采用平末端方式连接，甚至是不匹配末端也可通过一定的处理进行连接，但匹配末端的连接是最有效的，而且连接效率要高于平末端的连接。限制酶是能特异性结合并切割特殊DNA序列的核酸内切酶。在基因工程中主要应用

4、II类限制酶，因其能识别特异的DNA序列，并在识别位点内进行切割。在进行限制性酶消化时，由于反应条件的变化容易产生星号活性，所以酶切反应要使用与酶配套的缓冲液，加入酶的量应控制在总体系的1/10之内，以防止甘油浓度过高。3目的基因和载体片段的连接接限制酶切割后的目的基因片段和载体片段经回收纯化后，可以用连接酶进行连接。连接酶能催化DNA片段3'-OH和5'-P反应，脱去水分子形成磷酸二酯键，把DNA片段连接起来。进行匹配粘性末端的连接时，两种连接酶（DNA连接酶和T4 DNA连接酶）都可以使用。4连接产物的转化转在体外组装的DNA重组分子只有转入合适的受体细胞，才能进行大量地复

5、制、增殖和表达。转入方式随载体的不同而不同，转移技术包括：转化、转导、杂交、细胞融合及脂质体介导转移等。质粒DNA导入细菌的过程为转化，主要有两种方法：化学法转化和电击法。化学转化法的转化效率低于电击法，但足以满足实验室要求。其原理是使用低温CaCl2处理宿主细胞使其处于感受态，与连接产物混合，冰上30min，42水浴90s，使外源DNA进入宿主细胞。将转化后的细胞涂于平板上，过夜培养后会有菌落出现，即可进行重组子的鉴定。5重组子的鉴定在实验室中，鉴定重组子最简单有效的方式是提取质粒，用限制酶消化检测是否有目的基因片段，并辅助以PCR方法。DNAMarker空质粒单酶切重组质粒单酶切重组质粒双

6、酶切重组质粒的PCR扩增片段 鉴定出的重组质粒通常还用进行DNA序列的测定，确定插入的外源DNA片段是否为目的基因片段。【实验步骤】一已知目的基因的PCR扩增、纯化及限制性酶切实验(一)实验仪器、耗材和试剂1.实验仪器和耗材：PCR仪，电泳仪，电泳槽，水浴锅，无菌超净台（每个超净台上酒精灯，酒精棉球各一套，枪头（1000 µl、200µl）各一盒），低温高速离心机，凝胶成像仪，称量天平，移液器，PCR管，0.5 ml离心管（灭菌），1.5 ml离心管（灭菌）。2.试剂：Taq DNA聚合酶，dNTP，引物，BamH I和Nde I，无菌去离子水，DNA片段凝胶回收试剂盒，琼

7、脂糖，50×TAE电泳缓冲液100 ml（24.2 g Tris碱，5.71 ml 冰乙酸，10 ml 0.5 mol/L EDTA（pH 8.0）(二)实验流程1.目的基因的PCR扩增PCR体系：100 ul Taq DNA聚合酶缓冲液 10 ul Taq DNA聚合酶 1 ul dNTP 2 ul 模板DNA 1 ul 上游引物 1 ul 下游引物 1 ul 无菌去离子水 84 ul混匀后，加50 ul石蜡油，放入PCR仪进行PCR反应。94 3 min94 30 s52 45 s 30个循环72 60 s72 10 min42.目的基因的电泳检测称取0.12 g琼脂糖，加入10

8、 mlTAE电泳缓冲液中。微波炉加热使琼脂糖溶解。待凝胶冷至60 时，加入溴乙锭至终浓度为0.5 µg/ml，快速倒入制胶盒中，插入梳子。待凝胶凝固后，拔出梳子。将凝胶放入电泳槽中，准备上样。取4.5 µl样品与0.5 µl 10× 上样载样液混匀，点入上样孔中。连接电源线，恒压100 V，电泳方向为负极向正极。待电泳前沿至凝胶中部时，停止电泳。将凝胶取出，在紫外灯下检测。3.目的基因的纯化将凝胶中含目的基因的胶条在紫外灯下切下，放入1.5 ml离心管中，用DNA片段回收试剂盒回收。4.回收目的基因的电泳检测取回收后的样品4.5µl，经琼脂糖凝

9、胶电泳检测回收效果。5.目的基因与质粒载体的双酶切将回收后的目的基因及质粒载体分别用Bam HI和NdeI进行同时双酶切，酶切体系如下：总体系：100 µl 目的基因或质粒 待定 Buffer K 10 µl BamH I 5 µl Nde I 5 µl 无菌水 待定37水浴过夜。二目的基因及载体片段的回收与连接(一)实验仪器、耗材和试剂1.仪器和耗材：电泳仪，电泳槽，恒温水浴，无菌超净台，低温高速离心机，凝胶成像仪，移液器，恒温摇床，称量天平，0.5 ml离心管，1.5 ml离心管，枪头（1000 µl、200µl），试管，50 m

