神经细胞体外培养方法及应用课件

1、神经细胞体外培养方法及应用田东萍田东萍汕大医学院病理汕大医学院病理(bngl)教研室教研室第一页，共三十页。神经细胞体外培养方法及应用n神经组织的体外培养方法是由神经组织的体外培养方法是由HarrisonHarrison，于于19071907年首创的。年首创的。n由于该方法具有简化细胞生化环境、明确生长条件、便于由于该方法具有简化细胞生化环境、明确生长条件、便于施加实验因素及容易获得活体直接观测结果等优点，因而施加实验因素及容易获得活体直接观测结果等优点，因而已成为研究神经系统结构和功能的有效手段。已成为研究神经系统结构和功能的有效手段。n九十余年来，这项技术已从组织块（或植块）培养（九十余年

2、来，这项技术已从组织块（或植块）培养（explant explant cultureculture）发展到分离细胞培养发展到分离细胞培养( (dissociated cell culture)dissociated cell culture)，并逐渐与多种现代技术结合起来并逐渐与多种现代技术结合起来(q li)(q li)，在神经科学各领域，在神经科学各领域发挥了重大作用。发挥了重大作用。第二页，共三十页。神经细胞体外培养方法及应用n 组织块培养组织块培养分离分离(fnl)细胞培养细胞培养甚至单一型细胞培养甚至单一型细胞培养第三页，共三十页。神经细胞体外培养方法及应用神经神经(shnjng)组

3、织的植块培养法组织的植块培养法n悬滴培养方法悬滴培养方法n单盖玻方法单盖玻方法n双盖玻方法双盖玻方法 1925n改良双盖玻方法改良双盖玻方法n培养物：培养物： CNS灰质、白质、外周神经灰质、白质、外周神经(shnjng)节或神经节或神经(shnjng)小段小段 突起突起 非神经元外伸非神经元外伸第四页，共三十页。神经细胞体外培养方法及应用优点优点(yudin)n 所需培养液量少，可反应组织代谢中所需培养液量少，可反应组织代谢中 微量生化微量生化(shn hu)改变改变n 保留了植块内组织特征保留了植块内组织特征第五页，共三十页。神经细胞体外培养方法及应用不足不足(bz)n 培养空间小，培养空

4、间小，O2 CO2供少供少n 培养空间湿度难以控制，水分会蒸发培养空间湿度难以控制，水分会蒸发n 密封手续繁杂，不利更换密封手续繁杂，不利更换(gnhun)培养液，培养液，难难 以观察单个神经元生长。以观察单个神经元生长。第六页，共三十页。神经细胞体外培养方法及应用神经元的分离神经元的分离(fnl)细胞培养方法细胞培养方法1956年，年，Nakai首创了神经组织的分离培养方法首创了神经组织的分离培养方法材料来源：胚胎动物神经组织材料来源：胚胎动物神经组织n神经元增殖发生于胚胎期神经元增殖发生于胚胎期n形态学分化和化学分化程度低，体外存活强，成熟后形态学分化和化学分化程度低，体外存活强，成熟后则

5、相反，且神经元会受到大的普遍损伤。则相反，且神经元会受到大的普遍损伤。灰质、灰质、PNS神经节，神经元集中神经节，神经元集中(jzhng)，密度大，密度大 第七页，共三十页。神经细胞体外培养方法及应用神经元的体外培养液神经元的体外培养液n 天然合成成分天然合成成分(chng fn) 血清血清 血浆血浆 胚胎胚胎撮液撮液n 人工培养基人工培养基n 无血清培养基无血清培养基 化学限定性培养基化学限定性培养基n 常用的：常用的：DMEM + 添加剂添加剂 F12第八页，共三十页。神经细胞体外培养方法及应用葡萄糖葡萄糖 为神经元能量代谢主要来源为神经元能量代谢主要来源 3333mmmmCOCO2 2

6、NaHCO NaHCO3 3缓冲系统重要缓冲系统重要 HEPESOHEPESO2 2耗量更耗量更高高K K+ + 神经元生理活动神经元生理活动(hu dng)(hu dng)的重要离子，的重要离子，K K+ +是神经元存活所必需的，是神经元存活所必需的，K K+ + 24.5mM 24.5mM 能能提高神经元存活，促分化提高神经元存活，促分化非神经元成分的抑制非神经元成分的抑制 有有 2-3 2-3天天第九页，共三十页。神经细胞体外培养方法及应用 神经元无血清神经元无血清(xuqng)(xuqng)限定培养限定培养液液 人工合成的培养基虽然具备了细胞生长的基本营人工合成的培养基虽然具备了细胞生

