通过主客体相互作用构建微流控生物芯片

1、苏州大学本科生毕业论文学院(部)材料与化学化工学部题 目通过主客体相互作用构建可再生微流控芯片目录第一章 绪论41.1基于抗污聚合物的生物活性表面41.2基于抗污聚合物的生物活性表面的制备51.2.1抗污聚合物层的制备51.2.2抗污聚合物生物功能化61.3主客体修饰构建生物活性表面71.3.1主客体相互作用71.3.2主客体在表界面上应用81.3.2.1生物传感器81.3.2.2生物活性表面91.4微流控生物芯片101.4.1微流控技术101.4.2微流控生物芯片的应用111.4.2.1即时检测（POTC）111.4.2.2细胞检测111.5课题的提出121.5.1研究目的及意义121.5.

2、2研究内容及实验方案13第二章 主客体修饰构建微流控生物芯片142.1引言142.2实验部分152.2.1材料与试剂152.2.2实验仪器162.2.3实验方法172.2.3.1OEG-Ada的合成172.2.3.2表面带有光引发剂的 PDMS 膜的制备（I-PDMS）172.2.3.3I-PDMS圆片表面可见光引发接枝OEGMA和OEGMA-Ada172.2.3.4OA-PDMS表面性质表征182.2.3.5Ada含量不同的OA-PDMS圆片的制备182.2.3.6CD-Rhodamine结合Ada含量不同的OA-PDMS圆片182.2.3.7OA-PDMS微流道的制备192.2.3.8生物

3、素七取代的-环糊精包合的OA-PDMS微流道制备192.2.3.9Avidin-FITC吸附测试192.2.3.10表面再生和再应用性能测试192.3结果与分析202.3.1OEGMA-Ada的合成与表征202.3.2OA-PDMS圆片的表征202.3.3不同Ada含量的OA-PDMS圆片上CD-Rhodamine结合量的表征222.3.4 Avidin-FITC吸附和再生性能表征23第三章 结论与展望253.1结论253.2展望25参考文献27致谢28通过主客体相互作用构建可再生微流控生物芯片摘要：近几年，微流控技术因其具有的样品试剂或样品消耗量少，分析速度快，准确性高等特点受到广泛关注，并

4、广泛应用于生物检测、PCR、细胞研究等领域。微流控芯片的生物功能实现往往需要对表面进行化学修饰，但是传统的通过共价修饰实现孔道表面生物功能化的方法有着不可逆和损害表面性能的缺陷。而主客体相互作用作为一种动态的非共价结合方式，可以方便的实现主体分子和客体分子间的可逆结合。通过将主客体相互作用应用于微流控表面修饰，我们期望构建可以灵活实现表面生物功能再生利用的孔道，并进一步应用于广泛的微流分析领域。在本文中，我们通过光引发的方式对孔道表面修饰了抗污聚合物刷并引入客体分子Ada，并利用主客体相互作用在孔道表面结合了CD(biotin)7。我们借此研究了孔道表面的蛋白吸附能力，再生性能以及Ada含量对

5、-CD结合量的影响。本研究可分为以下几部分：（1） 通过简单共混的方法制备了表面有光引发剂的PDMS薄膜（I-PDMS），用可见光引发表面接枝聚合在I-PDMS表面修饰了poly(OEGMA-co-OEG-Ada)无规共聚物刷，运用WCA、FITR验证了聚合物刷的成功接枝。（2） 研究了表面接枝的聚合物层中Ada含量与-CD结合量的关系。通过控制Ada投料比来控制Ada含量，研究不同修饰表面结合CD-Rhodamine的效果。荧光显微镜测试结果表明，Ada含量过高时，CD-Rhodamine的结合效果反而会出现下降，这可能是由于Ada位阻效应的影响。（3） 利用上述修饰方法进行了微孔道修饰，并

6、利用主客体相互作用结合CD-(biotin)7，进而研究了微孔道对Avidin蛋白的吸附性能和再生能力。实验结果表明孔道具有蛋白吸附能力，且通过洗脱剂SDS可实现表面再生。关键词：生物活性表面；主客体相互作用；-环糊精；微流控；可再生 作者：林晓方指导老师：刘小莉 教授Fabrication of regenerable microfluidic chips via host-guest interactionsAbstract:In recent years, microfluidic technology has attracted wide attention because of it

7、s advantages of less sample consumption, fast analysis speed and high accuracy. So, it has been widely used in bioassay, PCR and cell research. The biofunctionalization of microfluidic chips often requires chemical modification of the surface, but the traditional method of biofunctionalization of th

8、e surface by covalent modification has the defects of irreversibility and damage to the surface. As a dynamic non-covalent binding mode, the host-guest interaction can easily realize the reversible binding between the host and guest molecules. By applying the host-guest interaction to the microfluid

9、ic surface modification, we hope to construct a channel that can be regenerated, and to further apply it to a wide range of microfluidic analysis fields. In this paper, we modified surface with antifouling polymer brush and introduced the guest molecule Ada via visible light-induced grafting polymer

