细菌转化与细胞转染技术相关实验易失效传代培养

1、大纲1.载体的分类及选择2.传代培养细胞转染3.miRNA&lincRNA 的功能验证大纲1.载体的选择2.传代细胞转染3.miRNA&lincRNA 的功能验证载体简介载体（vector） ，指在工程重组DNA技术中将DNA片段（目的）转移至受体细胞的一种能自我的DNA植物。三种最常用的载体是细菌质粒、噬菌体和动。质粒载体噬菌体载体载体质粒载体质粒载体：相对质量较小、于DNA之外的环状DNA(一般有1200 kb左右，kb为千碱基对) 。质粒能，也可整合到细菌DNA中，随着DNA的而。常见载体：pcDNA3.1，Pcmv5, FUGW3,PCAG, AAV-8, AAV-9载

2、体载体：以为基础的载体，也是目前最常用的导入方式之一。病毒载体可将遗传物质带入细胞，原理是利用具有传送其组进入其他细胞，进行的机制。可发生于完整（in vivo）或是细胞培养（in。vitro）中。可应用于基础研究、疗法或慢腺质粒载体与载体质粒载体：体外传代培养的多种细胞系。载体优势：（下面着重介绍载体）与表达载体相比，载体的转染效率高很多，特别适合于介导外源在难转染甚至无法转染的哺乳动物细胞中表达。不同载体比较慢表达系统：一种常用的哺乳动物表达系统。慢宿主细胞时，可将携带的外源随机、稳定的整合到宿主细胞组中，实现目的稳定、长期的表达，非常适合于过表达稳定细胞株的建立和RNAi研究。不同载体比

3、较腺表达系统：一种很常用的哺乳动物表达系统；与慢不同的是，腺组及其携带的外源整合到宿主细胞组中，而是游离于宿主组外表达，因此可实现目的瞬时、高丰度的表达，同时还避免了因整合而和可控性高。的潜在的突变和随机效应，安不同载体比较慢载体系统腺载体系统RNADNA原型人类免疫缺陷1 型（HIV）人5型腺（Ad5）包装细胞293T细胞293细胞宿主细胞和裂的哺乳动物细胞和裂的哺乳动物细胞动物模型可获得转动物，效果好不能得到转动物表达时间慢（24天）快（12天）克隆容量最大6kb可高达8kb过表达miRNA特别适合适合RNAi特别适合适合不同载体比较总的来说，对于很多实验，选择腺优势更大，并且很多情况下腺

4、是可以替代慢来进行实验的慢腺优点可以细胞组， 稳定表达，持续时间长， 包装周期短（一般要两）效率高；纯化后的腺病毒可以直接进行动物 注射；可在体外扩增，每次使用 ，可 用包装细胞进行扩增，节约成本；一次包装所得到的滴度较高缺点干扰效率相对于腺不整合到组，无法稳定表达；表达时间相对于慢病毒较短（两三周）；包装腺的周期比慢长（两个半月），包装过程相对较繁琐要低很多；不能扩增，一次包装的用如果再需要只能重新包装；一次包装所得到的 滴度也相对较低总结1.使用质粒载体：常规的功能验证，可采用质粒载体（体外）2. 使用慢介导：题目中提及“慢介导XX”时，使用慢载体系统；需要转染细胞筛选稳定的细胞株时，使用

5、慢载体系统；实验周期较长（如脑梗之类的实验，需要较长的观察周期），使用慢载体系统 （体内和体外难转染的细胞）。3. 使用腺介导：周期较短的观察，使用腺载体系统；动物 载体系统 （体内）。样本量较大，对转染效率要求，使用腺大纲1.载体的选择2.传代细胞转染3.miRNA&lincRNA 的功能验证传代培养细胞转染转染，是将外源性导入细胞内的一种专门技术。目前工作中涉及的转染方法大致可分为物理介导，化学介导和生物介导三类途径。化学介导：脂，磷酸钙转染物理介导：电穿孔转染，显微注射，枪生物介导：侵染3.电转染2.磷酸钙转染1.脂转染脂转染1.脂原理：也称人工细胞膜，是由脂质双层组成的，磷脂在

6、自动生成闭合的双层膜，从而形成一种囊状物被称为脂质小体，最初人们只是运用脂现了膜的融合及内吞作用。模拟膜的构造及其功能，从而发脂转染1.脂原理：也称人工细胞膜，是由脂质双层组成的，磷脂在自动生成闭合的双层膜，从而形成一种囊状物被称为脂质小体，最初人们只是运用脂现了膜的融合及内吞作用。模拟膜的构造及其功能，从而发脂转染2. 适合细胞：各种传代培养的细胞系：例如，HEK293, HEK293T，Hela, Cos7, A549, N2A脂转染步骤3 转染步骤：1. 细胞传代培养；2.24h后，取质粒和脂转染试剂，无菌操作台混匀质粒与脂；3.室温静置0.5-1 h,加入到细胞系中，轻轻摇晃；4.培养