7、长的基本营养物质和无机盐类，但仍无法满足不同养物质和无机盐类，但仍无法满足不同(b tn)类类型细胞的特殊需要。大多数神经元在基础培养型细胞的特殊需要。大多数神经元在基础培养液中即使能够存活也为期不长，更难以分裂。液中即使能够存活也为期不长，更难以分裂。因此可根据神经元的特性，给基础培养中再添因此可根据神经元的特性，给基础培养中再添加某些特殊物质。加某些特殊物质。第十页，共三十页。神经细胞体外培养方法及应用选择选择(xunz)添加剂的基本过程添加剂的基本过程n 限定限定(xindng)(xindng)连续细胞系的体外生长条件。连续细胞系的体外生长条件。n 试定该细胞系来源的细胞的培养试定该细胞

8、系来源的细胞的培养 液条件液条件。第十一页，共三十页。神经细胞体外培养方法及应用BottensteinBottenstein实验室经过长期研究实验室经过长期研究(ynji)(ynji)发发现如下添加剂比较好现如下添加剂比较好 人转铁蛋白、牛胰岛素、硒酸钠、孕酮、腐胺加入到人转铁蛋白、牛胰岛素、硒酸钠、孕酮、腐胺加入到F F1212与与DMEM 1:1DMEM 1:1混液中，可以代替血清添加物，用混液中，可以代替血清添加物，用来培养大鼠来培养大鼠CNSCNS的成神经细胞瘤细胞。删去其中任何的成神经细胞瘤细胞。删去其中任何一种添加物都可导致成神经细胞瘤细胞生长一种添加物都可导致成神经细胞瘤细胞生长

9、(shngzhng)(shngzhng)状况锐减。该实验室共列出了三种神经元限定性培养状况锐减。该实验室共列出了三种神经元限定性培养添加物的配方，代号分别为添加物的配方，代号分别为N N1 1、N N2 2、N N3 3。 第十二页，共三十页。神经细胞体外培养方法及应用NN1 1的配方的配方(pi fng)(pi fng)为为n 胰岛素胰岛素5g/mln 转铁蛋白转铁蛋白5g/mln 孕酮孕酮(yn tn)20 nMn 腐胺腐胺100Umn 硒硒30nM第十三页，共三十页。神经细胞体外培养方法及应用神经体外培养神经体外培养(piyng)的生长基质的生长基质 n胶胶 元元 n 多聚赖氨酸多聚赖氨

10、酸 n LN第十四页，共三十页。神经细胞体外培养方法及应用 脊髓后根节脊髓后根节 大脑皮质大脑皮质 孕孕1820天大鼠胚胎天大鼠胚胎(piti) 新生新生13天大鼠天大鼠 在在CMF-Hanks液中取出组织除去脑膜液中取出组织除去脑膜 与与CMF-Hanks 液一起移至离心管液一起移至离心管 舍弃舍弃CMF-Hanks液，再加入液，再加入5ml 0.25%胰蛋白酶和胰蛋白酶和5滴滴0.2%Dnase液液 第十五页，共三十页。神经细胞体外培养方法及应用370C，30min舍弃胰蛋白酶，加入舍弃胰蛋白酶，加入5ml培养液和培养液和10滴滴Dnase液液用巴斯德吸管吹打用巴斯德吸管吹打20次，再用套

11、有微量加样器头的加样器吹打次，再用套有微量加样器头的加样器吹打20次次若有组织残渣，将上清移至新试管若有组织残渣，将上清移至新试管(shgun)再加再加3ml培养液反复吹打培养液反复吹打将细胞悬液收集于离心管，离心将细胞悬液收集于离心管，离心1200r/min ，8min，舍去上清，向沉淀加培养液，离舍去上清，向沉淀加培养液，离心心1200r/min，8min第十六页，共三十页。神经细胞体外培养方法及应用加入培养液调整悬液中的细胞浓度，神经节细胞为加入培养液调整悬液中的细胞浓度，神经节细胞为1 110107 7种入涂有种入涂有poly-D-lysinepoly-D-lysine的盖片上，每片的

12、盖片上，每片5050ll放入放入CO2孵箱中过夜孵箱中过夜次日次日(c r)加加3ml培养液培养液2 2天后（培养的第三天）换入有天后（培养的第三天）换入有DNADNA合成阴断剂的培养液合成阴断剂的培养液 第十七页，共三十页。神经细胞体外培养方法及应用神经元的分离培养神经元的分离培养(piyng)过程过程大鼠大脑皮层神经组织细胞培养大鼠大脑皮层神经组织细胞培养组织来源组织来源n新生大鼠新生大鼠1-2日龄，碘日龄，碘 酒酒 ，洒精消毒。，洒精消毒。n 断头，取出大脑，分离脑断头，取出大脑，分离脑 膜膜 ，夹取两侧大脑皮质，夹取两侧大脑皮质(d no p zh)放放入接种培养液中，用入接种培养液中