10、ization, then we combined CD-(biotin)7 on the surface by host-guest interaction. Then, the effects of protein adsorption, regeneration and the influence of Ada content on -CD binding capacity were studied.Firstly, we synthesized an initiator integrated PDMS (I-PDMS) by a simple thermo curing procedu

11、re. Then, the I-PDMS surface was modified by poly(OEGMA-co-OEG-Ada) copolymer brush via visible light-induced grafting polymerization (OA-PDMS). The polymers grafted surfaces were characterized by static water contact angle (WCA) and Fourier transform infrared reflectance spectroscopy (FTIR).Secondl

12、y, we studied the influence of Ada content on the conjugation of -CD .The surfaces with different Ada content were acquired by modulating Ada feed ratio. Then, we incorporated CD-(Rhodamine) into the surface and the incorporation was evaluated using fluorescence microscopy. The data of fluorescence

13、microscopy showed that the binding effect of CD-Rhodamine would decrease when the content of Ada was too high, which may result from the effect of Ada steric hindrance.Thirdly, we applied above chemical modification method in microchip and integrated CD-(biotin)7 into the surface. Then, the adsorpti

14、on of avidin protein and regeneration of microfluidic channels were studied. We find that the modified channel has the ability to adsorb avidin protein and could be regenerated by sodium dodecyl sulfate (SDS).Key words: bioactive surface; host-guest interaction; microfluidic chipsWrittened by: Xiaof

15、ang LinSupervised by: Xiaoli Liu(Prof.) 第一章 绪论1.1基于抗污聚合物的生物活性表面生物活性表面是在将生物活性分子如糖类、蛋白质、核酸等引入材料表面，从而赋予或增强表面生物功能。生物活性表面在医学检测和医用材料方面有广泛的应用。例如Muriel.behra等1制备了能高效分离细菌的MaPoS粒子。他们首先用CaCO3模板制成多孔性PEG凝胶，然后通过苯甲酮光引发接枝上丙烯酸单体，再接上-NH3+和甘露糖，前者可通过静电力与柠檬酸修饰的纳米氧化物粒子结合，赋予MaPos粒子磁性，后者可结合细菌上的蛋白，可用于临床诊断和药物释放。又如陈红课题组等2运用LB

16、L技术在硅表面沉积交替沉积上P(AA-co-Ada)/PAH薄膜，再通过主客体相互作用结合上CD-QAS。这种表面有很好的抗菌性能，能杀死99%的黏附细菌，并能通过SDS清除表面黏附的死细菌，实现表面功能的再生。但是，由于生物材料置于复杂的生物介质中，往往会发生非特异性吸附，这称为污染。这对生物材料的性能有重大的影响，如在植入体材料（骨夹板）上，非特异性蛋白的吸附会导致异体排斥作用，在生物传感器上，非特异性蛋白的吸附会产生高背景信号和假阳性信号，从而影响检测的准确性。因此需要制备排斥非特异性蛋白吸附同时有高而可控的特异性蛋白吸附的生物活性表面，即在抗污聚合物层的基础上引入生物活性分子3。抗污聚

17、合物可分两性离子聚合物和亲水性聚合物。两性离子聚合物又可分为聚甜菜碱类和聚两性电解质，两者区别在于正负电荷是否在同一单体单元上，而两者都在纳米尺寸上有均匀分布的正负电荷，因此都具有良好的抗污性能。亲水性聚合物中应用最普遍的是PEG类聚合物，这是由于PEG能排斥多种蛋白质的非特异性吸附。同时，把PEG接在聚合物侧链上制成高密度的聚合物刷（POEGMA）能提高表面抵抗非特异性蛋白吸附的能力。抗污的原因可归于表面水合作用和链柔性。蛋白吸附到材料表面时，需要排斥表面因氢键和溶剂化作用而吸附的水，这会产生渗透排斥力和体积排斥作用。同时，因蛋白吸附在表面时会压缩聚合物链，产生回弹力，两者共同导致了表面排斥

18、蛋白非特异性吸附。因此可以调节聚合物的密度，分子量和化学性质，从而影响表面水合作用和链柔性，进而控制抗污性能。具有抗污性能的生物活性表面，不仅能排斥非特异蛋白的吸附，同时能提供亲水性间隔臂，从而降低配体和受体结合的位阻，进而提高生物活性表面的性能。如今构建生物活性表面的方法主要是在抗污聚合物层上引入生物活性分子，但由于抗污聚合物层往往是化学惰性的，且共价修饰会影响抗污性能和生物活性分子的活性，所以仍需开发更好的构建生物活性表面的方法。 1.2基于抗污聚合物的生物活性表面的制备1.2.1抗污聚合物层的制备制备抗污聚合物层修饰表面的方法主要有物理方法和化学接枝方法。物理方法主要有物理吸附和表面涂层

19、，原理是通过已知结构的聚合物和材料表面较强的非共价相互作用如氢键，静电力和疏水相互作用把聚合物层束缚在材料表面，实现表面改性，具有代表性的有Langmuir-Blodgett（LB）膜法，旋涂法，喷涂法。这种方法简单方便且修饰表面均一性好，但由于聚合物层与表面依靠非共价力结合，导致接枝层不稳定。化学接枝法包括“grafting to”和“grafting from”,两种方法，制得表面性质各有特点。“Grafting to”是先制备具有端基活性官能团的已知结构聚合物，然后通过聚合物端基活性官能团与材料表面活性官能团之间的化学反应将聚合物接枝到材料表面上4，具有代表性的方法有巯基和金反应，以及硅

