第2章 细胞培养技术及应用-2

1、六、水产经济动物的细胞培养进展六、水产经济动物的细胞培养进展脊椎动物脊椎动物无脊椎动物无脊椎动物鱼类鱼类多孔动物门多孔动物门棘皮动物门棘皮动物门腔肠动物门腔肠动物门节肢动物门节肢动物门软体动物门软体动物门1、鱼类、鱼类 鱼类细胞原代培养所取材的组织鱼类细胞原代培养所取材的组织器官来源很多，包括性腺、肾脏、肝脏、器官来源很多，包括性腺、肾脏、肝脏、脾脏、心脏、鳍条、鳔、鳃上皮、皮肤、脾脏、心脏、鳍条、鳔、鳃上皮、皮肤、吻端、内分泌组织、血液、肌肉组织以及吻端、内分泌组织、血液、肌肉组织以及骨骼细胞。鱼类胚胎和幼鱼的各种组织，骨骼细胞。鱼类胚胎和幼鱼的各种组织，分化程度低，分裂潜能大，病毒携带少，

2、分化程度低，分裂潜能大，病毒携带少，适合作为原代培养的材料。适合作为原代培养的材料。 鱼类细胞平均传代鱼类细胞平均传代100 100 代仍可以继代仍可以继续分裂续分裂, , 比起哺乳类比起哺乳类, , 分裂极限要大得多分裂极限要大得多, , 并且每一代细胞的存活期均较长并且每一代细胞的存活期均较长; ;人和哺人和哺乳动物离体培养的正常二倍体细胞株寿命乳动物离体培养的正常二倍体细胞株寿命一般不超过一般不超过50 50 代。代。 至至2010 2010 年年, ,建立的鱼类细胞系约有建立的鱼类细胞系约有275275类，其中大多数来自淡水鱼或溯河产卵的海类，其中大多数来自淡水鱼或溯河产卵的海洋鱼类，

3、约洋鱼类，约175175株，分别来源于株，分别来源于7171个科的个科的89 89 种鱼类的不同组织；而海水鱼类及咸水鱼类种鱼类的不同组织；而海水鱼类及咸水鱼类的细胞系约的细胞系约100 100 株，分别来源于株，分别来源于2323个科的个科的3535种海水鱼类的不同组织。种海水鱼类的不同组织。 1981年我国建立了最早的鱼类细胞系年我国建立了最早的鱼类细胞系草鱼吻端组织细胞系草鱼吻端组织细胞系，至今已经建立了，至今已经建立了70余种余种细胞株（系），来自细胞株（系），来自40多种鱼类。来源的组织多种鱼类。来源的组织有吻端、肾脏、卵巢、尾鳍、膘、性腺、肝脏、有吻端、肾脏、卵巢、尾鳍、膘、性腺、

4、肝脏、胚胎、囊胚、原肠胚、鳍条等。以淡水鱼细胞胚胎、囊胚、原肠胚、鳍条等。以淡水鱼细胞培养为主。海水鱼细胞的培养也越来越受到重培养为主。海水鱼细胞的培养也越来越受到重视，如视，如牙鲆牙鲆鳃细胞系、鳃细胞系、鲈鱼鲈鱼脾和心细胞系、脾和心细胞系、真真鲷鲷鳍细胞系、花鲈胚胎干细胞系、漠斑牙鲆胚鳍细胞系、花鲈胚胎干细胞系、漠斑牙鲆胚胎干细胞系、大菱鲆鳍细胞系、点带石斑鱼脾胎干细胞系、大菱鲆鳍细胞系、点带石斑鱼脾脏细胞系脏细胞系等。等。 1976年建立了世界上第一个鱼类细胞系，年建立了世界上第一个鱼类细胞系，虹鳟鱼生殖腺细胞系：虹鳟鱼生殖腺细胞系：RTG-2。 鱼类细胞系的应用越来越广泛鱼类细胞系的应用

5、越来越广泛, 已由单纯的病毒培养分离、免疫学、已由单纯的病毒培养分离、免疫学、毒理学、致癌作用、遗传学研究逐毒理学、致癌作用、遗传学研究逐步向近些年研究很集中的基因组学、步向近些年研究很集中的基因组学、DNA 的复制与修饰、表观遗传学、的复制与修饰、表观遗传学、基因敲除、基因敲除、RNAi 以及最新的以及最新的iPS等等各个方面发展。各个方面发展。2 2、节肢动物、节肢动物 已经对龙虾、中国对虾、日本对虾、草虾、已经对龙虾、中国对虾、日本对虾、草虾、斑节对虾、罗氏沼虾等多种虾类进行了细胞斑节对虾、罗氏沼虾等多种虾类进行了细胞培养研究。但由于其生理、生化特点以及生培养研究。但由于其生理、生化特点

6、以及生活环境均与陆生动物有很大差异，加之其细活环境均与陆生动物有很大差异，加之其细胞的营养需要和代谢机理研究滞后，因而，胞的营养需要和代谢机理研究滞后，因而，节肢动物节肢动物细胞系的建立细胞系的建立问题至今仍是全世界问题至今仍是全世界所面临的挑战性课题。所面临的挑战性课题。斑节对虾淋巴器官的斑节对虾淋巴器官的细胞在细胞在L-15 培养基中传了培养基中传了90代，第代，第90代后细代后细胞不能继续传代生长，只建立了有限细胞系。胞不能继续传代生长，只建立了有限细胞系。 心脏、卵巢、鳃、胸腺、内脏、肌肉、心脏、卵巢、鳃、胸腺、内脏、肌肉、淋巴、肝胰脏等组织以及胚胎都被尝试培养淋巴、肝胰脏等组织以及胚

7、胎都被尝试培养过。最易培养的组织依次是心脏、淋巴、卵过。最易培养的组织依次是心脏、淋巴、卵巢、脑神经节、眼球。巢、脑神经节、眼球。 待培养组织的消毒灭菌非常困难。节肢待培养组织的消毒灭菌非常困难。节肢动物的组织器官大多暴露于外界动物的组织器官大多暴露于外界, ,带有较多的带有较多的微生物和寄生虫微生物和寄生虫, ,即使是健康个体体内也存在即使是健康个体体内也存在一些微生物一些微生物, ,使得培养易受污染而失败。使得培养易受污染而失败。虽然虾虽然虾的胚胎和幼体应是最易培养的材料的胚胎和幼体应是最易培养的材料, ,但是其胚胎和幼但是其胚胎和幼体是体外发育体是体外发育, ,受微生物污染严重受微生物污