10、l离心管（灭菌），250 ml三角瓶，培养皿（灭菌）。2.试剂：无菌去离子水（20 ml），DNA片段凝胶回收试剂盒，琼脂糖，50×TAE电泳缓冲液，T4 DNA连接酶，酵母粉，胰蛋白胨，NaCl。(二)实验流程1.双酶切后目的基因的回收及电泳检测操作方法如前。2.目的基因与质粒载体的连接将目的基因与载体按25:1的比例混合，加入连接酶进行连接。反应体系：10 µl T4DNA连接酶缓冲液 1 lµ T4 DNA连接酶 0.5 µl 目的基因及载体 待定 加无菌水至总体积 待定16 水浴过夜。3.LB固体培养基的配制蛋白胨1.5 g，酵母粉0.75 g，

11、NaCl 1.5 g，琼脂粉2.25 g，加水至150 ml，高压灭菌，铺平板。三大肠杆菌感受态细胞的制备及连接产物的转化(一)实验仪器、耗材和试剂1.仪器和耗材：恒温水浴，无菌超净台，低温高速离心机，恒温培养箱，称量天平，移液器，0.5 ml离心管，1.5 ml离心管，枪头（1000 µl、200µl），无菌涂布棒，试管。2.试剂：无菌去离子水（20 ml），DNA片段凝胶回收试剂盒，琼脂糖，50×TAE电泳缓冲液，T4 DNA连接酶，酵母粉，胰蛋白胨，NaCl，0.1 mol/L CaCl2（用纯水配制），氨苄抗生素（100 mg/ml）。(二)实验流程1.感

12、受态细胞的制备（1）克隆菌JM109的活化取5 µl大肠杆菌JM109保存菌种按1 %接种量接菌于5 ml LB培养基中，37 摇床过夜。（2）将培养过夜的大肠杆菌JM109按2 的接种量重新接于5 ml LB培养基中，37摇床培养至OD600约0.6左右。（3）无菌条件下转入冰预冷的5 ml离心管，4，4000 rpm离心10 min。（4）弃掉培养液，倒置离心管1 min，使残液流尽。（5）用10 ml冰预冷的 0.1 mol/L CaCl2重悬细胞，4，4000 rpm离心10 min。弃上清。（6）沉淀用200 µl CaCl2 （0.1 mol/L）重悬细胞，各取

13、100 µl加入无菌的1.5 ml离心管中。2连接产物的转化（1）取10 µl连接混合物加入100 µl感受态细胞中，轻轻旋转以混合，冰上放置30 min。设立对照组： 1 µl已知质粒加入100 µl感受态细胞中。（2）42 水浴，准确计时90 s，冰上冷却12min。加入400 µl LB培养基，37 摇床培养45 min。（3）取适当体积培养液涂平板，37 过夜。3从对照组平板上挑取1个菌落，从转化平板上随机挑选2个菌落，分别接于5ml LB培养基（加氨苄）中，37培养过夜。四重组子的鉴定（一）实验仪器、耗材和试剂1仪器和耗材：

14、无菌超净台，恒温摇床，移液器，枪头（1000 µl、200µl）。2试剂：限制性内切酶，无菌水，氨苄青霉素（100 mg/ml），质粒提取试剂盒。（二）实验流程1.用质粒提取试剂盒分别提取对照组和样品组细菌中的质粒，各取3 µl进行电泳检测。2.提取的质粒分别用BamH I单酶切和BamH I、Nde I双酶切4h，电泳鉴定。 实验二 目的蛋白的诱导表达 【实验目的】掌握pET 15b载体在大肠杆菌中诱导外源蛋白表达的原理及方法。【实验原理】pET系列载体是利用大肠杆菌T7噬菌体转录系统进行表达的载体，其表达原理见下图。T7噬菌体具有一套专一性

15、非常强的转录体系，利用这一体系中的元件为基础构建的表达系统称为T7表达系统。T7噬菌体基因编码的T7 RNA聚合酶选择性的激活T7噬菌体启动子的转录。它是一种高活性的RNA聚合酶，其合成mRNA的速度比大肠杆菌RNA聚合酶快5倍左右。并可以转录某些不能被大肠杆菌RNA聚合酶有效转录的序列。在细胞中存在T7 RNA聚合酶和T7噬菌体启动子的情形下，大肠杆菌宿主本身基因的转录竞争不过T7噬菌体转录体系，最终受T7噬菌体启动子控制的基因的转录能达到很高的水平。T7噬菌体启动子的转录完全依赖于T7 RNA聚合酶，因此T7 RNA聚合酶的转录调控模式就决定了表达系统的调控方式。噬菌体DE3是噬菌体的衍生