20、氧烷-硅羟基反应。这种方法能很好的控制聚合物层的化学组成，分子量以及分子量分布，还可在表面接枝不同种类的聚合物。但是，由于已接枝的聚合物的长链会屏蔽基材表面活性位点，导致聚合物端基活性官能团无法与基材表面活性官能团反应，进而无法获得高接枝密度的聚合物层，同时也限制了聚合物层的厚度。“Grafting from”是将引发剂预先固定在材料表面，然后在一定条件下引发聚合反应。由于链增长是通过聚合物层上端的链自由基和小分子单体反应实现的，单体无需克服位阻穿过聚合物层，因此聚合速率快。同时，表面接枝密度高而均匀，聚合物链间较强相互作用使抗污聚合物层规整排列，提高了稳定性。其中表面引发活性自由基聚合由于休

21、眠种的形成降低了自由的浓度使得分子量易于控制和分子量分布窄，常用的方法有可逆加成断裂链转移自由基聚合（RAFT），单电子转移活性自由基聚合（SET-LRP），原子转移活性自由基聚合（ATRP）。其中，SI-ATRP因其适应单体多，杂质和氧气耐受力强，引发剂易得而最广泛使用。如石秀娟5等通过SET-LRP的方法构建了PNIPAAm-co-Ada的接枝的温敏性表面，研究了单体浓度、催化剂浓度、聚合时间对接枝层厚度的影响，并探究了Ada含量对表面润湿性和临界转变温度（LCST）的影响以及结合-CD后表面润湿性与温敏性的变化与Ada含量的关系。她们6还进一步在这种表面上结合上了CD-Mannose和C

22、D-Biotin，并发现这种表面可通过温度控制蛋白的吸附量,而LCST又与Ada含量相关，表面还具有很好的特异性和再生性，这可用于微流控生物检测和生物分子的分离。引发聚合反应的途径有引发剂引发，热引发，光引发，辐射引发等。光引发聚合具有活化能低，反应温度低的优点，这适用于耐热性较差的生物材料，同时低温可减少副反应，提高反应产率。而且，可通过光的开关来控制自由基的产生和消失，使聚合物结构有很好的可控性。光引发又分为紫外光引发和可见光引发，可见光引发避免了对人体和环境的不良影响。如熊新红等7提出了一种表面可见光引发接枝聚合物层的方法（图1-1），并成功用于不同类型的乙烯基单体接枝。具体方法首先通过

23、简单混合和固化制得表面有烷基溴的PDMS基材。接着在可见光照射下十羰基二锰（Mn2(CO)10）裂解为Mn（CO）5并夺取PDMS-Br表面烷基溴的溴原子形成 R自由基，原位引发单体聚合形成聚合物层。这种方法的优点是引发条件温和（室温下可见光引发的）、可用于广泛的乙烯基单体接枝且聚合过程简便、快速、高效。图1-1 可见光引发PDMS表面接枝聚合改性路线1.2.2抗污聚合物生物功能化抗污聚合物上引入生物活性分子的方法可分为共价修饰和非共价修饰两种。其中共价修饰又可分为直接共聚和共价后修饰，后者包括侧链后修饰，嵌段共聚物上段后修饰以及链末端后修饰。侧链后修饰是侧链上的功能基团如羟基，羧基，环氧基等

24、被偶联剂激活后与生物分子上的基团反应，随后进行钝化处理。嵌段共聚物上段后修饰特点是保留了底层聚合物层的抗污性能，同时使生物活性分子集中在表面，这很好的保留了抗污性能，并提高了特异性吸附能力，增进了生物活性表面的性能。链末端后修饰因末端基团数量少且分布不均匀，易移动和被聚合物链所包埋，而较少使用。共价后修饰虽应用广泛但存在如下缺陷：（1）激活过程可能会使聚合物的性质如水合性质，链柔性发生变化。（2）同时，钝化过程由于动力学和位阻等限制而无法完全进行，这影响了聚合物层的抗污性能。（3）修饰过程复杂，通常要包括很多步。表面直接共聚含配体（RGD,赖氨酸，甘露糖等）的单体有效的避免了复杂的激活和钝化过

25、程。但这又增加了合成的复杂性，同时使聚合方法的选择，聚合物分子量及其分布的控制更加困难。与共价修饰相比，非共价修饰条件温和，具有可逆性和取向性。特别是主客体后修饰具有可逆性，可控性，简便，相容性好等特点。如渠阳翠等8通过LBL技术在金表面上交替沉积上PAA-co-Ada/PAH薄膜，再由主客体相互作用结合上了CD-Mannose。这种表面能很好的特异性捕获E. coil，同时在SDS或高浓度的Mannose溶液中能很好的释放捕获的细菌，这在微生物检测上有重大应用。1.3主客体修饰构建生物活性表面1.3.1主客体相互作用主客体相互作用是一种超分子非共价相互作用力。主体具有和客体形状相匹配的内腔，