8、染严重, ,目前还没有理想的目前还没有理想的消毒方法。消毒方法。鲎的鳃组织暴露在海水中，附有一层粘液，鲎的鳃组织暴露在海水中，附有一层粘液，冲洗液很难除菌，鲎的血液中生活有许多的原生动物，冲洗液很难除菌，鲎的血液中生活有许多的原生动物，在培养鲎血细胞时，经常出现原生动物污染的现象。在培养鲎血细胞时，经常出现原生动物污染的现象。虾类细胞培养的应用虾类细胞培养的应用病毒研究：病毒研究：杆状病毒杆状病毒(MBV)、黄头病毒、黄头病毒(YHV）、）、白斑综合症病毒白斑综合症病毒(WSSV)、皮下及造血、皮下及造血组织坏死病毒组织坏死病毒(IHHNV）、虾弹状病毒）、虾弹状病毒奇怪的现象：奇怪的现象：

9、虾蟹类在春季、秋季细胞培养较难，虾蟹类在春季、秋季细胞培养较难，冬季几乎不能成功。这可能与其体内冬季几乎不能成功。这可能与其体内的激素分泌和细胞的基因调控有关。的激素分泌和细胞的基因调控有关。 软体动物的数量仅次于节肢动物软体动物的数量仅次于节肢动物, , 为动物界中第二大类群为动物界中第二大类群, , 包括各种包括各种螺类、螺类、双壳类、乌贼和章鱼双壳类、乌贼和章鱼等。软体动物是细胞等。软体动物是细胞培养研究开展得最多的一类海洋无脊椎动培养研究开展得最多的一类海洋无脊椎动物。物。3 3、软体动物门、软体动物门 软体动物细胞培养的对象主要是一软体动物细胞培养的对象主要是一些养殖的些养殖的双壳类

10、双壳类和和腹足类腹足类, , 包括贻贝、珍包括贻贝、珍珠贝、牡蛎、蛤蜊、螺和鲍等。所培养的珠贝、牡蛎、蛤蜊、螺和鲍等。所培养的组织细胞主要来源于胚胎、鳃、外套膜、组织细胞主要来源于胚胎、鳃、外套膜、神经细胞、血细胞、消化腺和心肌等。神经细胞、血细胞、消化腺和心肌等。 19 世纪世纪70 年代年代, 软体动物细胞培养就已取得软体动物细胞培养就已取得了一些进展。在珍珠牡蛎外套膜组织培养中了一些进展。在珍珠牡蛎外套膜组织培养中, 成成功观察到了体外培养的外套膜细胞能够分泌有机功观察到了体外培养的外套膜细胞能够分泌有机物和进行有丝分裂的现象。但随后的珍珠牡蛎的物和进行有丝分裂的现象。但随后的珍珠牡蛎的

11、外套膜组织培养却一直没有很大的进展。外套膜组织培养却一直没有很大的进展。 1976 年年, 建立起了第一个也是迄今为止唯一建立起了第一个也是迄今为止唯一一个软体动物细胞系一个软体动物细胞系:淡水蜗牛担轮幼虫胚胎细淡水蜗牛担轮幼虫胚胎细胞系胞系BGE 。至今没有解决海洋软体动物细胞的。至今没有解决海洋软体动物细胞的体外长期存活和成功传代建系的问题体外长期存活和成功传代建系的问题,即使是培即使是培养贝类的肿瘤组织也不例外。近年来养贝类的肿瘤组织也不例外。近年来, 海洋软体海洋软体动物原代细胞培养物的应用研究开始增多。利用动物原代细胞培养物的应用研究开始增多。利用巨牡蛎的血细胞凝集实验来检测外源污染

12、物的毒巨牡蛎的血细胞凝集实验来检测外源污染物的毒性效应。性效应。贝类细胞培养贝类细胞培养：无脊椎动物缺少获得性免疫系统，：无脊椎动物缺少获得性免疫系统，血液是重要的免疫器官。细胞培养作为血液是重要的免疫器官。细胞培养作为良好的体外实验模型非常适用于良好的体外实验模型非常适用于血细胞血细胞对外毒物的反应的研究对外毒物的反应的研究：外套膜细胞培养。主要有：马氏珠：外套膜细胞培养。主要有：马氏珠母贝、栉孔扇贝、鲍、文蛤、大珠母贝母贝、栉孔扇贝、鲍、文蛤、大珠母贝：鳃细胞的培养。：鳃细胞的培养。 利用原代培养的栉孔扇贝血细胞探究利用原代培养的栉孔扇贝血细胞探究了血细胞在了血细胞在细菌脂多糖细菌脂多糖的

13、刺激下免疫相关的刺激下免疫相关基因基因CfToll-1 表达量的变化情况；研究苯表达量的变化情况；研究苯并芘对栉孔扇贝血细胞的影响。并芘对栉孔扇贝血细胞的影响。利用多种病原相关分子模式刺激培养的利用多种病原相关分子模式刺激培养的长牡蛎原代血细胞来研究相关基因表达随长牡蛎原代血细胞来研究相关基因表达随时间的变化情况。时间的变化情况。利用僧帽牡蛎的鳃组织进行了培养，并利用僧帽牡蛎的鳃组织进行了培养，并在此基础上研究了毒性较大的氯化三丁基在此基础上研究了毒性较大的氯化三丁基锡对牡蛎鳃组织细胞的细胞形态以及存活锡对牡蛎鳃组织细胞的细胞形态以及存活率的影响。率的影响。贝类细胞培养面临的主要困难贝类细胞培

14、养面临的主要困难（2）在添加促生长因子方面，一直没能寻得一种或是几种混合的生长因子来促进贝类细胞的生长繁殖。不能单纯的套用哺乳动物细胞培养模式，必须要充分的认识海洋贝类动物的不同，深入研究贝类细胞的营养代谢以及细胞生理等，以便研发海洋贝类细胞培养所适用的培养基；（3）贝类开放的生活环境，器官组织携带大量病菌。（1）在体外使贝类细胞无限增殖仍然是全世界所面临的难题。目前对于海洋无脊椎动物特别是贝类细胞增殖和调控的知识知之甚少； 由于海绵特殊的细胞结构和生理特点由于海绵特殊的细胞结构和生理特点, 使得海绵细胞培养面临很大困难使得海绵细胞培养面临很大困难, 进展缓进展缓慢慢, 仍停留在原代培养水平。