7、箱培养36-72 h。磷酸钙转染1.原理：磷酸根离子与钙离子形成沉淀，包裹DNA，细胞通过胞吞沉淀DNA。颗粒进入细胞，体内的酸环境降解沉淀颗粒，磷酸钙转染1.原理：磷酸根离子与钙离子形成沉淀，包裹DNA，细胞通过胞吞沉淀DNA。颗粒进入细胞，体内的酸环境降解沉淀颗粒，2.成分：1.2.2M CaCl22 x HBS: Na Cl, KCl, Na2HPO4磷酸钙转染步骤3 转染步骤：1. 细胞传代培养；2.24h后，取质粒和2M CaCl2混匀，然后加入到2xHBS溶液中，吹打混匀；3.室温静置0.5h,加入到细胞系中轻轻摇晃，放回培养箱胞吞2和；4.换培养基，然后放入培养箱培养36-72

8、h。磷酸钙转染神经元HEK293电转染原理：电穿孔法应用高压电击短暂或稳定地将DNA导人细胞，是一种目前大受好评的方法。它适用于多数类型的细胞，既可产生高频率的稳定转染，又可产生短暂的表达。电转染步骤1. 消化细胞进行计数，确定细胞的密度，取出足够转染用的细胞，转移到新的1.5 mL， 离心然后用Buffer R重悬细胞。2. 按需加入质粒或siRNA，在电击座中加3mL buffer E，放到电击台上，按操作说明进行电击。3. 将电击过的细胞转移到预热的孔板中，轻柔的前后摇晃孔板几次，放入培养箱培养。电转染效率各转染方式的适用范围及优缺点转染方式适用范围优点缺点脂转染体外传代培养的细胞株；不

9、能转染原代培养的细胞及体内细胞操作步骤简单及周期短， 转染效率高，表达快及 表达量高瞬时表达，表达时间短，不能体内转染慢侵染体外传代培养的细胞株，原代培养的细胞体内细胞可以侵染体外传代与原 代培养细胞及体内细胞， 稳定长时间表达操作步骤多，周期长， 实验技术失败率高磷酸钙转染体外传代培养的细胞株，原代培养的细胞，不能转染体内细胞转染效率高，表达快及表达量高操作步骤多，瞬时表达，表达时间短，不能体内转染，电转染体外传代培养的细胞株，原代培养的细胞，不能转染体内细胞转染效率高，表达快及表达量高操作步骤多，瞬时表达，表达时间短，不能体内转染，需要电转仪，质粒需求量大各转染方式的适用范围及优缺点转染方

10、式适用范围优点缺点脂转染体外传代培养的细胞株；不能转染原代培养的细胞及体内细胞操作步骤简单及周期短， 转染效率高，表达快及 表达量高瞬时表达，表达时间短，不能体内转染慢侵染体外传代培养的细胞株，原代培养的细胞体内细胞可以侵染体外传代与原 代培养细胞及体内细胞， 稳定长时间表达操作步骤多，周期长， 实验技术失败率高磷酸钙转染体外传代培养的细胞株，原代培养的细胞，不能转染体内细胞转染效率高，表达快及表达量高操作步骤多，瞬时表达，表达时间短，不能体内转染，电转染体外传代培养的细胞株，原代培养的细胞，不能转染体内细胞转染效率高，表达快及表达量高操作步骤多，瞬时表达，表达时间短，不能体内转染，需要电转仪

11、，质粒需求量大各转染方式的适用范围及优缺点转染方式适用范围优点缺点脂转染体外传代培养的细胞株；不能转染原代培养的细胞及体内细胞操作步骤简单及周期短， 转染效率高，表达快及 表达量高瞬时表达，表达时间短，不能体内转染慢侵染体外传代培养的细胞株，原代培养的细胞体内细胞可以侵染体外传代与原 代培养细胞及体内细胞， 稳定长时间表达操作步骤多，周期长， 实验技术失败率高磷酸钙转染体外传代培养的细胞株，原代培养的细胞，不能转染体内细胞转染效率高，表达快及表达量高操作步骤多，瞬时表达，表达时间短，不能体内转染，电转染体外传代培养的细胞株，原代培养的细胞，不能转染体内细胞转染效率高，表达快及表达量高操作步骤多

