第四章蛋白质化学

1、 第四章第四章 蛋白质化学蛋白质化学 主要内容主要内容：介绍氨基酸的结构、分类、介绍氨基酸的结构、分类、性质及肽的概念，重点讨论蛋白质的结构、性质及肽的概念，重点讨论蛋白质的结构、性质以及结构和功能的相互关系性质以及结构和功能的相互关系。思考思考目录目录第一节第一节 概述概述第二节第二节 蛋白质的基本结构单位蛋白质的基本结构单位氨基酸氨基酸第三节第三节 肽肽第四节第四节 蛋白质的分子结构蛋白质的分子结构第五节第五节 蛋白质的分子结构与功能的关系蛋白质的分子结构与功能的关系第六节第六节 蛋白质的重要性质蛋白质的重要性质第七节第七节 蛋白质与氨基酸分离纯化与测定蛋白质与氨基酸分离纯化与测定 第一节

2、 概 述一.什么是蛋白质？ 蛋白质(Protein)是由许多不同的氨基酸氨基酸，按照一定的顺序，通过肽键肽键连接而成的一条或多条肽链构成的生物大分子生物大分子。 1.蛋白质是生物体的重要组成成分，是生物体形态结构的物质基础。 2.蛋白质是生命活动的物质基础。二.蛋白质的重要性 蛋白质是生命活动的重要物质基础，没有蛋白质就没有生命。三三.蛋白质的元素组成蛋白质的元素组成 主要元素主要元素： C H O N S 5055% 68% 2023% 1518% 04% 微量元素微量元素： P Fe Cu Zn Mo I Se 大多数蛋白质含氮量较恒定，平均大多数蛋白质含氮量较恒定，平均16 %，即即1g

3、氮相当于氮相当于6.25g蛋白质。蛋白质。 6.25称称为蛋白质系数。为蛋白质系数。 蛋白质平均含蛋白质平均含N N量为量为1616, ,这是凯氏定这是凯氏定氮法测蛋白质含量的理论依据：氮法测蛋白质含量的理论依据： 蛋白质含量蛋白质含蛋白质含量蛋白质含N N量量6.256.25四四.蛋白质的分类蛋白质的分类（一）按分子形状分（一）按分子形状分 球状蛋白质球状蛋白质: 如血红蛋白和豆类的球蛋白。如血红蛋白和豆类的球蛋白。 纤维状蛋白质纤维状蛋白质: 1. - 角蛋白角蛋白 毛发、指甲、羽毛等。毛发、指甲、羽毛等。 2. -角蛋白角蛋白 蚕丝、蜘蛛丝等。蚕丝、蜘蛛丝等。 3. 胶原蛋白胶原蛋白 皮

4、肤、软骨等。皮肤、软骨等。（二）按溶解度分（二）按溶解度分1.清蛋白清蛋白:溶于水溶于水,如乳清白蛋白如乳清白蛋白; 2.精蛋白精蛋白:溶于水及酸性溶液溶于水及酸性溶液,含碱性氨基酸多含碱性氨基酸多,如如鲑精蛋白鲑精蛋白; 3.组蛋白组蛋白:溶于水及稀酸溶液溶于水及稀酸溶液,含碱性氨基酸较多含碱性氨基酸较多,常是细胞核染色质组成成分常是细胞核染色质组成成分; 4.球蛋白球蛋白:微溶于水而溶于稀的中性盐溶液微溶于水而溶于稀的中性盐溶液,如血如血清球蛋白清球蛋白; 5.谷蛋白谷蛋白:不溶于水、醇及中性盐溶液不溶于水、醇及中性盐溶液,但溶于稀但溶于稀酸稀碱酸稀碱,如麦蛋白如麦蛋白; 6.醇溶蛋白醇溶

5、蛋白:不溶于水不溶于水,溶于溶于70-80%乙醇乙醇,如玉米蛋如玉米蛋白白; 7.硬蛋白硬蛋白:不溶于水、盐、稀酸、稀碱溶液，如角不溶于水、盐、稀酸、稀碱溶液，如角蛋白和胶原蛋白。蛋白和胶原蛋白。（三）按化学组成分（三）按化学组成分 1.单纯蛋白质单纯蛋白质 仅有氨基酸组成的蛋白质，水解仅有氨基酸组成的蛋白质，水解后产物只有氨基酸。后产物只有氨基酸。 2.结合蛋白质结合蛋白质 除含有氨基酸外，还含有糖、脂除含有氨基酸外，还含有糖、脂肪、核酸等非蛋白成分。肪、核酸等非蛋白成分。 结合蛋白由两部分组成：一是蛋结合蛋白由两部分组成：一是蛋白质部分；二是非蛋白部分，称为白质部分；二是非蛋白部分，称为辅

6、基。如糖蛋白、核蛋白、脂蛋白。辅基。如糖蛋白、核蛋白、脂蛋白。五五.蛋白质的主要生理功能蛋白质的主要生理功能 蛋白质（蛋白质（proteinprotein）是生活细胞内含量最丰富、功能最是生活细胞内含量最丰富、功能最复杂的生物大分子，并参与了几乎所有的生命活动和生命过复杂的生物大分子，并参与了几乎所有的生命活动和生命过程。因此，研究蛋白质的结构与功能始终是生命科学最基本程。因此，研究蛋白质的结构与功能始终是生命科学最基本的命题。的命题。 生物体最主要的特征是生命活动，而蛋白质是生命活动生物体最主要的特征是生命活动，而蛋白质是生命活动的体现者，具有以下主要功能：的体现者，具有以下主要功能：催化功