15、主要有以下仍停留在原代培养水平。主要有以下两个原因两个原因:(1)海绵动物多为海绵动物多为合胞体合胞体，即整，即整个生物体是由一个巨大的内有横隔片的个生物体是由一个巨大的内有横隔片的多核细胞构成，通过胞内隔片上的孔道多核细胞构成，通过胞内隔片上的孔道来进行细胞内的物质交换。来进行细胞内的物质交换。分散培养的分散培养的细胞在体外培养中很难存活和分裂。细胞在体外培养中很难存活和分裂。体体外培养的海绵细胞相互接触后外培养的海绵细胞相互接触后, 会彼此融会彼此融合合, 形成一个大的形成一个大的多核体多核体, 结构与体内有结构与体内有着很大的不同；着很大的不同；2) 海绵动物体内存在着海绵动物体内存在着

16、多种内共生的微生物多种内共生的微生物, 难以实现海绵细胞难以实现海绵细胞的无菌培养。如果不使用抗生素的话的无菌培养。如果不使用抗生素的话, 培培养又只能维持养又只能维持13天。天。4 4、多孔动物（海绵动物）、多孔动物（海绵动物） 细胞分散技术对存活细胞的数量、组织培细胞分散技术对存活细胞的数量、组织培养的好坏和培养时间的长短都有很大影响。养的好坏和培养时间的长短都有很大影响。体体外培养腔肠动物细胞的存活、贴壁和迁移对培外培养腔肠动物细胞的存活、贴壁和迁移对培养基质有着很严格的要求。养基质有着很严格的要求。在培养时在培养时, , 多数腔多数腔肠动物细胞都只有与细胞外基质相接触时才能肠动物细胞都

17、只有与细胞外基质相接触时才能存活存活, , 而且它们只有附着于由中胶层残片构成而且它们只有附着于由中胶层残片构成的基质上的基质上, , 才能很好地贴壁、铺展和迁移。才能很好地贴壁、铺展和迁移。 腔肠动物门包括珊瑚、海葵等腔肠动物门包括珊瑚、海葵等, , 是是二胚层二胚层多细胞后生动物多细胞后生动物, , 有了组织的分化有了组织的分化, , 但结构简但结构简单单, , 体壁仅由内、外胚层两层细胞以及中间无体壁仅由内、外胚层两层细胞以及中间无细胞结构的细胞结构的中胶层中胶层构成构成, , 细胞类型少。细胞类型少。5 5、腔肠动物、腔肠动物 细胞分散技术对存活细胞的数量、组织培细胞分散技术对存活细胞

18、的数量、组织培养的好坏和培养时间的长短都有很大影响。养的好坏和培养时间的长短都有很大影响。体体外培养腔肠动物细胞的存活、贴壁和迁移对培外培养腔肠动物细胞的存活、贴壁和迁移对培养基质有着很严格的要求。养基质有着很严格的要求。在培养时在培养时, , 多数腔多数腔肠动物细胞都只有与细胞外基质相接触时才能肠动物细胞都只有与细胞外基质相接触时才能存活存活, , 而且它们只有附着于由中胶层残片构成而且它们只有附着于由中胶层残片构成的基质上的基质上, , 才能很好地贴壁、铺展和迁移。才能很好地贴壁、铺展和迁移。 腔肠动物门包括珊瑚、海葵等腔肠动物门包括珊瑚、海葵等, , 是是二胚层二胚层多细胞后生动物多细胞

19、后生动物, , 有了组织的分化有了组织的分化, , 但结构简但结构简单单, , 体壁仅由内、外胚层两层细胞以及中间无体壁仅由内、外胚层两层细胞以及中间无细胞结构的细胞结构的中胶层中胶层构成构成, , 细胞类型少。细胞类型少。5 5、腔肠动物、腔肠动物水螅剖面图水螅剖面图棘皮动物的细胞培养研究棘皮动物的细胞培养研究开展得很少开展得很少, , 虽然棘皮动虽然棘皮动物具有无与伦比的再生能物具有无与伦比的再生能力力, ,如海星臂的再生和海参如海星臂的再生和海参的吐脏再生等。但是其细的吐脏再生等。但是其细胞培养还是难获成功胞培养还是难获成功, , 目目前仍然停留在原代培养的前仍然停留在原代培养的水平上。

20、水平上。6 6、棘皮动物、棘皮动物海参吐脏海参吐脏 最早在最早在1993 年开始了对海参再生组年开始了对海参再生组织的细胞培养织的细胞培养, 至至40天时天时, 观察到再生肠组观察到再生肠组织来源的细胞团发生旋转和再生呼吸树来织来源的细胞团发生旋转和再生呼吸树来源的细胞团出现搏动现象。源的细胞团出现搏动现象。 最近最近, 对海参吐脏后不同再生阶段的对海参吐脏后不同再生阶段的肠组织进行了原代培养肠组织进行了原代培养, 发现只有吐脏后发现只有吐脏后第第1416 天的再生肠组织的原代培养物天的再生肠组织的原代培养物中中, 能观察到活跃的细胞增殖能观察到活跃的细胞增殖, 细胞的数量细胞的数量于培养后第

21、于培养后第20 天加倍天加倍,而在其他再生阶段而在其他再生阶段的肠组织原代培养物中均未观察到细胞分的肠组织原代培养物中均未观察到细胞分裂现象。裂现象。应用应用1 1 用细胞生产珍珠用细胞生产珍珠珍珠的价值珍珠的价值n中国海水珍珠年产量中国海水珍珠年产量2020余吨；淡水珠产量余吨；淡水珠产量15001500余吨余吨, ,占世界的占世界的9595以上以上, , 但但能作为高档工艺珠的不足能作为高档工艺珠的不足1%1%。 与生产工艺有关与生产工艺有关n年需求量约年需求量约10001000吨，出口量达吨，出口量达400400吨吨 观赏收藏观赏收藏药用保健药用保健药用珍珠药用珍珠4%4%91%0.4%

22、牛磺酸牛磺酸维生素维生素药用、化妆品、中成药用、化妆品、中成药的主要原料药的主要原料（六神（六神丸、安宫牛黄丸等），丸、安宫牛黄丸等），安神、平肝息风安神、平肝息风 。天然海水珍珠天然海水珍珠淡水养珠淡水养珠珍珠的主要来源珍珠的主要来源马氏珍珠贝马氏珍珠贝又称合浦珠母贝。贝壳斜四方形又称合浦珠母贝。贝壳斜四方形，背缘略平直，腹缘弧形，背缘略平直，腹缘弧形，前、后缘弓状。前耳突出，近三角形；后耳较粗短。中国前、后缘弓状。前耳突出，近三角形；后耳较粗短。中国分布在广西、广东和台湾海峡南部沿海一带。国际上公认分布在广西、广东和台湾海峡南部沿海一带。国际上公认中国出产的南海珍珠的质量在世界上首屈一指。