26、且能和客体通过互补的相互作用力（氢键，范德华力，疏水相互作用）紧密的结合在一起。同时，主体外部基团的溶剂化作用强，这增强了主客体复合物的稳定性。主体包括杯芳烃类（calixarenes），冠状醚类（crown ethers），环糊精类（cyclodextrins，CDs），葫芦脲类（cucurbitnurils，CBs）等（图1-2）。其中CB，CD因其结合力较强和生物相容性好而广泛应用于生物材料领域。特别是CD的大环可与客体相结合，而小环上有丰富的羟基，可以通过点击化学修饰上不同的生物活性分子实现不同的生物功能而不影响客体的结合，同时配体的密度较高将产生多价效应，从而提升了表面的性能。图1-

27、2环糊精，葫芦脲和杯芳烃的化学结构示意图1.3.2主客体在表界面上应用1.3.2.1生物传感器生物传感器是一种对生物物质敏感并能把其浓度转化为电信号进行检测的仪器。其可分为分子识别和信号转化两部分，需要将能特异性识别或催化待测物质的生物分子固定在传感器上。通过主客体相互作用引入生物活性分子具有可逆性，因此通过主客体修饰的方法构建生物传感器可赋予生物芯片可再生性。可再生生物芯片有如下优势：（1）避免更换芯片带来的人力，物力的损耗，以及引入的人为干扰；（2）保证了检测过程的连续性；（3）消除了芯片差异带来的干扰；（4）使采用有复杂表面结构的高性能芯片成为可能。如胡昌明等9结合LBL技术和主客体相互

28、作用制备能检测特定蛋白的生物活性表面。他们先在氨基化的硅表面通过聚电解质层层自组装沉积了一层包含客体基团的聚合物薄膜，然后通过主客体相互作用引入七取代生物素修饰的-环糊精（图1-3）。该表面表现出对生物素的高选择性和高特异性，以及很好的再生性能。图1-3通过LBL技术沉积PAA-co-Ada/PAH多层聚电解质薄膜，然后通过主客体相互作用引入生物素修饰的-环糊精的过程。1.3.2.2生物活性表面 通过主客体相互作用构建生物活性表面有如下优点：（1）简单方便，通过主客体的结合就可赋予表面生物功能，无需复杂的合成和纯化过程。（2）条件温和，在室温和水溶液环境下就能完成自组装，避免使用有毒的有机溶剂

29、，同时主客体的生物相容性好。（3）可逆性，主客体作用是非共价作用力，能在洗脱剂作用下实现分离，可用于构建可再生生物活性表面。（4）刺激响应性，在外界刺激下，超分子结构会发生转变，实现主客体的分离和结合，可用于构建适应性好的生物活性表面和模拟复杂的生物体环境。（5）正交性，可通过结合不同生物分子修饰主体引入不同生物功能，而彼此不影响，可用于构建多功能生物活性表面。（6）可控性，可以控制配体的密度，数量和位置。（7）适用范围广，可适用于形状，大小，性质不同的基材。如曹立敏10等用LBL技术在氨基化基材上沉积含客体基团的多层聚电解质薄膜，然后引入不同生物分子修饰的-环糊精，从而引入不同生物功能。他们

30、通过引入生物素/甘露糖修饰-环糊精，实现了生物识别功能，通过引入赖氨酸修饰-环糊精，实现抗凝血功能，通过引入季铵盐修饰-环糊精，实现了抗菌功能（图1-4）。他们发现通过调节LBL膜厚度，能控制-CD的结合量，调节-CD/CD-X的比例，能控制CD-X的密度，通过同时引入不同生物分子修饰的-CD，可制备多功能生物活性表面。图1-4（a）在0.1 mg/ml的相应溶液中浸泡2 h后，不同样品表面Avidin-FITC,BSA-FITC, Con A-FITC的吸附量。（b）测量表面对405 nm电磁波吸收随时间的变化来表征不同样品在血浆中表面血栓的形成情况。（c）左图：在37 的E.coli悬浮液

31、中浸泡2 h，用活/死细胞染色剂染色后，不同样品表面荧光强度图。绿色代表活细胞，黄色或红色代表死细胞。右图：不同样品的细胞致死率（d）表面结合了CD-Q和CD-L后，活/死细胞染色实验和血栓溶解实验的结果。1.4微流控生物芯片1.4.1微流控技术微流控技术（microchip）是利用基于微电加工技术（Micro Electro Mechanical System，MEMS）为基础的微全分析系统（Iniaturized Total Analysis System，uTAS）的概念，把生物，化学，医学分析过程的物质制备，反应，分离，检测等操作单元集成到一块几厘米的芯片上，自动完成全部实验和分析过程

