病原生物与免疫学实验：实验一显微镜的使用及细菌的观察

1、实验室规则 接触到病原菌，一定要坚持无菌操作 进实验室穿上白大衣，离开时反折 严禁饮食，也不要以手抚摸头、面等部位 若发生吸入菌液，割破手指等事故，必须报告老师 接触过菌液的吸管、玻片等器材，投入含有23%来苏儿的容器内 实验完毕，整理桌面微生物实验要求 做实验后要认真完成实验报告，所得结果必须真实记录浙江大学实验报告浙江大学实验报告课程名称： 实验类型： 实验项目名称： 学生姓名： 专业： 学号： 同组学生姓名： 指导老师： 实验地点： 实验日期： 年 月 日实验目的和要求（必填）实验内容和原理（必填）主要仪器设备操作方法与实验步骤实验数据记录和处理实验结果与分析（必填）讨论、心得实验一 显

2、微镜的使用及细菌的观察实验内容 操作：油镜的使用细菌材料玻片标本制备革兰染色法（Gram Stain ） 示教 细菌的基本形态 链球菌 螺形菌 - 弧菌（霍乱弧菌）细菌的特殊结构 鞭毛（变形杆菌） 荚膜（肺炎链球菌） 芽胞（破伤风梭菌） 实验目的 掌握油镜的使用和保护 熟悉细菌的基本形态和特殊结构的镜下特点 掌握无菌操作 掌握革兰染色法显微镜的使用和保护 - 原理 油镜与其他物镜的不同是载玻片与物镜之间不是隔一层空气，而是隔一层油质称为油浸系。这种油常选用香柏油 如果玻片与物镜之间的介质为空气，称为干燥系，当光线通过载玻片后，受折射发生散射现象，进入物镜的光线显然减少，这就降低了视野的照明度

3、香柏油的折射率n1.515，与玻璃n1.52相近。当光线通过载玻片后，可直接通过香柏油进入物镜而不发生折射油浸没物镜油浸没物镜 介质：空气；香柏油油镜的识别 油镜的镜筒最长，透镜直径最小，上面刻有90倍或100倍或Oil等油镜的使用 先按低倍镜到高倍镜的操作步骤找到物像，并将观察部分移至视野的中央。 转动旋转盘，使高倍镜移向一侧，在盖玻片上滴一滴香柏油，然后将油镜对准通光孔，使油镜下端与香柏油接触使油镜下端与香柏油接触(注意操作动作要慢，以免压碎玻片或损坏镜头)。 从目镜内观察，微微上下转动细调节器，至视野内出现清晰的物像时为止。 油镜使用完毕后，必须用拭镜纸沾少许二甲苯将油镜上的香柏油擦净，

4、并用干的拭镜纸檫去二甲苯。 显微镜用毕后，升高镜简，取下玻片标本，转动旋转盘，使每个物镜都不对准通光孔，再下降镜筒，使物镜接近载物台，将聚光镜降下，最后放回橱内。 细菌材料玻片标本制备 涂片-干燥-固定 涂片：涂片：先取一接种环生理盐水放于载玻片的一端，左手持菌液试管，右手持接种环，用接种环从试管培养液中挑取少许大肠杆菌或葡萄球菌大肠杆菌或葡萄球菌培养物与盐水混匀，涂成直径约1厘米的涂片，涂片应薄而均匀。 干燥：干燥：涂片最好放置室温中，待其自然干燥。 固定：固定：手执玻片的一端标本面向上，在火焰外层较快地来回通过三次，约23秒，以玻片反面触及皮肤，以不觉过分地烫为度。待放置冷却后，进行染色。

5、 掌握无菌操作掌握无菌操作 拔或塞试管帽时，应将试管口通过火焰略加烧灼；拔或塞试管帽时，应将试管口通过火焰略加烧灼； 接种环使用前后应在火焰上烧灼灭菌接种环使用前后应在火焰上烧灼灭菌固定的目的固定的目的 杀死微生物，固定其细胞结构杀死微生物，固定其细胞结构 保证菌体能牢固地粘附在载玻片上，以免保证菌体能牢固地粘附在载玻片上，以免水洗时被水冲掉水洗时被水冲掉 改变菌体对染料的通透性，一般死细胞原改变菌体对染料的通透性，一般死细胞原生质容易着色。生质容易着色。革兰染色法 由丹麦C.Gram于1884年创立，是细菌学中很重要的鉴别染色法，通过此法染色，可将细菌鉴别为革兰阳性菌（G+）和革兰阴性菌（G

6、-）两大类 细菌细胞壁的结构革兰染色法原理 G菌菌胞壁结构致密，肽聚糖层厚，脂质含量少，乙醇不易透入。同时乙醇使细胞壁脱水形成一道屏障，阻止结晶紫碘复合物从胞内渗出，故细菌仍保留初染时的紫色。紫色。 G菌菌胞壁结构较为疏松，肽聚糖层很薄，外膜含大量脂质，易被乙醇溶解，致使细胞壁通透性变大，使结晶紫-碘复合物被乙醇溶解析出而脱色，故细菌呈复染时的红色红色革兰染色方法 初染：滴加结晶紫结晶紫染液,染1分钟,水洗. 媒染：滴加卢戈氏碘液卢戈氏碘液,作用1分钟后,水洗. 脱色：加95%酒精酒精23滴于涂片上,频频摇晃35秒钟后,斜持玻片,使酒精流去;再滴加酒精,如此反复23次,直至流下的酒精无色或稍呈

7、淡紫色时为止,约半分钟。水洗 复染：滴加稀释石炭酸复红稀释石炭酸复红染1/21分钟,水洗,待干,油镜检查. （紫碘紫碘酒酒红红、分分半半）、分分半半）革兰染色结果 - 阳紫阳紫阴红阴红 凡能固定结晶紫与碘的复合物,而不易被酒精脱色,仍保留紫色,称为革兰阳性菌革兰阳性菌. 凡易能被酒精脱色,再经复染成红色的细菌,称为革兰阴性菌革兰阴性菌 阳球阳球阴杆阴杆，脑、淋、白、胞、抗例外，脑、淋、白、胞、抗例外仔细观察（染色性，形态，排列），绘图革兰染色的意义 鉴别细菌：鉴别细菌：鉴别G+, G-,初筛标本 选择用药选择用药 致病物质致病物质 大多 G+外毒素，G- 内毒素示教 - 细菌的基本形态 细菌从形态上分，主要有球菌、杆菌、螺形菌三种。 链球菌的示教片 霍乱弧菌的示教片示教 - 细菌的特殊结构 细菌的特殊结构：芽胞、荚膜、鞭毛，另一种菌毛在电镜下才可以见到。 芽胞增强细菌对不良环境的抗性； 荚膜抗吞噬、抗损伤