23、中国出产的南海珍珠的质量在世界上首屈一指。珍珠的形成机理珍珠的形成机理软体动物和软体动物和腕足动物壳腕足动物壳内的体壁褶。内的体壁褶。珍珠的形成机理珍珠的形成机理珍珠的形成机理珍珠的形成机理外套膜外套膜海水珍珠养殖场海水珍珠养殖场传统的珍珠生产传统的珍珠生产超大型淡水珍珠养殖吊养场超大型淡水珍珠养殖吊养场视频资料视频资料利用细胞培养技术生产珍珠利用细胞培养技术生产珍珠目的：目的：培养直径8mm以上、光泽度好的正圆珍珠实验材料实验材料：（1）选取体质健康、大小均一的1龄三角帆蚌用作细胞培养，3龄的三角帆蚌为插核之用。（2）细胞培养材料：RPMI1640培养基、胎牛血清、0.25胰酶、10000I

24、U双抗(青、链霉素) 、牛磺酸、抗坏血酸、水解乳蛋白、制霉菌素、多聚赖氨酸（1）外套膜上皮细胞培养外套膜上皮细胞培养生产实现的过程生产实现的过程（2）细胞活性与贴壁效果的检测细胞活性与贴壁效果的检测（3）珠核的预处理珠核的预处理台盼蓝染色法显微镜观察法1龄小蚌，切断前后闭壳肌，撕膜法分离出外套膜外表皮，剪碎，胰酶消化洗涤、高压灭菌处理（5）内脏团插核手术（为什么选择？）内脏团插核手术（为什么选择？）（6）垂直吊养垂直吊养（4）共培养共培养严格消毒后，用通道针在内脏团与斧足交界处开口，严格消毒后，用通道针在内脏团与斧足交界处开口，并制造通道，深度为并制造通道，深度为2 cm2 cm，口径为，口径

25、为1 cm1 cm，将处理后，将处理后的珠核移植到育珠蚌体内，吸取的珠核移植到育珠蚌体内，吸取0.5 mL0.5 mL外套膜细胞外套膜细胞悬液，注射到珠核周围。用浸泡在双抗中的一次性悬液，注射到珠核周围。用浸泡在双抗中的一次性棉棒擦拭伤口，按压以促进伤口消炎愈合。棉棒擦拭伤口，按压以促进伤口消炎愈合。珠核放入培养基培养的细胞悬液中，完全淹没珠珠核放入培养基培养的细胞悬液中，完全淹没珠核。核。吊养位置为水面下吊养位置为水面下25cm25cm处，进行常规育珠养殖。处，进行常规育珠养殖。 由于外套膜比较薄，容易插破，不适由于外套膜比较薄，容易插破，不适宜插大核来培育大颗粒的珍珠。相比之宜插大核来培育

26、大颗粒的珍珠。相比之下内脏团分布空间很大，且具有珍珠生下内脏团分布空间很大，且具有珍珠生物矿化所需的生化条件。物矿化所需的生化条件。应用应用2 2 鱼类病毒学鱼类病毒学 用细胞分离、检测鉴别病毒用细胞分离、检测鉴别病毒什么是病毒？什么是病毒？视频资料病毒对水产养殖的危害病毒对水产养殖的危害 迄今已发现的近迄今已发现的近60 种鱼类病毒。其中种鱼类病毒。其中有有9 种病毒对渔业生产有严重的影响种病毒对渔业生产有严重的影响, 它它们是们是: 双双RNA 病毒科的传染性胰坏死病毒病毒科的传染性胰坏死病毒虹彩病毒科的虹彩病毒虹彩病毒科的虹彩病毒棒状病毒科的双链棒状病毒科的双链DNA 棒状病毒棒状病毒呼

27、肠病毒科的草鱼呼肠病毒呼肠病毒科的草鱼呼肠病毒野田病毒科的野田病毒野田病毒科的野田病毒弹状病毒科的鲤鱼春季病毒血症病毒、弹状病毒科的鲤鱼春季病毒血症病毒、病毒性出血性败血症病毒、传染性造血器病毒性出血性败血症病毒、传染性造血器官坏死病毒和白斑狗鱼幼鱼弹状病毒。官坏死病毒和白斑狗鱼幼鱼弹状病毒。传染性胰坏死病毒：传染性胰坏死病毒：1012死亡率可高达死亡率可高达80100%。胰腺坏死，胰腺泡、胰岛及所有的细胞几乎。胰腺坏死，胰腺泡、胰岛及所有的细胞几乎都发生异常，多数细胞坏死，核固缩、核碎裂十分显都发生异常，多数细胞坏死，核固缩、核碎裂十分显著。病鱼游动失调，常作垂直回转游动，不久便沉入著。病鱼

28、游动失调，常作垂直回转游动，不久便沉入水底，伺歇片刻后又重复以上游动，直至死亡。水底，伺歇片刻后又重复以上游动，直至死亡。虹彩病毒：虹彩病毒：死亡率从死亡率从30%(成鱼阶段成鱼阶段)到到100%(幼苗阶幼苗阶段段)不等。感染的硬骨鱼类包括鲈形目、鲽形目、鳕不等。感染的硬骨鱼类包括鲈形目、鲽形目、鳕形目和鲀形目等形目和鲀形目等4目近百种海水、淡水鱼类。目近百种海水、淡水鱼类。出血性败血症病毒：出血性败血症病毒：许多鲑鳟鱼对其敏感。传染性强，许多鲑鳟鱼对其敏感。传染性强，死亡率可达死亡率可达80%。有急性型。有急性型(体黑、眼突出，肌肉、体黑、眼突出，肌肉、脂肪组织、口腔和鳔出血，死亡率高，常见

29、初期脂肪组织、口腔和鳔出血，死亡率高，常见初期)、慢性型慢性型(动作迟缓，贫血，低死亡率，常见中期动作迟缓，贫血，低死亡率，常见中期)和神和神经型经型(运动失调，螺旋状旋转游动，缓慢死亡，流行运动失调，螺旋状旋转游动，缓慢死亡，流行末期末期)3种类型目前无有效治疗方法。种类型目前无有效治疗方法。病毒感染病毒感染环境因素环境因素免疫系统免疫系统虾类病毒：杆状病毒(MBV)、黄头病毒(YHV）、白斑综合症病毒(WSSV)、皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV）、虾弹状病毒。在体外原代培养的斑节对虾类淋巴细胞中进行了斑节对虾杆状病毒(MBV)、白斑综合症病毒(WSSV)和黄头病毒的增殖, 获得成功。用