32、的技术，是当前uTAS最活跃和前沿的领域，其应用大多与生物相关11。在微流控芯片中，可控流体通过微通道形成网络得以贯穿整个系统。微流控生物芯片包括基因芯片（Gene chip）、蛋白质芯片（protein chip）、细胞芯片（cell chip）和芯片实验室（Lab-On-a-Chip，LOC），它们具有高灵敏度、分析时间短、同时分析项目多，样品或试剂用量少，便携式，灵活性等优点。1.4.2微流控生物芯片的应用1.4.2.1即时检测（POTC）即时检测对疾病的初步筛选和家庭健康评估方面具有重要应用。即时检测技术按其原理可分为三类：（1）依靠传统的分析方法，把试纸浸泡在分析试剂中，干燥后固定在

33、基板上成为诊断试剂条；（2）分析仪器微型化，使其成为便携式设备；（3）利用生物感应技术，制成生物检测器。即时检测技术具有样品消耗量小，分析速度快，准确性高，重现性好等优点，但其灵敏度和复杂的操作却限制了它的应用。比较成熟的应用有血糖仪，原理是血液中的葡萄糖与试纸上固定的试剂发生显色反应，然后用眼定性观察或仪器半定量测量。心肌标志物测读仪，原理是通过纸层析技术分离分析物，然后通过固定在层析面上的抗体捕获目标分析物12。1.4.2.2细胞检测微流控细胞芯片集成了细胞培养，分选，溶解和检测功能，其技术主要包括细胞操纵，细胞培养和组分分析几个部分。微流控细胞芯片具有如下优点：（1）孔道大小与细胞相近，

34、可实现单细胞乃至细胞器的分析；（2）微尺寸的孔道，多维网络结构，相对封闭环境可最大限度的模拟体内环境；（3）把细胞分析的众多模块集成到微小的芯片上，有利于连续分析。如Sunitha Nagrath等13通过微流控细胞芯片成功从血液中分离出浓度极低的循环肿瘤细胞（CTC）。这种方法具有高选择性和特异性，无需预处理，分离得到的CTC产量大，纯度高的特点，有望用于早期癌症检测和治疗效果评估（图1-5）。图片1-5通过微流控芯片从全血中分离CTCs：（a）CTC分离所用的设备，样品通过搅拌器混合并由空气泵压入芯片中；（b）在硅表面刻有微柱制成得CTC芯片；（c）全血流经微流控芯片的示意图；（d）从血液

35、中捕获的NCI-H1650癌细胞的扫描显微镜图像，插图是癌细胞的放大图。1.5课题的提出1.5.1研究目的及意义生物活性表面在医学检测和生物医用材料方面有重大应用如植入体材料，生物传感器，生物检测器等。但生物活性表面处于复杂的生物介质中时，往往会发生非特异性吸附（污染），这会损害表面的性能，因此要求表面具有抗污性能。传统的方法是在抗污聚合物层上共价修饰上生物活性分子，这具有不可逆的缺陷，且会损害表面的抗污性能和生物活性。而主客体修饰作为一种非共价修饰，具有可逆，作用条件温和的特点，且能很好的通过调节主体上修饰的配体种类，密度和数量来控制表面性能。如今微流控生物芯片因其样品和试剂消耗少，分析速度

36、快，准确性高得到广泛的关注。将两种技术结合起来制成可再生微流控生物芯片在生物检测方面有重大应用。1.5.2研究内容及实验方案本实验中，我们采用共混固化的方法制备了表面有烷基溴的PDMS薄膜。然后，在PDMS基底上通过可见光表面接枝聚合的方法使OEG和OEG-Ada无规共聚，形成了包含客体的抗污聚合物薄膜，通过FITR,WCA表征表面改性前后性质的变化证明了接枝成功。我们还探究了Ada含量对-CD结合量的影响，通过调节Ada的投料比来获得具有不同Ada含量的聚合物薄膜，并结合上CD-Rhodamine，通过荧光密度来比较-CD的结合量。最后，把这种修饰方法用于微流控芯片中，进一步结合了CD(bi

37、otin)7，并成功实现了与亲和配体Avidin的识别。孔道表面明显的荧光证明了蛋白黏附成功，并通过SDS实现了对孔道的再生应用。通过三次的循环实验，实验结果保持稳定，证明我们的孔道在再生过程中没有影响其性能。第二章 主客体修饰构建微流控生物芯片2.1引言固定生物活性分子而获得或增强特定生物功能的生物活性表面在植入体材料和微生物检测器方面有重大应用。如占文俊等14构建一种光控细菌的捕获/释放的表面，这可用于微生物分离和检测方面。他们把azo-OEG-SH/OEG-SH混合自组装到金表面，azo赋予表面光控性和-CD的结合位点，OEG引入抗污性能，巯基则是锚定基团，混合自组装保证了具有足够的自由

38、度。在结合了CD-Mannose后表面能特异性捕获Con A和带Fim H的细菌，并在365 nm紫外光照射下通过azo的光致异构实现细菌的释放，并且与Ada协同作用时释放率更高。由于生物活性表面与复杂的生物介质相接触，往往会产生非特异性吸附（污染），这会损害表面性能。因此，生物活性表面需要有抗污能力，这要求在抗污聚合物层上引入生物活性分子。传统的共价修饰的方法虽然稳定性好，但共价修饰不可逆且会影响表面抗污性能和降低生物活性分子的活性。而非共价修饰中的主客体后修饰具有很好的可逆性，可控性和条件温和的优点。特别是-环糊精和金刚烷这一对主客体，有着合适的结合常数。且-环糊精的小环上有丰富的羟基，这