16、株，一段含有lac，lacUV5启动子和T7 RNA聚合酶基因的DNA片段插入其int基因中，用噬菌体DE3的溶源菌，如BL21(DE3)、HMS174(DE3)等作为表达载体的宿主菌，可表达T7 RNA聚合酶，诱导方式类似于Lac表达系统。【实验仪器、耗材和试剂】1仪器和耗材：电泳仪，低温冷冻离心机，恒温摇床，恒温水浴，无菌超净台，移液器，枪头。2试剂：IPTG（1 mol/L）。【实验步骤】1含有重组质粒的表达菌株BL21 （DE3）活化将甘油管保存的含有重组质粒的表达菌BL21（DE3），按1 %接种于5ml LB培养基中（含100ug/ml 氨苄青霉素），37振荡培养过夜。2将过夜培养

17、的重组表达菌按2 %接种量重新接入5 ml LB培养基中，37 振荡培养，至OD600约0.6左右，加IPTG 5 µl，37 振荡培养4 h。8000 rpm离心5 min，弃上清，收集菌体。20保存，可进行SDS-PAGE电泳和Western blot检测目的蛋白。实验三 目的蛋白的检测与鉴定（一） 蛋白质分子量测定 - SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 目的要求 （1）学习SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）测定蛋白质分子量的原理。（2）掌握SDS-PAGE测定蛋白质分子量的操作方法。  原 理 十二烷基苯磺酸钠（SDS）是带负电荷的阴离子去污

18、剂，它能破坏蛋白质的氢键和疏水作用，巯基乙醇能破坏蛋白质二硫键。蛋白质样品在SDS和巯基乙醇同时存在的条件下，多肽链去折叠，呈伸展状态。同时SDS又能与蛋白质分子的侧链形成SDS-蛋白质复合体，此复合体使得伸展的多肽链都带有相同密度的负电荷，掩盖不同的蛋白质之间原有的电荷差异。不同蛋白质的SDS复合物的短轴长度都一样，而长轴则与蛋白质分子量有正比关系。这样的SDS-蛋白质复合物，在凝胶电泳中的迁移率，不再受蛋白质原有电荷和形状的影响，而只受到复合体长轴长度也就是蛋白质分子量的影响。聚丙烯酰胺凝胶（PAGE）是由丙烯酰胺和交联试剂N,N-甲叉双丙烯酰胺在引发剂和增速剂的催化下聚合而成的。是多孔介

19、质，孔径尺寸和生物大分子相似，具有分子筛效应。SDS-PAGE有连续体系及不连续体系两种，这两种体系有各自的样品溶解液及缓冲液，但加样方式，电泳过程及固定、染色与脱色方法完全相同。本实验介绍不连续体SDS-PAGE。  试剂与器材 一、试剂1、标准蛋白质目前国内外均有厂商生产低分子量及高分子量标准蛋白质成套试剂盒，用于SDS-PAGE测定未知蛋白质分子量。2、其它有关试剂（1）10%（W/V）SDS溶液：称5gSDS，加重蒸水至50mL，微热使其溶解，置试剂瓶中，4贮存。SDS在低温易析出结晶，用前微热，使其完全溶解。（2）1%TEMED（V/V）：取1 mLTEMED，加

20、重蒸水至100 mL，置棕色瓶中，4贮存。（3）10%过硫酸铵（AP）（W/V）：称AP1g，加重蒸水至10mL。最好临用前配制。（4）样品溶解液：内含1%SDS，1%巯基乙醇或100 mmol/L二硫苏糖醇(DTT)，40%蔗糖或20%甘油，0.02%溴酚蓝，0.01mol/L pH8.0 Tris-HCl缓冲液。1）先配制0.05mol/L Ph8.0 Tris-HCl缓冲液：称Tris0.6g，加入50mL重蒸水，再加入约3mL 1mol/L HCl，调pH值至8.0，最后用重蒸水定容至100mL。2）按表1配制样品溶解液.  表1 不连续体系样品溶解液配制（引自分子克隆实验指

21、南）SDS巯基乙醇溴酚蓝蔗糖 (甘油)0.05mol/L Tris-HCl加重蒸水至最后总体积为100mg0.1mL2mg4g(2 mL)2mL10mL*如样品为液体，则应用浓一倍的样品溶解液，然后等体积混合。 （5）凝胶贮液30%分离胶贮液：称丙烯酰胺（Acr）30g及N，N-甲叉双丙烯酰胺（Bis ）0.8g，溶于重蒸水中，最后定容至100mL，过滤后置棕色试剂瓶中，4贮存。（6）凝胶缓冲液1）分离胶缓冲液（1.5 mol/L pH8.8 Tris-HCl缓冲液）：称Tris 36.3g，加少许重蒸水使其溶解，再加1mol/L HCl约48mL，调pH至8.8，最后加重蒸水定容至