30、凡纳滨对虾类淋巴原代细胞接种黄头病毒(YHV), 出现了CPE。 致细胞病变效应（cytopathic effect，CPE）：指病毒在宿主细胞内大量增殖，导致细胞病变甚至死亡的现象。具体而言，体外组织细胞培养时，溶细胞病毒在易感细胞内大量复制增殖导致细胞死亡或细胞出现变圆、脱落、聚集等现象，称为致细胞病变效应。致细胞病变效应细胞培养分离病毒 斜带石斑鱼的脑组织细胞系GBC1 和GBC4 并用于病毒敏感性实验, 发现前者对于神经坏死病毒(GNNV)高度敏感, 但对于花鲈虹彩病毒(GSIV)不敏感而后者的结果正好相反。 玳瑁石斑鱼脑、鳃、心脏3个细胞系, 进行了病毒及细胞毒素敏感性的实验, 发现

31、3种细胞系对于不同病毒和毒素的敏感性存在明显的差异。病毒对细胞具有选择性病毒对细胞具有选择性病毒的培养分离病毒的培养分离实例实例-鱼源弹状病毒的分离鱼源弹状病毒的分离 鱼类弹状病毒是一类能使多种鱼出现高致死鱼类弹状病毒是一类能使多种鱼出现高致死率的病毒病原体，其感染宿主谱广、普遍存在、率的病毒病原体，其感染宿主谱广、普遍存在、严重危害各种淡水和海水鱼。迄今报道感染鱼类严重危害各种淡水和海水鱼。迄今报道感染鱼类的弹状病毒已有的弹状病毒已有20 20 多种，包括导致鲤科鱼类大多种，包括导致鲤科鱼类大规模爆发鲤春病毒血症的鲤春病毒血症病毒、引规模爆发鲤春病毒血症的鲤春病毒血症病毒、引起虹鳟、鲑等患出

32、血性疾病的病毒性出血性败血起虹鳟、鲑等患出血性疾病的病毒性出血性败血症病毒、引起鳟鱼和太平洋大马哈鱼为主的急性、症病毒、引起鳟鱼和太平洋大马哈鱼为主的急性、全身性的严重传染病的传染性造血器官坏死病毒、全身性的严重传染病的传染性造血器官坏死病毒、以及牙鲆弹状病毒、乌鳢弹状病毒、鳜鱼弹状病以及牙鲆弹状病毒、乌鳢弹状病毒、鳜鱼弹状病毒、胭脂鱼弹状病毒、石鲽鱼弹状病毒等。毒、胭脂鱼弹状病毒、石鲽鱼弹状病毒等。草鱼肾细胞系草鱼肾细胞系(CIK) 肥头鲤细胞系肥头鲤细胞系(FHM)鲤上皮细胞系鲤上皮细胞系(EPC) 草鱼脑细胞草鱼脑细胞(CIB) 草鱼鳔细胞草鱼鳔细胞(GSB)锦鲤吻端细胞系锦鲤吻端细胞系

33、(KPC) 剑尾鱼胚胎细胞系剑尾鱼胚胎细胞系(SFC) 鳜脑细胞系鳜脑细胞系(SCC)所用细胞系及代号所用细胞系及代号 无菌采取无菌采取病鱼病鱼的鳔、肝、肾、脾，加入的鳔、肝、肾、脾，加入含双抗的灭菌的含双抗的灭菌的PBS 中制成中制成1 1 的匀浆液，的匀浆液，在在20冻融冻融3 次后，组织匀浆液依次经次后，组织匀浆液依次经2000、5000 和和10000r /min，每次离心，每次离心10 min，去沉淀，上清液经滤膜孔径为，去沉淀，上清液经滤膜孔径为0. 22 m 的微孔滤器过滤除菌分别接种密度为的微孔滤器过滤除菌分别接种密度为80%90% 的单层的单层FHM、EPC、CIK、GIB、

34、GSB、KPC、SFC 和和SCC 细胞，室温下吸细胞，室温下吸附附1 h，吸弃病毒液，加入与培养液等量的，吸弃病毒液，加入与培养液等量的维持液维持液( 含含3%FBS 的的M199) ，28恒温培恒温培养，每日观察细胞形态。病毒传代时，将病养，每日观察细胞形态。病毒传代时，将病毒细胞培养物反复冻融毒细胞培养物反复冻融2 3 次。次。如何检测鉴别病毒？如何检测鉴别病毒？直接检测直接检测免疫检测免疫检测分子生物学检测分子生物学检测1、电子显微镜；、电子显微镜；2、病毒包涵体检查、病毒包涵体检查1、酶免疫技术；、酶免疫技术；2、荧光免疫技术、荧光免疫技术3、单克隆抗体技术、单克隆抗体技术1、核酸杂

35、交；、核酸杂交；2、PCR、RT-PCR技术；技术；一、电子显微镜检测技术一、电子显微镜检测技术n研究病毒形态、鉴定研究病毒形态、鉴定n诊断病毒病诊断病毒病 检测不能在体外培养的病毒，检测不能在体外培养的病毒，如轮状病毒、星状病毒、嵌如轮状病毒、星状病毒、嵌杯病毒、杯病毒、HAVHAV等都是用电镜最等都是用电镜最先发现的先发现的能进一步发现能进一步发现新的病毒和病毒病。新的病毒和病毒病。弹状病毒的电子显微镜观察弹状病毒的电子显微镜观察标本的制备标本的制备 浓缩标本方法：浓缩标本方法： 超速离心超速离心 离心的时间和速度取决于病毒颗粒的大离心的时间和速度取决于病毒颗粒的大小和离心机转头的半径，一

36、般是小和离心机转头的半径，一般是30min到到3h沉淀沉淀的样本用灭菌蒸馏水洗后再放到铜网上；的样本用灭菌蒸馏水洗后再放到铜网上； 超过滤法超过滤法 用于分子筛的蛋白质相对分子质量为用于分子筛的蛋白质相对分子质量为10000； 接种细胞接种细胞 接种细胞增殖病毒，然后快速包埋、切接种细胞增殖病毒，然后快速包埋、切片；片； 免疫凝集免疫凝集 如有特异抗血清，且病毒已知，也可用如有特异抗血清，且病毒已知，也可用该法浓缩病毒该法浓缩病毒1、正染法（超薄切片法、病组织）、正染法（超薄切片法、病组织）q将细胞用戊二醛固定，然后脱水、包埋、切片、染色、观将细胞用戊二醛固定，然后脱水、包埋、切片、染色、观察