39、不仅能很好调控配体的种类，数目和位置，还会产生多价态效应，从而提高表面性能。如今，微流体技术因其样品或试剂消耗量少，分析速度快，准确性高而获得广泛关注。把主客体后修饰用于构建微流控生物芯片，赋予芯片再生性和可调性，将极大推动生物传感器的发展。如Hao Nan等15制备了一种光控蛋白吸附/释放微流控芯片。他们首先通过简单共混制备了GO/PDMS基板，再在表面接枝上温敏性分子，在NIR照射下，GO粒子吸收光能转变为热能，温敏性分子在疏水/亲水之间转变，实现蛋白的吸附/释放，这在生物传感器和生物分离方面有重大应用。本实验中，我们首先通过简单共混的方法把带双键端基的烷基溴固定在PDMS网络上，利用催化

40、剂Mn2(CO)10 在可见光辐照裂解生成Mn(CO)5，该自由基夺取I-PDMS表面溴原子形成表面活性自由基 R，进而引发一定比例的OEGMA和OEG-Ada单体聚合形成含客体基团表面接枝层,其中OEGMA提高了表面的抗污性能，而Ada提供了CD衍生物的结合位点。考虑到Ada位阻的影响，我们控制投料比获得Ada含量不同的聚合物层，并结合上CD-Rhodamine，通过荧光密度比较找出Ada的最佳含量。之后我们把这种修饰方法用于微流控芯片，通过主客体相互作用结合上CD（biotin）7，亲合吸附上Avidin-FITC来检测蛋白吸附能力，并用SDS洗脱来检测表面再生能力。2.2实验部分2.2.

41、1材料与试剂实验所用到的主要化学样品，试剂见表2-1。实验中用到的溶剂购买于国药集团化学试剂公司，使用前按照标准方法进行纯化处理。实验中用水由Millipore纯净系统进行纯化（电阻率18.2 M·cm），用到的氮气是高纯级别（99.999%）。生物素七取代 -环糊精（-CD- (biotin)7），简称 CD(biotin)7，OEGMA-Ada，根据文献报道方法合成,结构式如图2-1所示。磷酸盐缓冲液（PBS，pH =7.4）按文献报道方法配制。表2-1 主要化学试剂基本信息试剂名称规格生产厂家寡乙二醇丙烯酸酯（OEGMA）98%美国 Sigma-Aldrich公司十二烷基硫酸钠

42、（SDS）95%美国 Sigma-Aldrich公司Avidin-FITC2-4FITC美国 Sigma-Aldrich公司无水甲醇A.R.美国 Sigma-Aldrich公司十羰基二锰（Mn2(CO)10）98%美国 Sigma-Aldrich公司十二水磷酸氢二钠（Na2HPO4.12H2O）A.R.国药化试二水磷酸二氢钠（NaH2PO4.2H2O）A.R.国药化试氯化钠（NaCl）A.R.国药化试Sylgard184双组分10:1美国道康宁公司a寡乙二醇丙烯酸酯（OEGMA）通过Initiator Remover（Sigma公司）除去阻聚剂。 图2-1CD-(biotin)7，OEGMA-

43、Ada结构式。2.2.2实验仪器实验中所用到相关仪器见表2-2。表2-2主要实验仪器仪器名称型号生产厂家电子分析天平AL204美国Mettler Toledo公司超纯水仪Milli-Q Biosel美国Millipore公司微量移液器P200 P1000美国Gilson公司数显鼓风干燥器SB-3200D上海博讯实业有限公司恒温培养箱DNP-9052BS-111上海新苗医疗器械制造公司超声波清洗器KQ-100E昆山超声仪器有限公司倒置荧光显微镜IX-71日本Olympus公司傅里叶红外光谱仪Nicolet 6700美国Thermo Fisher Scientific公司全自动接触角仪SL 200

44、C美国KINO公司超低温冰箱MDF-U32V日本Sanyo公司2.2.3实验方法2.2.3.1OEG-Ada的合成称取寡乙二醇丙烯酸酯（OEGMA,3.6 g,0.01 mol），三乙胺（TEA,1.01 g,0.01mol）和无水二氯甲烷（DCM，40 ml）于100 ml的烧瓶中，用冰水浴冷却至0 。将1-金刚烷酰氯溶解于10 ml二氯甲烷中，置于滴液漏斗中，在30分钟内逐滴滴加到混合液中。滴加完后，反应液在室温下搅拌反应过夜。反应完毕后，将混合液转移到分液漏斗中，依次用5%的柠檬酸（50 ml），饱和NaHCO3溶液清洗，向分离后得到的有机层中加无水MgSO4干燥。干燥结束后，溶液过滤除