12、，瞬时表达，表达时间短，不能体内转染，需要电转仪，质粒需求量大各转染方式的适用范围及优缺点转染方式适用范围优点缺点脂转染体外传代培养的细胞株；不能转染原代培养的细胞及体内细胞操作步骤简单及周期短， 转染效率高，表达快及 表达量高瞬时表达，表达时间短，不能体内转染慢侵染体外传代培养的细胞株，原代培养的细胞体内细胞可以侵染体外传代与原 代培养细胞及体内细胞， 稳定长时间表达操作步骤多，周期长， 实验技术失败率高磷酸钙转染体外传代培养的细胞株，原代培养的细胞，不能转染体内细胞转染效率高，表达快及表达量高操作步骤多，瞬时表达，表达时间短，不能体内转染，电转染体外传代培养的细胞株，原代培养的细胞，不能转

13、染体内细胞转染效率高，表达快及表达量高操作步骤多，瞬时表达，表达时间短，不能体内转染，需要电转仪，质粒需求量大各转染方式的适用范围及优缺点转染方式适用范围优点缺点脂转染体外传代培养的细胞株；不能转染原代培养的细胞及体内细胞操作步骤简单及周期短， 转染效率高，表达快及 表达量高瞬时表达，表达时间短，不能体内转染慢侵染体外传代培养的细胞株，原代培养的细胞体内细胞可以侵染体外传代与原 代培养细胞及体内细胞， 稳定长时间表达操作步骤多，周期长， 实验技术失败率高磷酸钙转染体外传代培养的细胞株，原代培养的细胞，不能转染体内细胞转染效率高，表达快及表达量高操作步骤多，瞬时表达，表达时间短，不能体内转染，电

14、转染体外传代培养的细胞株，原代培养的细胞，不能转染体内细胞转染效率高，表达快及表达量高操作步骤多，瞬时表达，表达时间短，不能体内转染，需要电转仪，质粒需求量大大纲1.载体的选择2.传代细胞转染3.miRNA&lincRNA 的功能验证miRNA，lincRNA，mRNA（CDNA) 组别miRNA: 即是microRNA，研究功能是通常上调及下调1. 上调：miRNA mimics， NC :21或23bp与不具有相同序列的miRNA2 下调： miRNA inhibitorNC: 不能靶向任何的inhibitor ( non-targeting control)miRNA mimic

15、 , inhibitormiRNA mimics：是模拟生物体内源的miRNAs，运用化学增强内源性miRNA的功能。的方法，能miRNA inhibitor：是化学修饰的专门细胞中特异的靶miRNA的抑制剂。miRNA agomirmiRNA agomir：是在化学的mimics上的基础上，经过特殊的化学修饰升级的，不只是更稳定，表达时间长这么简单，可以实现细胞实验，不需要转染试剂，另外，可以直接溶解后用于动物实验。总之，结构与使用方式与mimics有不同，但作用是一样的，都是使得内源性的miRNA上调。miRNA antagomirmiRNA agomir：是在化学的mimics上的基础上

16、，经过特殊的化学修饰升级的，不只是更稳定，表达时间长这么简单，可以实现细胞实验，不需要转染试剂，另外，可以直接溶解后用于动物实验。总之，结构与使用方式与mimics有不同，但作用是一样的，都是使得内源性的miRNA上调。miRNA antagomir：miRNA antagomir是经过特殊化学修饰的miRNA拮抗剂，通过与体内的成熟miRNA强竞争性结合， 配对，抑制miRNA发挥作用。miRNA与其靶mRNA的互补miRNA antagomir在动物体内外具有更高的稳定性和抑制效果，且能克服体内细富集于靶细胞。antagomir在细胞实验中不需要转染试剂，从胞膜、组织等而避免了转染试剂包装

17、过程的复杂步骤及其对实验的影响。miRNA mimic , inhibitor，miRNA agomir， miRNA antagomir 效率检测1.miRNA mimics：检测miRNA 表达量(QRT-PCR)。2. miRNA inhibitor：检测靶蛋白表达水平（WB)。3. miRNA agomir： 检测miRNA 表达量（Northern blot) 。4. miRNA antagomir：检测靶蛋白表达水平（WB)。miRNA，lincRNA，mRNA（CDNA) 组别LincRNA: 研究功能是过表达及干扰表达1. 过表达：PCDNA3.1-lincRNA, NC: PCDNA3.1空载体2 干扰表达： siRNA干扰，FUGW-siRNA , NC: FUGW-不能靶向任何无义序列)的miRNA，lincRNA，mRNA（CDNA) 组别LincRNA: 研究功能是过表达及干扰表达1. 过表达：PCDNA3.1-lincRNA, NC: PCDNA3.1空载体2 干扰表达： siRNA干扰，FUGW-siRNA , NC: FUGW-不能靶向任何无义序列)的CDNA: 研究功能是过表达及干扰表达1. 过表达：PCDNA3.1-CDNA, NC: PCDNA3.1空载体2 干扰表达： siRNA干扰，FU