37、病毒颗粒，通常察病毒颗粒，通常12 d完成。完成。q操作复杂、费时，但样品可长期保存，可观察病毒粒子形操作复杂、费时，但样品可长期保存，可观察病毒粒子形态与发生过程。态与发生过程。2、负染法、负染法q直接将病毒悬液直接将病毒悬液(也可用细胞也可用细胞)滴在铜网上，用重金属滴在铜网上，用重金属(通常通常用磷钨酸用磷钨酸) 进行染色，观察病毒颗粒，进行染色，观察病毒颗粒，10-20min可出结果。可出结果。q原理：原理：负性染料不渗入病毒颗粒，而是将病毒颗粒包绕，负性染料不渗入病毒颗粒，而是将病毒颗粒包绕，由于负性染料含重金属使电子束不能穿透，病毒颗粒具有由于负性染料含重金属使电子束不能穿透，病毒

38、颗粒具有亮度，在周围暗背景上显示亮区亮度，在周围暗背景上显示亮区较正染法显示的图像较正染法显示的图像清晰，可显示病毒的结构。清晰，可显示病毒的结构。q缺点：缺点：敏感性低，要求病毒量在敏感性低，要求病毒量在107mL以上，同科病毒以上，同科病毒难于鉴别。难于鉴别。3、投影技术、投影技术采用几种电镜技术观采用几种电镜技术观察病毒粒子的形态察病毒粒子的形态Orf virus：口疮病毒口疮病毒(接触性脓疱皮炎接触性脓疱皮炎) )Ebola virus埃博埃博拉病毒（正染技术）拉病毒（正染技术）Vaccinia virus 痘苗病毒痘苗病毒（投影技术）（投影技术）负染技术负染技术彩色电子显微照片。它显

39、示出彩色电子显微照片。它显示出H5N1型禽流感病毒型禽流感病毒（金黄色）在（金黄色）在MDCK细胞（绿色）培养液中的活动细胞（绿色）培养液中的活动状态状态二、病毒的免疫检测二、病毒的免疫检测1、荧光免疫法、荧光免疫法(IF)2、酶免疫法（、酶免疫法（ELISA）3、单克隆抗体技术、单克隆抗体技术1、免疫荧光法、免疫荧光法(IF)荧光荧光（fluorescencefluorescence） 荧光物质吸收激发光的能量后，电子从基荧光物质吸收激发光的能量后，电子从基态跃迁到激发态，当其回复至基态时，以发射态跃迁到激发态，当其回复至基态时，以发射光形式释放出能量，称为荧光。光形式释放出能量，称为荧光。

40、 荧光寿命荧光寿命定义定义: :荧光物质被激发后所产生的荧光衰减到一荧光物质被激发后所产生的荧光衰减到一定程度时所用的时间。定程度时所用的时间。各种荧光物质的荧光寿命不同。各种荧光物质的荧光寿命不同。 荧光物质荧光物质最大吸收光最大吸收光谱谱最大发射光谱最大发射光谱应用应用异硫氰酸荧光素异硫氰酸荧光素 (FITC)(FITC)490490495nm495nm520520530nm 530nm （黄（黄绿色）绿色）FATFAT、荧光偏振免疫、荧光偏振免疫测定测定四乙基罗丹明四乙基罗丹明 (RB200)(RB200)570570575nm575nm595595600nm600nm（橙红（橙红色）色

41、）FITCFITC的衬比染色或的衬比染色或双标记双标记FATFAT四甲基异硫氰酸罗四甲基异硫氰酸罗丹明丹明 (TRITC)(TRITC)550nm550nm620nm620nm（橙红色）（橙红色）FITCFITC的衬比染色或的衬比染色或双标记双标记FATFAT藻红蛋白（藻红蛋白（PEPE）490-560nm490-560nm595nm595nm（红色）（红色）双标记双标记FATFAT、流式细、流式细胞术胞术7-7-氨基氨基-4-4-甲基香甲基香豆素豆素354nm354nm430nm430nm（蓝色）（蓝色）双标记或多标记双标记或多标记FATFATEuEu3+3+螯合物螯合物340nm340nm

42、613nm613nm时间分辨荧光免疫时间分辨荧光免疫测定测定荧光物质：荧光物质：一类能吸收激发光的光能而发射荧光的物质。 电子的跃迁荧光抗体技术的基本原理荧光抗体技术的基本原理 荧光素标记抗体与切片中组织细胞抗原反应，荧光素标记抗体与切片中组织细胞抗原反应，洗涤分离后荧光显微镜观察呈现特异荧光的抗原抗洗涤分离后荧光显微镜观察呈现特异荧光的抗原抗体复合物及其部位，对组织细胞抗原进行定性和定体复合物及其部位，对组织细胞抗原进行定性和定位检测，或对自身抗体进行定性和滴度测定。位检测，或对自身抗体进行定性和滴度测定。抗体要求抗体要求 高特异性高特异性 高亲和力高亲和力 经纯化提取经纯化提取IgGIgG

43、 荧光抗体的制备荧光抗体的制备v有能与蛋白质形成共价健的化学基团，与蛋白质有能与蛋白质形成共价健的化学基团，与蛋白质结合后不易解离，而未结合的色素及其降解产物结合后不易解离，而未结合的色素及其降解产物易于清除。易于清除。v结合后，仍保持较高的荧光效率。结合后，仍保持较高的荧光效率。v荧光色泽与背景组织的色泽对比鲜明。荧光色泽与背景组织的色泽对比鲜明。v结合后不影响蛋白质原有的生化与免疫性质。结合后不影响蛋白质原有的生化与免疫性质。v标记方法简单、安全无毒。标记方法简单、安全无毒。v与蛋白质的结合物稳定，易于保存。与蛋白质的结合物稳定，易于保存。荧光素要求荧光素要求抗体的荧光素标记抗体的荧光素标

44、记v标记原理标记原理: :利用抗体蛋白的自由氨基与利用抗体蛋白的自由氨基与FITCFITC的异硫的异硫氰基在碱性溶液中形成硫碳酰胺键，使抗体与氰基在碱性溶液中形成硫碳酰胺键，使抗体与FITCFITC结结合成荧光抗体。合成荧光抗体。v标记方法标记方法: : 搅拌法：搅拌法：适于标记体积较大、蛋白含量较高的抗适于标记体积较大、蛋白含量较高的抗体。标记时间体。标记时间 短，荧光素用量少，但有非特异性染短，荧光素用量少，但有非特异性染色。色。 透析法：透析法：适于标记样品量少，蛋白含量低的抗体。适于标记样品量少，蛋白含量低的抗体。标记比较匀，标记比较匀， 非特异染色较低。非特异染色较低。v去除游离荧光