45、去无水MgSO4，旋蒸得到浓缩液，通过硅胶柱纯化，洗脱液为二氯甲烷/甲醇（9:1），得到黄色油状的OEGMA-Ada。2.2.3.2表面带有光引发剂的 PDMS 膜的制备（I-PDMS）称取组分A（PDMS预聚物）、组分B （交联剂）以及组分C（光引发剂，10-十一烯-2溴异丁酸酯）于一次性塑料杯中（初始质量比为10:1:0.13）16。用玻璃棒搅拌使其充分混合，用真空干燥箱抽气排气，除尽气泡。最后，倒入直径为10 cm的培养皿中，在60 成膜箱中固化6 h成膜。2.2.3.3I-PDMS圆片表面可见光引发接枝OEGMA和OEGMA-Ada 用打孔器制作6到8个直径为6 mm 的I-PDMS圆

46、片。将I-PDMS圆片分别用去离子水和无水乙醇各清洗3 次，每次5 min，氮气吹干备用。将寡乙二醇丙烯酸酯（OEGMA，628 mg 1.8 mmol）、乙二醇丙烯酸酯-金刚烷单体（OEGMA-Ada，95.6 mg 0.2 mmol）（初始摩尔比为9:1）、2 mL无水甲醇和I-PDMS 圆片置于10 mL圆底烧瓶中。在避光条件下，加入少量十羰基二锰 （Mn2(CO)10）后鼓氮气30 min除尽氧气。然后在室温下可见光照射引发表面接枝聚合15 min，制得OA-PDMS圆片。最后，分别用去离子水和无水乙醇各清洗3 次，每次5 min，氮气吹干备用。2.2.3.4OA-PDMS表面性质表征

47、用FTIR测定圆片表面接枝改性前后官能团的变化。测试前将PDMS,I-PDMS,OA-PDMS分别用去离子水和无水乙醇各清洗3 次，每次5 min，氮气吹干备用。测试时，采用衰减全反射检测器，选择反射模式，设置分辨率为 4 cm-1 ，每一样品扫描64次。接着用静态水接触角仪测定PDMS,I-PDMS,OA-PDMS圆片的静态水接触角变化。测试时，将样品置于载物台上，室温下用微量注射器从材料上方将2 uL去离子水滴在样品表面， 每种样品平行测试6次以计算平均值和标准平均偏差。 2.2.3.5Ada含量不同的OA-PDMS圆片的制备在总摩尔数为2 mmol保持不变的条件下，称取摩尔比不同的OEG

48、和OEG-Ada(质量比分别为576 mg:191.2 mg（摩尔比8:2）、648 mg:95.6 mg（摩尔比9:1）、684 mg:47.8 mg（摩尔比95:5）、712.8 mg:9.56mg（摩尔比99:1）)于10 ml的圆底烧瓶中，分别加入2 ml的无水甲醇溶解，再加入4片I-PDMS圆片。在避光条件下，加入催化剂Mn2(CO)10,通氮气30 min除O2。在室温下可见光照射15min,制得Ada含量不同的OA-PDMS圆片（20 %OA-PDMS ,10 %OA-PDMS,5 %OA-PDMS,1%OA-PDMS）。取出圆片，分别用去离子水和无水乙醇各清洗3 次，每次5 m

49、in，氮气吹干备用。2.2.3.6CD-Rhodamine结合Ada含量不同的OA-PDMS圆片将上述制得的不同Ada含量的OA-PDMS圆片每种比例各取3个平行样，置于96孔板中，在避光条件下，分别加入1 ml的浓度为1 mg/ml的CD-Rhodamine溶液，置于室温下6h，使CD-Rhodamine结合到OA-PDMS圆片上。将圆片转移至48孔板中，使用超纯水振荡清洗5 min，重复清洗3次，氮气吹干备用。用荧光显微镜在圆片上任意区域拍10张照片，再用Image-Pro Plus 6.0 软件处理荧光照片。2.2.3.7OA-PDMS微流道的制备采用与制备OA-PDMS圆片相同的方法制

50、备OA-PDMS下基底。将带有直线型微孔道PDMS上基底和OA-PDMS下基底用大量去离子水和无水乙醇清洗，用氮气吹干。微流芯片封接时首先将两种基底放入等离子体清洗仪中，处理1 min，再将带有孔道的上基底与修饰后下基底封接，放入60 的烘箱中加热1 h使封接完全。2.2.3.8生物素七取代的-环糊精包合的OA-PDMS微流道制备用注射器将1 mg/ml CD（biotin）7溶液注射进微流孔道中，在室温下结合6 h，使CD（biotin）7结合到表面上。吸出CD（biotin）7水溶液，用去离子水反复清洗，除去没有结合的CD（biotin）7后备用。2.2.3.9Avidin-FITC吸附测

51、试在避光条件下，把Avidin-FITC溶解在PBS缓冲液中，配成浓度为0.1 mg/mL溶液。用注射器将该溶液注入上述微流道中，在 37 的恒温培养箱中孵育2h。 然后使用PBS缓冲溶液反复清洗，除去物理吸附的Avidin-FITC。用荧光显微镜在微流道上任意区域拍10张照片，再用Image-Pro Plus 6.0 软件处理荧光照片。2.2.3.10表面再生和再应用性能测试OEGMA-Ada/CD(biotin)7微流道吸附了 Avidin-FITC 之后，在避光条件下，用2 % SDS 反复清洗除去表面结合的CD(biotin)7，再用PBS和去离子水清洗除去SDS溶液。重复2.2.3.