22、200mL ，4贮存。2）浓缩胶缓冲液（1.0 mol/L pH6.8 Tris-HCl缓冲液）：称Tris12.0g，加少许重蒸水使其溶解，再加1mol/L HCl约96mL，调pH至6.8。最后用重蒸水定容至100mL ，4贮存。（7）电极缓冲液（内含0.1%SDS，0.05mol/L Tris-0.384 mol/L 甘氨酸缓液pH8.3）：称Tris 6.0g，甘氨酸28.8g，加入SDS 1g，加蒸馏水使其溶解后定容至1000mL。（8）1%琼脂（糖）溶液：称琼脂（糖）1g，加电极缓冲液100mL，加热使其溶解，分装后4贮存，备用。3、染色体0.25% 考马斯亮蓝 R250，50%

23、甲醇，10% 冰醋酸，过滤后使用，染色1-2小时5、脱色液30% 甲醇，10% 冰醋酸。 二、器材迷你双垂直电泳仪(槽)（小号）凝胶模（83×75×1.5mm），双稳定时电泳仪电源（6-600V，4-400mA ），移液枪（10，200，1000uL），烧杯（25，50，100mL），细长头的滴管，1mL注射器及6号长针头，微量注射器（50L），可调进样器(1-10, 5-50, 100-250, 200-1000L), 水泵或油泵，真空干燥器，大培养皿（×120160mm），数码相机。  操作方法 一、安装迷你双垂直电泳槽安装方法见

24、仪器说明书。用1.5mm厚的胶条将玻璃板的底端和侧面封好，放入电泳槽中夹紧，待凝胶溶液配好，向里面灌制凝胶。迷你双垂直电泳仪(槽)（小号）双稳定时电泳仪电 二、配胶及凝胶板的制备1、 配胶 表2 配制Tris 甘氨酸SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离胶所用溶液（引自分子克隆实验指南）溶液成分不同体积（ml）凝胶液中各成分所需体积（ml）5ml10ml15ml20ml25ml30ml6%      水2.6ml5.3ml7.9ml10.6ml13.2ml15.9ml30%丙烯酰胺1.0ml2.0ml3.0ml4.0ml5.0ml6.

25、0ml1.5M Tris(pH 8.8)1.3ml2.5ml3.8ml5.0ml6.3ml7.5ml10% SDS0.05ml0.1ml0.15ml0.2ml0.25ml0.3ml10%过硫酸胺0.05ml0.1ml0.15ml0.2ml0.25ml0.3mlTEMED0.004ml0.008ml0.012ml0.016ml0.02ml0.024ml8% 水2.3ml4.6ml6.9ml9.3ml11.5ml13.9ml30%丙烯酰胺1.3ml2.7ml4.0ml5.3ml6.7ml8.0ml1.5M Tris(pH 8.8)1.3ml2.5ml3.8ml5.0ml6.3ml7.5m

26、l10% SDS0.05ml0.1ml0.15ml0.2ml0.25ml0.3ml10%过硫酸胺0.05ml0.1ml0.15ml0.2ml0.25ml0.3mlTEMED0.003ml0.006ml0.009ml0.012ml0.015ml0.018ml10% 水1.9ml4.0ml5.9ml7.9ml9.9ml11.9ml30%丙烯酰胺1.7ml3.3ml5.0ml6.7ml8.3ml10.0ml1.5M Tris(pH 8.8)1.3ml2.5ml3.8ml5.0ml6.3ml7.5ml10% SDS0.05ml0.1ml0.15ml0.2ml0.25ml0.3ml10%过硫酸

27、胺0.05ml0.1ml0.15ml0.2ml0.25ml0.3mlTEMED0.002ml0.004ml0.006ml0.008ml0.01ml0.012ml12% 水1.6ml3.3ml4.9ml6.6ml8.2ml9.9ml30%丙烯酰胺2.0ml4.0ml6.0ml8.0ml10.0ml12.0ml1.5M Tris(pH 8.8)1.3ml2.5ml3.8ml5.0ml6.3ml7.5ml10% SDS0.05ml0.1ml0.15ml0.2ml0.25ml0.3ml10%过硫酸胺0.05ml0.1ml0.15ml0.2ml0.25ml0.3mlTEMED0.002ml0.