45、素及其降解产物：去除游离荧光素及其降解产物：透析或凝胶过透析或凝胶过滤滤v去除荧光素未结合和结合过度的抗体：去除荧光素未结合和结合过度的抗体：阴离子阴离子交换层析法交换层析法v去除交叉反应或非期望抗体：去除交叉反应或非期望抗体：动物肝粉吸收或动物肝粉吸收或固相抗原吸收固相抗原吸收荧光抗体的纯化荧光抗体的纯化直接法直接法直接荧光抗体染色法示意图直接荧光抗体染色法示意图 荧光素标记的荧光素标记的特异性抗体直特异性抗体直接与相应抗原接与相应抗原反应。反应。荧光抗体染色荧光抗体染色间接法间接法特异性抗体与相特异性抗体与相应抗原反应，荧应抗原反应，荧光素标记的抗抗光素标记的抗抗体再与第一抗体体再与第一抗

46、体结合。结合。 间接荧光抗体染色法示意图间接荧光抗体染色法示意图 荧光显微镜荧光显微镜 利用一定波长的激发利用一定波长的激发光对样品进行激发，产生光对样品进行激发，产生一定波长的荧光，对样品一定波长的荧光，对样品结构或其组分进行定性、结构或其组分进行定性、定位、定量观察检测。定位、定量观察检测。 n主要试剂主要试剂: : 酶标记的抗体或抗原酶标记的抗体或抗原n酶标物特点：酶标物特点： 免疫学活性免疫学活性 酶对底物的催化活性酶对底物的催化活性抗原抗体反应的特异性抗原抗体反应的特异性+酶促催化反应的高敏感性酶促催化反应的高敏感性2、酶免疫法（、酶免疫法（ELISA）特点：特点：灵敏度高、特异性强

47、、灵敏度高、特异性强、准确性好准确性好酶标记试剂能够较长时酶标记试剂能够较长时间保持稳定间保持稳定操作简便、对环境没有操作简便、对环境没有污染。污染。易与其它技术偶联易与其它技术偶联衍生出适用范围更广的衍生出适用范围更广的新方法新方法。原理：原理：酶标抗体（抗原）与抗原酶标抗体（抗原）与抗原（抗体）的特异性反应（抗体）的特异性反应酶对底物的显色反应酶对底物的显色反应对抗原或抗体进行定位、对抗原或抗体进行定位、定性或定量的测定分析定性或定量的测定分析 酶免疫技术的核心部分酶免疫技术的核心部分 酶结合物酶结合物（conjugateconjugate）酶标记物酶标记物 通过化学反应或免通过化学反应或

48、免疫学反应，让酶与疫学反应，让酶与抗体或抗原形成的抗体或抗原形成的结合物结合物 酶酶免免疫疫技技术术酶免疫组化酶免疫组化酶免疫测定酶免疫测定均均 相相异相异相固相酶免疫测定固相酶免疫测定液相酶免疫测定液相酶免疫测定组织切片中的抗原抗体反应组织切片中的抗原抗体反应 液体标本中抗原或液体标本中抗原或抗体的定性和定量抗体的定性和定量(ELISA)(ELISA)三个部分：三个部分： 免疫反应免疫反应 酶与底物反应酶与底物反应 检测方法的建立检测方法的建立ELISA酶联免疫吸附试验（酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA ）高纯度的抗原、高亲和

49、力的抗体高纯度的抗原、高亲和力的抗体高活性、高纯度的标记用酶高活性、高纯度的标记用酶有效的交联方法制备高质量的酶有效的交联方法制备高质量的酶标记物标记物选用适宜的酶选用适宜的酶/ /底物系统底物系统底物显色底物显色定性或定量的分析定性或定量的分析原理原理包被包被反应反应加入待测抗体或加入待测抗体或抗原和酶标抗原抗原和酶标抗原或抗体或抗体洗涤洗涤使结合在固相上使结合在固相上的抗原抗体复合物的抗原抗体复合物与未结合的分离与未结合的分离1234固相的抗原或抗体固相的抗原或抗体 酶标记物酶标记物 酶反应的底物酶反应的底物 双抗体夹心法双抗体夹心法（double antibody sandwich-EL

50、ISAdouble antibody sandwich-ELISA）方法：方法：用已知抗体包被，加入待检血清病毒样品，再加用已知抗体包被，加入待检血清病毒样品，再加酶标抗体，加底物显色酶标抗体，加底物显色应用：应用：二价或二价以上的较大分子抗原测定二价或二价以上的较大分子抗原测定( (乙型肝炎乙型肝炎表面抗原表面抗原HBsAg),HBsAg),不能用于半抗原等小分子的测定。不能用于半抗原等小分子的测定。ELISAELISA检测抗原的方法检测抗原的方法双抗体夹心法测抗原双抗体夹心法测抗原+ +- -E EE EE EE EE EE EE EE EE E阴性对照阴性对照捕获法捕获法+ +- -E

51、EE EE EE EE E 1 1、固相化抗人、固相化抗人IgMIgM1 1、固相化抗人、固相化抗人IgMIgM2 2、加待测物、加待测物特异性特异性IgMIgM与与非特异性非特异性IgMIgM和抗人和抗人IgMIgM结合结合3 3、加特异性、加特异性抗原，与特异抗原，与特异性抗体结合性抗体结合4 4、加酶标抗体、加酶标抗体与特异性抗原结与特异性抗原结合，加底物显色合，加底物显色2 2、加待测物、加待测物只有非特异性只有非特异性IgMIgM和抗人和抗人IgMIgM结合结合3 3、加特异性抗、加特异性抗原，不能与非原，不能与非特异性特异性IgMIgM结合结合4 4、加酶标抗体、加酶标抗体无抗原结

52、合，无抗原结合，加底物不显色加底物不显色n（一）固相载体（一）固相载体 聚苯乙烯聚苯乙烯 特点：吸附蛋白能力强，保留其免疫活性特点：吸附蛋白能力强，保留其免疫活性 形状：小试管、小珠、微量形状：小试管、小珠、微量ELISA板板 n（二）抗原和抗体（二）抗原和抗体 高纯度的抗原高纯度的抗原 高效价的抗体高效价的抗体 固相酶免疫测定的技术要点固相酶免疫测定的技术要点n（三）酶和底物的选择（三）酶和底物的选择 标记酶的要求：标记酶的要求： 活性高活性高 性质稳定性质稳定 专一性强专一性强 酶催化底物的显色信号易于判断和测量酶催化底物的显色信号易于判断和测量 方法敏感，重复性好，简单易行方法敏感，重复

53、性好，简单易行 酶的底物易于配制保存，酶及底物价廉酶的底物易于配制保存，酶及底物价廉辣根过氧化物酶辣根过氧化物酶(HRP)糖蛋白糖蛋白邻苯二胺邻苯二胺 OPDOPD四甲基联苯胺四甲基联苯胺 TMBTMB5-5-氨基水杨酸氨基水杨酸5-ASA 5-ASA 2,2-2,2-氨基氨基- -二二(3-(3-乙基乙基- -苯并噻苯并噻唑啉磺酸唑啉磺酸-6)-6)铵盐铵盐 ABTSABTSOPDOPD反应后显橙黄反应后显橙黄色，加酸终止反色，加酸终止反应后呈棕黄色，应后呈棕黄色，测定波长测定波长492nm492nm。不稳定，致癌性。不稳定，致癌性。TMBTMB反应后显蓝色反应后显蓝色 ，加酸终止反应后变加