52、8得到再生后的CD(biotin)7孔道。重复2.2.3.9对再生后的孔道蛋白吸附能力进行测试，实验结果使用荧光显微镜进行评估。重复进行三次实验以测试再生性能的稳定性。2.3结果与分析2.3.1OEGMA-Ada的合成与表征我们合成了OEG-Ada单体，其中OEG有很好的抗污性能，Ada则提供了CD衍生物的结合位点。核磁共振氢谱的原理是，在强磁场中原子核的自旋能级发生裂分，从而能吸收相应频率的电磁波实现能级跃迁。而由于核外电子屏蔽效应的影响，会产生与化学环境相应的化学位移。通过对化学位移的分析可获得被测物的分子结构。核磁共振氢谱如图：1H NMR (400 MHz, CDCl3) 6.05-6

53、.14 (m,1H), 5.49-5.59 (m, 1H), 4.13-4.17 (m, 4H), 3.32-3.77(m, 32H), 2.05-2.25(m, 7H), 1.85-1.98 (m, 18H) ,1.58-1.78(m, 9H)。分析各处积分比例表明，OEG-Ada的成功合成。（图2-3）图2-3 OEG-Ada的核磁结果分析。2.3.2OA-PDMS圆片的表征由于OEGMA上有寡聚乙二醇支链，会导致表面的亲水性提高。为了证明I-PDMS表面接枝上OEGMA-Ada聚合物薄膜。我们将PDMS，I-PDMS, OA-PDMS小圆片，分别用去离子水和无水乙醇各清洗3 次，每次5

54、min，氮气吹干，进行静态水接触角的测试（图2-4）。结果显示，PDMS的静态水接触角为111.5°±3.4°，I-PDMS的水接触角为108.3°±2.8°，而OA-PDMS的水接触角大幅度下降为73.9°±6.0°。结果表明，I-PDMS润湿性变化不大，而OA-PDMS的亲水性增强，说明是寡聚乙二醇支链引起表面亲疏水性变化，进而表明聚合物成功修饰到表面。图2-4 PDMS、I-PDMS和OA-PDMS静态水接触角测试结果对比。由于有机物中官能团能吸收红外光而引起振动和转动能级的跃迁，通过分析红外吸收光

55、谱能鉴别有机物中官能团。表面成功修饰上聚合物，会引入新的官能团，因此为了证明聚合物成功修饰到表面，我们对PDMS,I-PDMS,和OA-PDMS表面进行红外吸收光谱分析（图2-5）。结果显示，OA-PDMS在1700 cm-1 附近出现隶属于酰胺基团的C=O 伸缩振动吸收峰，证明含有OEGMA的聚合物刷成功接枝在PDMS表面。图2-5 PDMS、I-PDMS和OA-PDMS的红外吸收光谱。2.3.3不同Ada含量的OA-PDMS圆片上CD-Rhodamine结合量的表征为了探究Ada含量对-CD结合量的影响，我们通过控制投料比获得Ada含量不同的OA-PDMS圆片，进一步结合上CD-Rhoda

56、mine，用荧光显微镜拍照并计算荧光密度（图2-6）。实验结果如图：Ada含量不同的OA-PDMS圆片表面荧光强度不同，且10%OA-PDMS圆片表面荧光强度最大。证明Ada含量对-CD的结合量有影响，且在10 %时结合量最大，所以选择Ada摩尔百分比为10 %进行后续实验。这可能是由于在Ada含量较低时，Ada含量提高，-CD结合位点增多，结合量增大，而在Ada含量较高时，Ada排列紧密，产生较大位阻，阻碍了-CD的结合。图2-6 （a）相应的荧光密度。（b）CD-Rhodamine在Ada含量分别为1%、5%、10%、20%的OA-PDMS表面结合后的荧光照片。2.3.4 Avidin-F

57、ITC吸附和再生性能表征生物素（biotin）和亲和素（Avidin）之间的结合力很强，一旦结合就很难分开。然而，用SDS解离CD(biotin)7和Ada之间的结合就能洗脱表面吸附的亲和素，表面可重新结合修饰有不同生物活性分子的-CD，从而具有再生性能。为了证明修饰完成后的微流道对特异性蛋白质的吸附能力，我们在OEGMA-Ada/CD(biotin)7微流道吸附了Avidin-FITC 之后，用荧光显微镜拍照（图2-7）。结果显示，微流道表面出现强烈的绿色荧光，表明对Avidin-FITC有很强的吸附能力。为了证明表面的再生能力，我们在避光条件下，对大量吸附了Avidin-FITC的微流道用SDS冲洗多次，在荧光显微镜下拍照。结果显示，表面没有出现绿色荧光，这表明吸附Avidin-FITC被洗掉。之后，我们把再生的表面重新结合上CD(biotin)7，进而吸附上Avidin-FITC，再用2%SDS洗脱，重复该循环3次，结果显示，循环过程荧光强度变化不大，证明表面有很好的再应用性能。图2-7 OEGMA-Ada