第六章I 目的基因与载体的连接

1、一一.基因重组基因重组基因工程的核心基因工程的核心 1、 外源外源DNA片段同载体分子连接的方法，片段同载体分子连接的方法，即即DNA分子体外重组技术，主要是依赖于限分子体外重组技术，主要是依赖于限制性核酸内切酶和制性核酸内切酶和DNA连接酶的作用连接酶的作用. 基因重组基因重组: 就是利用就是利用 限制性内切酶及其他一限制性内切酶及其他一些酶类，切割和修饰载体些酶类，切割和修饰载体DNA和目的基和目的基因将两者连接起来，将目的基因插入于可因将两者连接起来，将目的基因插入于可以自我复制的载体内，再转入受体细胞，以以自我复制的载体内，再转入受体细胞，以期这种外源性的目的基因在受体细胞内得到期这种

2、外源性的目的基因在受体细胞内得到扩增或正确表达。扩增或正确表达。2 2、连接前的准备：、连接前的准备： 依不同的研究目的而定，认真设计最终构依不同的研究目的而定，认真设计最终构建的重组体分子。需要考虑下列建的重组体分子。需要考虑下列2 2个方面。个方面。 如果研究目的是如果研究目的是： 表达有价值的蛋白质，要考虑表达有价值的蛋白质，要考虑选用适当的启选用适当的启动子、增强子等调节序列和终止序列动子、增强子等调节序列和终止序列，要将目要将目的基因置于启动子的转录起始点的下游，并审的基因置于启动子的转录起始点的下游，并审视视“阅读框阅读框”是否正确是否正确，这些对表达融合蛋白，这些对表达融合蛋白至

3、关重要。至关重要。 (2) 对某一基因的对某一基因的上游序列进行调控机能分析上游序列进行调控机能分析， 则需考虑则需考虑选择适当的报告基因选择适当的报告基因，并将可能，并将可能 二、连接前的处理二、连接前的处理 为了将目的基因重组于载体分子之中，需要将载为了将目的基因重组于载体分子之中，需要将载体体DNADNA和目的基因和目的基因分别进行适当处理分别进行适当处理，使其可以互，使其可以互相连接，形成新的重组分子。相连接，形成新的重组分子。 1.1.对载体的要求：对载体的要求： 一般采用限制性内切酶法将载体一般采用限制性内切酶法将载体DNADNA分子切割成可分子切割成可与外源基因连接的线性分子与外

4、源基因连接的线性分子. .载体载体DNADNA通常有着许多通常有着许多酶切位点但是并不是所有的酶切位点都可用于重酶切位点但是并不是所有的酶切位点都可用于重组切割，组切割，理想的酶切位点应该符合下列几个条件理想的酶切位点应该符合下列几个条件: : 1 1） 位于载体上位于载体上特定的酶切位点要尽可能少特定的酶切位点要尽可能少, ,最好最好是单一酶切位点是单一酶切位点, ,这样才能保证目的基因和载体这样才能保证目的基因和载体DNADNA以最高的几率正确组合以最高的几率正确组合. . 2)在酶切位点之前要有一个较强的启动子，在酶切位点之前要有一个较强的启动子，使插入的目的基因可在该启动子的指导下高使

5、插入的目的基因可在该启动子的指导下高效表达效表达。比如：高效表达质粒。比如：高效表达质粒 pMH62lpMH62l的的Bgl2Bgl2位点前有一个位点前有一个OMPOMP多肽基因启动子多肽基因启动子 OMPFOMPF，外源基因插入后可以表达出外源基因，外源基因插入后可以表达出外源基因与与OMPOMP多肽融合的蛋白。其突出优点是因多肽融合的蛋白。其突出优点是因OMPOMP多肽是细菌外膜蛋白多肽是细菌外膜蛋白(outer membrane protein, OMP)的主要成分，从而可使外源的主要成分，从而可使外源基因能在细菌外膜上表达基因能在细菌外膜上表达, , 十分有利于目十分有利于目的基因产物

6、的收获和提取的基因产物的收获和提取. . 3凹端补平：使用大肠杆菌DNA聚合酶I Klenow片段部分补平3凹端，将不匹配的3凹端转换为粘端；或者完全补平，产生平端DNA分子，可与任何其他平端DNA相连接。 5 3 3 5 3突端切除：T4噬菌体DNA聚合酶具有强烈的3-5外切核酸酶活性，可将3突端切除。 平端加上人工合成接头合成接头：合成接头是自相互补的两个化学合成的寡核苷酸的等摩尔混合物，而两个寡聚体可形成带一个或多个限制性酶切位点的平端双链体。因此在平端DNA加接头可为其亚克隆操作增加一个或多个限制性酶切位点。三基因与载体的连接三基因与载体的连接(5种方法种方法) 载体载体DNA和目的基

7、因和目的基因DNA的连接的连接,按按DNA片段末端性质不同，可有下述不同的片段末端性质不同，可有下述不同的连接方法：连接方法： 粘性末端连接法粘性末端连接法 平端连接法平端连接法 同聚物加尾连接法同聚物加尾连接法 人工接头连接法人工接头连接法（一）粘性末端（一）粘性末端DNA片段的连接片段的连接 1. 同一限制酶切位点连接: 由同一限制性核酸内切酶切割的不同DNA片段具有完全相同的末端。只要酶切割产生单链突出的粘性末端酶切位点附近的DNA序列不影响连接 .在连接酶的作用下即可形成重组DNA分子.1) 上述方法的缺点：由限制酶产生的具有粘性末端的载体DNA分子，在连接反应中常发生自我环化作用，并

8、在连接酶的作用下重新变成稳定的共价闭合环状结构。 解决方法：用细菌的碱性磷酸酶预先处理线性的载体DNA分子，去除其5末端的磷酸基。 2.不同限制酶切位点连接不同限制酶切位点连接: 由两种不同的限制性核酸内切酶切割的由两种不同的限制性核酸内切酶切割的DNA片段、片段、具有相同类型的粘性末端，彼此称为具有相同类型的粘性末端，彼此称为配伍配伍(互补互补)末末端端也可以采用粘性末端连接也可以采用粘性末端连接. 如，如，同尾酶同尾酶切割可以产生完全配伍的粘性末端，切割可以产生完全配伍的粘性末端，便于两个便于两个DNA片段的连接片段的连接.用同属于用同属于GATC族的族的Mbo1(vGATC)和和BamHI(GvGATCC)；TCGA族的族的Xho1(CvTCGAG)和和Sal1(GvTCGAC)等等，共七族、等等，共七族、30多个限制性核酸内酶，切割多个限制性核酸内酶，切割DNA后，均可与相应后，均可与相应的配伍末