54、酸终止反应后变为黄色为黄色, ,测定波长测定波长450nm 450nm ，稳定，无，稳定，无致癌性，致癌性，ELISAELISA中应中应用最广泛的底物。用最广泛的底物。 碱性磷酸酶（碱性磷酸酶（ALPALP）菌源性菌源性ALP ALP 肠粘膜肠粘膜ALPALP-半乳糖苷酶（半乳糖苷酶（-Gal-Gal）其他的酶其他的酶大肠埃希氏菌大肠埃希氏菌 ALPALP的的底物底物 对对- -硝基苯磷酸酯硝基苯磷酸酯（ pNPP pNPP ）经经ALPALP作用后的产物为黄色对作用后的产物为黄色对硝基酚，最大吸收峰波长为硝基酚，最大吸收峰波长为405 nm405 nm。 -Gal-Gal的底物的底物 4-4

55、-甲基伞酮基甲基伞酮基-D -D - -半乳糖苷半乳糖苷（ 4MUG 4MUG ）酶作用后，生成高强度酶作用后，生成高强度荧光物荧光物 ，用荧光计测，用荧光计测量。量。抗原要求纯度高，抗原性完整抗原要求纯度高，抗原性完整 抗体需要特异性好、效价高、亲抗体需要特异性好、效价高、亲合力强以及比活性较高，能批量生合力强以及比活性较高，能批量生产，易纯化。产，易纯化。 酶标抗体制备方法要求酶标抗体制备方法要求制备方法制备方法过碘酸钠法（直接法）过碘酸钠法（直接法）常用于常用于HRPHRP标记抗体或抗原标记抗体或抗原 戊二醛交联法戊二醛交联法 酶标记物质量较均一酶标记物质量较均一纯化纯化标记完成后应除去

56、反应液中的游离酶、标记完成后应除去反应液中的游离酶、游离抗体或抗原、酶聚合物以及抗体游离抗体或抗原、酶聚合物以及抗体或抗原聚合物，避免游离酶增加非特或抗原聚合物，避免游离酶增加非特异显色，以及游离抗体或抗原起竞争异显色，以及游离抗体或抗原起竞争作用而降低特异性染色强度作用而降低特异性染色强度 抗体是从何来的？抗体是从何来的？传统的抗体生产方法及缺陷是什么？传统的抗体生产方法及缺陷是什么？ 抗体是机体受抗原刺激后产生的、并抗体是机体受抗原刺激后产生的、并能与该抗原发生特异性结合的具有免疫能与该抗原发生特异性结合的具有免疫功能的功能的球蛋白。球蛋白。3、单克隆抗体技术、单克隆抗体技术（）（）B B

57、淋巴细胞受淋巴细胞受抗原刺激抗原刺激后，可以后，可以产生产生抗体抗体。（）动物体内的（）动物体内的B B淋巴细胞可以产生淋巴细胞可以产生百万种以上百万种以上的抗体，每种抗体对特定的抗的抗体，每种抗体对特定的抗原具有特异性免疫作用。原具有特异性免疫作用。（）每一个淋巴细胞（）每一个淋巴细胞只能只能产生一种产生一种抗体。抗体。B淋巴细胞有什么特点？淋巴细胞有什么特点？ 单克隆抗体的特点？单克隆抗体的特点？ 由单个由单个B B淋巴细胞经过淋巴细胞经过无性繁殖无性繁殖（克（克隆），形成基因型相同的细胞群，这一隆），形成基因型相同的细胞群，这一细胞群所产生的化学细胞群所产生的化学性质单一、特异性性质单一

58、、特异性强强的抗体称为单克隆抗体。的抗体称为单克隆抗体。 特异性强、灵敏度高特异性强、灵敏度高 单克隆抗体制备过程？单克隆抗体制备过程？1、单克隆抗体：、单克隆抗体：2、特点：、特点： 单克隆抗体制备过程单克隆抗体制备过程 注射抗原注射抗原B淋巴细胞淋巴细胞骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞细胞融合、筛选细胞融合、筛选杂交瘤细胞杂交瘤细胞细胞培养细胞培养筛选，继续培养筛选，继续培养足够数量的、能产生足够数量的、能产生特定抗体的细胞群特定抗体的细胞群体外培养体外培养注射到小鼠腹腔注射到小鼠腹腔单克隆抗体单克隆抗体单克隆抗体的应用1、诊断试剂（病原微生物、肿瘤抗原检测）2、蛋白质提纯3、肿瘤导向治疗技术（生物导

59、弹）动物细胞融合技术动物细胞融合技术 细胞融合是正常的生命活动细胞融合是正常的生命活动两个细胞正在融合两个细胞正在融合 受精作用受精作用诱导细胞融合的方法诱导细胞融合的方法用用 诱导动物细胞融合过程诱导动物细胞融合过程细胞核细胞核病毒颗粒病毒颗粒灭活的病毒灭活的病毒细胞膜被病毒颗粒穿通细胞膜被病毒颗粒穿通细胞膜连接细胞膜连接杂种细胞杂种细胞融合细胞的筛选方法融合细胞的筛选方法常用的克隆化培养方法常用的克隆化培养方法1、半固体平板培养法、半固体平板培养法2、有限稀释法、有限稀释法3、显微镜操作法、显微镜操作法4、盖片分离法、盖片分离法有限稀释法有限稀释法样品样品处理处理富集富集获得病毒获得病毒的

60、的核酸序核酸序列列是描述是描述病毒特征病毒特征的关键。的关键。检测检测分子生物学方法分子生物学方法三、病毒的分子生物学检测三、病毒的分子生物学检测1、核酸杂交技术、核酸杂交技术2、PCR和和RT-PCR技术技术同源性：同源性：从分子水平讲则是指两个核酸分子的核从分子水平讲则是指两个核酸分子的核苷酸序列间的相似程度。苷酸序列间的相似程度。1 1、核酸杂交技术、核酸杂交技术DNA的变性与复性的变性与复性DNA变性：变性：DNA双链之间以氢键连接，氢键是一种次级键，能量较低，易受破坏，在某些理化因素作用下，DNA分子互补碱基对之间的氢键断裂，使DNA双螺旋结构松散，变成单链，即为DNA变性。 DNA