13、，用D-Hanks冲洗二遍。冲洗二遍。n剪碎，剪碎，0.5-1mm3,用用D-Hanks充分洗去残血充分洗去残血n加入加入5-10倍量倍量0.25%胰蛋白酶，移入离心管中放到水胰蛋白酶，移入离心管中放到水370C浴浴箱中消化箱中消化20-25分钟。分钟。n终止消化离心洗涤终止消化离心洗涤 2000转转/分分 ，5分钟弃上清。吹打制成细分钟弃上清。吹打制成细胞悬液。胞悬液。n台盼兰染色计数后接种于事先涂好鼠尾胶的台盼兰染色计数后接种于事先涂好鼠尾胶的24孔板中。孔板中。n370C 5%CO2培养培养2天后换生长培养液天后换生长培养液第十八页，共三十页。神经细胞体外培养方法及应用大鼠海马神经细胞培

14、养大鼠海马神经细胞培养(piyng)方法方法 神经元体外生长特征神经元体外生长特征(tzhng)接种密度与体外存活率接种密度与体外存活率n 当当96孔孔 每孔每孔2000-3000个个 或或 7000-10000个个/cm2几几乎无神经元存活乎无神经元存活 n 当当8000-12000个个/96孔孔 或或 2.8万万-4万个万个/cm2 存活率存活率最大。最大。n3天后不到接种的一半，故研究某一生长因子前天后不到接种的一半，故研究某一生长因子前3天加药最好天加药最好第十九页，共三十页。神经细胞体外培养方法及应用神经元的体外存活神经元的体外存活(cn hu)时间时间n 短短1-2Wn 长长 4个

15、月个月第二十页，共三十页。神经细胞体外培养方法及应用体外分化体外分化(fnhu)标志标志n 破伤风毒素破伤风毒素(d s) n NSE n NF200,NF160第二十一页，共三十页。神经细胞体外培养方法及应用神经细胞的特殊染色鉴定神经细胞的特殊染色鉴定(jindng)方方法法n 尼氏体染色尼氏体染色 焦油紫焦油紫 甲苯胺蓝甲苯胺蓝 硫瑾等组化染色硫瑾等组化染色n 镀银镀银(d yn)染色染色 n NADPH-d特异性神经组织化学法特异性神经组织化学法第二十二页，共三十页。神经细胞体外培养方法及应用1. 化学物质，物理因素，生物因素，环境中化学因子，化学物质，物理因素，生物因素，环境中化学因子

16、， 自由基，外伤、高温等因素，病毒感染。自由基，外伤、高温等因素，病毒感染。2. 药物药物(yow)，细胞因子，对神经细胞的作用，各种药物，细胞因子，对神经细胞的作用，各种药物(yow)，如，如 中药，脑活素，神经生长因子，成纤维细胞生长因子中药，脑活素，神经生长因子，成纤维细胞生长因子 （bFGF），），神经营养因子神经营养因子3. 细胞间相互作用：巨噬细胞，雪旺细胞等。细胞间相互作用：巨噬细胞，雪旺细胞等。4. 各种生理病理状态下神经元状态改变各种生理病理状态下神经元状态改变第二十三页，共三十页。神经细胞体外培养方法及应用研究手段及测量指标研究手段及测量指标1. 形态学观察：形态学观察：

17、光镜，相差显微镜：细胞数目，形态，大体结构，突触光镜，相差显微镜：细胞数目，形态，大体结构，突触 电镜：超微结构。电镜：超微结构。2. 激光共聚焦扫描显微镜（激光共聚焦扫描显微镜（laser confocal scanning microscope, LCSM) ：研究细胞内成分变化，离子改变等，三维重建研究细胞内成分变化，离子改变等，三维重建3. 膜片钳技术，细胞表面通道膜片钳技术，细胞表面通道(tngdo)和离子流动，电变化。和离子流动，电变化。第二十四页，共三十页。神经细胞体外培养方法及应用研究手段及测量研究手段及测量(cling)指标指标4. 聚丙烯酰胺凝胶电泳：细胞内蛋白，核酸变化聚

18、丙烯酰胺凝胶电泳：细胞内蛋白，核酸变化5. 染色：苏木染色：苏木(s m)素素-伊红（伊红（HE）染色及尼氏（染色及尼氏（Nissl)染色，免疫组化染色。染色，免疫组化染色。6. 显微测量：胞体平均直径和胞体椭圆率，突起长度及显微测量：胞体平均直径和胞体椭圆率，突起长度及胞径。胞径。7. 荧光光度分析仪：荧光光度分析仪：MTT法测定细胞的法测定细胞的OD值值第二十五页，共三十页。神经细胞体外培养方法及应用1. 1. 神经细胞培养存活的标志：种植神经细胞培养存活的标志：种植2424小时后贴壁，渐长小时后贴壁，渐长出几十微米的突起，神经细胞大多都能存活。出几十微米的突起，神经细胞大多都能存活。2. 2. 特殊培养阶段特殊培养阶段(jidun)(jidun)：培养的：培养的9 9到到1212天之间，有较天之间，有较多神经元死亡，以后存活下的