28、004ml0.006ml0.008ml0.01ml0.012ml15% 水1.1ml2.3ml3.4ml4.6ml5.7ml6.9ml30%丙烯酰胺2.5ml5.0ml7.5ml10.0ml12.5ml15.0ml1.5M Tris(pH 8.8)1.3ml2.5ml3.8ml5.0ml6.3ml7.5ml10% SDS0.05ml0.1ml0.15ml0.2ml0.25ml0.3ml10%过硫酸胺0.05ml0.1ml0.15ml0.2ml0.25ml0.3mlTEMED0.002ml0.004ml0.006ml0.008ml0.01ml0.012ml 表3 配制Tris

29、 甘氨酸SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳5%积层胶所用溶液（引自分子克隆实验指南）溶液成分总体积 3ml总体积 4ml总体积 5ml总体积 6ml总体积 8ml水2.1ml2.7ml3.4ml4.1ml5.5ml30%丙烯酰胺0.5ml0.67ml0.83ml1.0ml1.3ml1M Tris(pH 6.8)0.38ml0.5ml0.63ml0.75ml1.0ml10% SDS0.03ml0.04ml0.05ml0.06ml0.08ml10%过硫酸胺0.03ml0.04ml0.05ml0.06ml0.08mlTEMED0.003ml0.004ml0.005ml0.006ml0.008ml 2

30、、凝胶板的制备（1）分离胶的制备：按表2配制10mL，12%的分离胶，迅速在两玻璃板的间隙中灌注胶溶液，留出灌注浓缩胶所需空间(梳子的齿长再加0.5cm)。再在胶液面上小心注入一层水（约23mm高），以阻止氧气进入凝胶溶液。约30min后，凝胶与水封层间出现折射率不同的界线，则表示凝胶完全聚合。倾去水封层的蒸馏水，再用滤纸条吸去多余水分。（2）浓缩胶的制备：按表3配制10mL，5%的浓缩胶，迅速在两玻璃板的间隙中灌注胶溶液，直至距离短玻璃板上缘约0.5cm处，立即在浓缩胶溶液中插入干净的梳子。小心避免混入气泡，再加入浓缩胶溶液以充满梳子之间的空隙，将凝胶垂直放置于室温下。约30min后凝胶聚合

31、，再放置2030min，使凝胶“老化”。 小心拔去梳子，用窄条滤纸吸去样品凹槽中多余的水分，将pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液倒入内、外贮槽中，应没过短板约0.5cm以上，即可准备加样。 三、样品的处理与加样1、样品的处理根据分子量标准蛋白试剂盒的要求加样品溶解液，如上海东风生化试剂厂生产的低分子量标准蛋白试剂盒，每一安瓿则需加入200L样品溶解液，自己配制标准及未知样品，按0.51mg/1mL浓度配置样品溶解液，溶解后，将其转移到1.5ml离心管中，轻轻盖上盖子（不要塞紧，以免加热时迸出），在100沸水浴中煮沸3min，取出冷却后加样。如处理好的样品暂时不用，可放在-20冰箱保存较长时间，

32、使用前在100沸水中加热3min，以除去亚稳态聚合。 2、加样一般每个凹形样品槽内，只加一种样品或已知分子量的混合标准蛋白质，加样体积要根据凝胶厚度及样品浓度灵活掌握，一般加样体积为1015L（即210g蛋白）。如样品浓度较低，加样体积可达100L。如样品槽中有气泡，可用注射器针头挑除。加样时，将微量注射器的针头通过电极缓冲液伸入加样槽内，尽量接近底部，轻轻推动微量注射器，注意针头勿碰破凹形槽胶面。由于样品溶解液中含有比重较大的蔗糖或甘油，因此样品溶液会自动沉降在凝胶表面形成样品层。 四、电泳在电极槽中倒入pH8.3 Tris-甘氨酸电泳缓冲液，内含0.1%SDS即可进行电

33、泳。在制备浓缩胶后，不能进行预电泳，因预电泳会破坏pH环境，如需预电泳只能在分离胶聚合后，并用分离胶缓冲液进行。预电泳后将分离胶面冲洗干净，然后才能制备浓缩胶。电泳条件也不同于连续SDSPAGE。开始时电流为10mA（或稳压80V，即8 V/cm胶）左右，待样品进入分离胶后改为2030mA（或稳压160-180V，即15 V/cm胶），当染料前沿距玻璃板底边0.5cm时，停止电泳，关闭电源。 五、染色与脱色电泳结束后，从电泳装置上卸下玻璃板，用刮勺撬开玻璃板。紧靠最左边一孔（第一槽）凝胶下部切去一角以标注凝胶的方位。在两侧溴酚蓝染料区带中心，插入细铜丝作为前沿标记。将染色倒入培养皿中

34、，把凝胶放在大培养皿内，染色1h左右，用蒸馏水漂洗数次，再用脱色液脱色，直到蛋白质区带清晰，即可计算相对迁移率。 七、绘制标准曲线将大培养皿放在一张纸上，量出加样端距细铜丝间的距离（cm）以及各蛋白质样品区带中心与加样端的距离（cm），如图1所示。按下式计算相对迁移率mR：  蛋白样品距加样端迁移距离（cm）相对迁移率mR = 溴酚蓝区带中心距加样端距离（cm） 以标准蛋白质的相对迁移率为横坐标，标准蛋白质分子量为纵坐标在半对数坐标纸上作图，可得到一条标准曲线。根据未知蛋白质样品相对迁移率可直接在标准曲线上查出其分子量。  注意事项 （1）SDS纯度：在

35、SDS PAGE中，需高度的SDS，市售的、化学纯SDS需重结晶一次或两次方可使用。重结晶方法如下：称20g SDS放在圆底烧瓶中，加300mL无水乙醇及约半牛角匙活性碳，在烧瓶上接一冷凝管，在水浴中加热至乙醇微沸，回流约10min，用热布氏漏斗趁热过滤，滤液应透明，冷却至室温后，移至-20冰箱中过夜。次日用预冷的布氏漏斗抽滤，再用少量-20预冷的无水乙醇洗涤白色沉淀3次，尽量抽干，将白色结晶置真空干燥器中干燥或置40以上的烘箱中烘干。（2）SDS与蛋白质的结合量：当SDS单体浓度在1mmol/L时，1g蛋白质可与1.4g SDS结合才能生成SDS-蛋白质复合物。巯基乙醇可使蛋白质间的二硫键还

36、原，使SDS易与蛋白质结合。样品溶解液中，SDS的浓度至少比蛋白质的量高3倍，低于这个比例，可能影响样品的迁移率，因此，SDS用量约为样品量10倍以上。此外，样品溶解液应采用低离子强度，最高不超过0.26，以保证在样品溶解液中有较多的SDS单体。在处理蛋白质样品时，每次都应在沸水浴中保温35min，以免有亚稳聚合物存在。（3）凝胶浓度：应根据未知样品的估计分子量，选择凝胶浓度。分子量在25000200000的蛋白质选用终浓度为5%的凝胶；分子量在1000070000的蛋白质选用终浓度为10%的凝胶；分子量在1000050000的蛋白质选用终浓度为15%的凝胶，在此范围内样品分子量的对数与迁移率

37、呈直线关系。以上各种凝胶浓度其交联度都应是2.6%。标准蛋白质的相对迁移率最好在0.20.8之间均匀分布。值得提出的是，每次测定未知物分子量时，都应同时用标准蛋白质制备标准曲线，而不是利用过去的标准曲线。用此法测定的分子量只是它们的亚基或单条肽链的分子量，而不是完整的分子量。为测得精确的分子量范围，最好用其他测定蛋白分子量的方法加以校正。此法对球蛋白及纤维状蛋白的分子量测定较好，对糖蛋白、胶原蛋白等分子量测定差异较大。（4）对样品的要求：应采纳低离子强度的样品。如样品中离子强度高，则应透析或经离子交换除盐。加样时，应保持凹形加样槽胶面平直。加样量以10-15L为宜，如样品系较稀的液体状，为保证

38、区带清晰，加样量可增加，同时应将样品溶解液浓度提高二倍或更高。（5）由于凝胶中含SDS，直接制备干板会产生龟裂现象。如需制干板，则用25%异丙醇内含7%乙醇浸泡，并经常换液，直至SDS脱尽（约需23天），才可按PAGE法制备干板。为方便起见，常采用照像法，保存照片。 思考题1、简述SDS-PAGE测定蛋白质分子量的原理。2、做好本实验的关键是什么？3、如何分析你的蛋白电泳结果？                  &#

39、160;（二）蛋白印迹western-blotting 目的要求 （1）学习利用western-blotting法鉴定样品中存在靶蛋白成分的原理。（2）掌握western-blotting鉴定样品中存在靶蛋白的操作方法及注意事项。 原 理印迹法(blotting)是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。免疫印迹包括点印迹和蛋白质或多肽的电转移印迹（Western-blotting），Western-blotting是通过把经过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后的蛋白质或多肽转移到固相载体上，然后利用标记性抗体进行检测，从而鉴定样品中靶蛋白成分

40、的存在。经过SDS-PAGE分离的蛋白质或多肽样品，以非共价键形式吸附并转移到固相载体，硝酸纤维素（NC）薄膜或聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，且能保持电泳分离的蛋白质或多肽位置及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，通过用其它蛋白封闭膜上未结合蛋白的位点，目的蛋白即可与对应的抗体发生特异性免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体结合，最后经过底物显色或放射自显影以定位电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。蛋白质的Western印迹技术结合了凝胶电泳的高分辨率和固相免疫测定的特异敏感等多种特点，可检测到低至15ng（最低可到10100pg）中等大小的靶蛋白。 试剂与器材

41、一、试剂1、标准蛋白质目前国内外均有厂商生产低分子量及高分子量标准蛋白质成套试剂盒，用于SDS-PAGE测定未知蛋白质分子量，可根据靶蛋白的分子量大小选择所用的标准蛋白分子量参照（Marker）。2、其它有关试剂 转移缓冲液（pH8.4，湿法转移）Tris 5.81g（48mM）、甘氨酸  2.93g（39mM）、SDS  0.375g（0.0375%），定容至800ml，使用前加甲醇 200ml（20%）。 TTBS缓冲液（pH7.5）Tris 6.05g、NaCl 4.5g、Tween-20 1.5ml、溶于450ml水，用浓盐酸

42、调pH至7.5，定容至500ml。 封闭液牛血清白蛋白（BSA） 3g，溶于100ml TTBS缓冲液, 过滤，在4°C 保存以防止细菌污染。 丽春红预染色液：丽春红 0.5g溶于1ml冰醋酸中，加水至100ml。用时再10倍稀释。 底物缓冲液50 mmol/L Tris-Cl（pH7.5）：Tris 0.61g，溶于80 ml水，用浓盐酸调pH至7.5，定容至100ml。一抗：鼠抗His6的单克隆抗体用TTBS缓冲液按说明书或滴度适当稀释（1：1000），加入终浓度1%BSA。二抗：辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠免疫球蛋白G（HRP-羊抗鼠IgG）用TTBS缓冲液按说明书或滴

43、度适当稀释(1:2000)，加入终浓度1BSA。显色液(现用现配，避光)二氨基联苯胺（DAB） 3mg，溶于10ml底物缓冲液中，临用前加30% H2O2 5ul。二、器材垂直板电泳槽及制胶模具，电转印槽，双恒电泳仪，移液管（1，5，10mL），烧杯（25，50，100mL），1mL注射器及6号长针头，微量注射器（50L），可调进样器(1-10, 5-50, 20-200, 100-1000 L)，硝酸纤维素膜（NC膜），蛇形冷凝管，乳胶手套，剪刀，滤纸，大培养皿（×120-160mm），铅笔，数码相机。 操作方法一、电泳按照SDS-PAGE操作流程进行待检测蛋白样品的电泳

44、分离。二、电转移（本次实验采用湿转）1、准备（戴手套操作，以免污染）：（1）将电泳后凝胶拆下，用去离子水洗涤、切角标记后，放入转移缓冲液中浸泡15分钟。（2）剪6块比凝胶面积略大的滤纸浸入转移缓冲液中浸泡。（3）剪一块NC膜（大小与凝胶相近），以45度角缓慢插入转移缓冲液中，于转移缓冲液中浸泡10分钟左右，保证NC膜均匀润湿。（4）将筛孔夹板、海棉浸入另一转移缓冲液中，用试管赶尽气泡。（5）从转移缓冲液中取出滤纸，凝胶和NC膜，按照3块滤纸凝胶NC膜3块滤纸的顺序放好，放置时避免产生气泡，用剪刀将边缘修剪整齐，保证凝胶NC膜和滤纸边缘齐整，然后置于两块海绵之间、赶气泡，筛孔板固定好，按正确方向

45、（保证凝胶在阴极、NC膜在阳极方向）插入电转移槽中，并加满转移缓冲液。2、电转：通冷凝水，设置电流0.65mA/cm2恒流或80100V恒压开始电转移，转移2h。4、丽春红预染色，并用铅笔标注Marker相应条带（或使用可视Marker）。然后用去离子水缓慢平摇洗至无色。三、免疫测定1、封闭：将转印后的膜浸没于封闭液中，于摇床中缓慢摇动37孵育2h或者4过夜。2、洗膜：用TTBS缓冲液洗膜一次，5min/次。3、一抗结合：加入一抗稀释液（含1%BSA），以能覆盖整个膜为宜，封口，于摇床中缓慢摇动37孵育2小时（或4过夜）。4、洗膜：用适量TTBS缓冲液对膜进行洗脱，以除去未结合的一抗，洗3次，

46、10min/次。5、二抗标记：加入酶标二抗稀释液（含1BSA），室温在摇床上反应1-2h或37反应 1小时。6、洗膜：用TTBS缓冲液洗膜3次，10min/次，以除去未结合的二抗。7、显色：将洗涤后的膜置浸于显色液中，室温避光显色520min，至显色条带清晰。8、显色反应结束后，用去离子水洗涤终止反应。9、将膜在滤纸上沥干，照相。 结果分析 经SDS-PAGE分离并变性后的蛋白或多肽在转移到NC膜的过程中，可以使部分抗原表位或蛋白分子复性，因此能与针对非变性的靶蛋白的一抗发生特异性免疫反应（当然有些抗体与抗原的反应与蛋白是否变性无关，因为它们针对的抗原表位在蛋白或多肽变性前

47、后没有明显变化）。而二抗是以一抗作抗原免疫动物获得的全抗体，经酶类或同位素标记用于检测一抗的一类检测抗体，因而能与一抗特异性结合，最后通过酶与底物的显色反应或放射性同位素自显影技术检测到靶蛋白的存在和位置，以TMB（3,3,5,5-四甲基联苯胺）为底物通常显蓝色或蓝绿色，以DAB为底物通常显棕色。可能遇到的问题及原因分析：1、    出现较均一的高背景即除了目的条带外，膜的其余部分也呈现均一蓝（绿）色（TMB显色）或棕色（DAB显色）背景，分析可能的原因为：（1）膜封闭不完全；（2）封闭液选取不合适，如在生物素/抗生物素体系种使用脱脂奶粉类溶液进行封闭；（3）应用

48、的抗体浓度太高；（4）各轮漂洗过程中漂洗不完全等。2、    出现如斑点式、发泡式的高背景，可能的原因如下：（1）膜封闭不完全；（2）检测用抗体与转移的其它蛋白有交叉反应；（3）膜使用前没有正确的润湿；（4）所使用的缓冲液受到污染等。3、    应该显色的结果信号弱或者没有信号，可能的原因有：（1）蛋白样品转膜不完全；（2）膜的选择不合理或者处理不当，导致蛋白质与膜的结合不够充分；（3）用来检测用的抗体的浓度低或者活性不高；（4）也有可能是进行SDS-PAGE时，蛋白上样量过低；（5）封闭液浓度过高或封闭时间过长，导致抗原蛋白被封闭液

49、掩盖；（6）底物溶液孵育的时间过短或者底物丧失活性；（7）抗原蛋白在实验过程中被消化或降解等。当然如果没有信号也可能是被检样品蛋白中并不含靶蛋白。4、有非特异性的条带产生，可能是因为：（1）使用的底物过于灵敏；（2）由于检测用抗体与其它蛋白存在交叉反应；（3）检测用抗体浓度过高或蛋白质样品量过高等。 注意事项1、   关于转移缓冲液：甲醇可减少凝胶的溶涨并增加蛋白质结合到硝酸纤维素膜上的效率，但易挥发，所以应在使用前添加至转移缓冲液中。另外，转移效率受电泳缓冲液的SDS含量、转移缓冲液pH和转移前凝胶是否染色等影响。所以为提高转膜效率，SDS浓度应不高于0.1%，

50、pH应不低于8.0。2、   关于硝酸纤维素膜：注意操作时一定带手套，防止手上蛋白污染膜；注意膜、胶的顺序一定不要颠倒，蛋白经过SDS处理带负电荷，在电场力下向正极泳动，所以，膜一定要在正极一侧，且一定要赶尽气泡。尽量是滤纸、膜与胶大小一致，防止短路。由于转膜时放热，一定要加冷凝装置。3、   为了让实验更加严谨有说服力，要设计阴性、阳性对照。4、   一抗、二抗要匹配，且浓度一般要参照抗体说明书选择最适当的比例，一抗二抗的 选择直接影响实验结果以及背景的深浅。5、   DAB有致癌的潜在可能，操作时要小心仔细。D

51、AB显色液要现用现配，注意避光。DAB也可用TMB替代，后者与前者显色不同（蓝色），灵敏度更高，但DAB的结果易于拍照保留。6、 膜显色至条带清晰即可，不易时间过长。思考题1、  蛋白印迹的原理。2、本实验的操作要点、结果分析及注意事项磷酸钙介导的质粒真核细胞转染技术实验目的1、掌握磷酸钙沉淀法的基本技术要点2、了解细胞转染技术原理和基本方法实验原理DNA 的真核细胞转染技术包括化学法、物理法、以及生物法。磷酸钙沉淀法是化学法中一种。是基于磷酸钙-DNA复合物的一种将DNA导入真核细胞的转染方法，磷酸钙与带负电荷的DNA结合，形成磷酸钙-DNA复合物，粘附到细胞膜并通过胞饮作用进入靶细胞，被转染的DNA可以整合到靶细胞的染色体中从而产生有不同基因型和表型的稳定克隆。可广泛用于转染许多不同类型的细胞，由于转染效率较低，所以不适用于短暂表达，可用于稳定表达转化产物。实验材料1、实验细胞株 真核细胞293T