7、能；结构功能；调节功能；催化功能；结构功能；调节功能；免疫功能；运动功能；运输功能；免疫功能；运动功能；运输功能；信息功能；储藏功能信息功能；储藏功能 第二节第二节 蛋白质的基本结构单位蛋白质的基本结构单位氨氨基酸基酸一、蛋白质水解一、蛋白质水解二、氨基酸的通式二、氨基酸的通式三、生物体内氨基酸的类别三、生物体内氨基酸的类别四、氨基酸的结构与分类四、氨基酸的结构与分类五、氨基酸的性质五、氨基酸的性质一、蛋白质的水解（详见一、蛋白质的水解（详见P43）1.酸水解酸水解 优点优点:水解彻底水解彻底,水解产物为水解产物为L-氨基酸氨基酸,没有旋光异构体产生没有旋光异构体产生; 缺点缺点:营养价值较高

8、的色氨酸几乎全部被破坏。营养价值较高的色氨酸几乎全部被破坏。2.碱水解碱水解 优点：色氨酸不被破坏，水解液清亮；优点：色氨酸不被破坏，水解液清亮； 缺点：水解产生的氨基酸发生旋光异构作用，产物有缺点：水解产生的氨基酸发生旋光异构作用，产物有D-型和型和L-型两类氨基酸。型两类氨基酸。D-型氨基酸不能被人体分解利用，营养价型氨基酸不能被人体分解利用，营养价值减半。值减半。3.酶水解酶水解 优点：条件温和，氨基酸完全不被破坏，也不发生旋光异构优点：条件温和，氨基酸完全不被破坏，也不发生旋光异构现象；现象； 缺点：水解不彻底，中间产物（短肽等）较多。缺点：水解不彻底，中间产物（短肽等）较多。 -氨基

9、酸的通式氨基酸的通式 二、氨基酸的结构特征二、氨基酸的结构特征生物体内的氨基酸类别生物体内的氨基酸类别 蛋白质氨基酸蛋白质氨基酸： 蛋白质中常见的蛋白质中常见的20种氨基酸种氨基酸 稀有的蛋白质氨基酸稀有的蛋白质氨基酸：蛋白质组成中，除上述蛋白质组成中，除上述20种常见氨基酸外，从少数蛋白质中还分离出一些稀有种常见氨基酸外，从少数蛋白质中还分离出一些稀有氨基酸，它们都是相应常见氨基酸的衍生物。如氨基酸，它们都是相应常见氨基酸的衍生物。如4-羟羟脯氨酸、脯氨酸、5-羟赖氨酸等。羟赖氨酸等。 非蛋白质氨基酸非蛋白质氨基酸：生物体内呈游离或结合态的氨生物体内呈游离或结合态的氨基酸。基酸。三、氨基酸的

10、分类、结构及三字符号三、氨基酸的分类、结构及三字符号据据R基团化基团化学结构分类学结构分类 脂肪族脂肪族A A（中性、含羟基或巯基、酸性、碱性）中性、含羟基或巯基、酸性、碱性）芳香族芳香族A(PheA(Phe、TyrTyr、Trp)Trp)杂环杂环( (HisHis、Pro)Pro)据据R基团基团极性分类极性分类极性极性R基团基团AA非极性非极性R基团基团AA（种）种）不带电荷不带电荷（种）种）带电荷：正电荷带电荷：正电荷（种）负电荷种）负电荷（种）种）据氨基、羧据氨基、羧基数分类基数分类一氨基一羧基一氨基一羧基一氨基二羧基一氨基二羧基( (GluGlu、Asp)Asp)二氨基一羧基二氨基一羧

11、基( (LysLys、HisHis、Arg)Arg)非极性非极性R基团氨基酸基团氨基酸不带电荷极性不带电荷极性R基团氨基酸基团氨基酸带电荷极性带电荷极性R基团氨基酸基团氨基酸甘氨酸甘氨酸 （Gly,G）丙氨酸丙氨酸 （Ala,A）缬氨酸缬氨酸 （Val,V）亮氨酸亮氨酸 （Lue,L）异亮氨酸异亮氨酸 （Ile,I）中性脂肪族氨基酸中性脂肪族氨基酸含羟基或硫脂肪族氨基酸含羟基或硫脂肪族氨基酸丝氨酸丝氨酸 （Ser,S）苏氨酸苏氨酸 （Thr,T）半胱氨酸半胱氨酸 （Cys,C）甲硫氨酸甲硫氨酸 （Met,M）酸性氨基酸及酰胺酸性氨基酸及酰胺天冬氨酸天冬氨酸 （Asp,D）谷氨酸谷氨酸 （Glu

12、,E）天冬酰胺天冬酰胺 （Asn,N）谷氨酰胺谷氨酰胺 （Gln,Q）碱性氨基酸碱性氨基酸赖氨酸赖氨酸 （Lys,K）精氨酸精氨酸 （Arg,R）组氨酸组氨酸 （His,H）杂环杂环杂环氨基酸杂环氨基酸组氨酸组氨酸 （His,H）脯氨酸脯氨酸 （Pro,P）芳香族氨基酸芳香族氨基酸苯丙氨酸苯丙氨酸 （Phe,F）酪氨酸酪氨酸 （Tyr,Y）色氨酸色氨酸 （Trg,W）氨基酸的光学性质氨基酸的光学性质1、除、除甘氨酸甘氨酸外，所有天然外，所有天然-氨基酸都有不对称碳原子，因此所氨基酸都有不对称碳原子，因此所有天然氨基酸都具有旋光性。有天然氨基酸都具有旋光性。2、参与蛋白质组成的、参与蛋白质组成的

13、20种氨基酸中种氨基酸中色氨酸色氨酸(Trp)、酪氨酸酪氨酸(Tyr)和和苯丙氨酸苯丙氨酸(Phe)的的R基团中含有苯环共轭双键系统，在紫外光基团中含有苯环共轭双键系统，在紫外光区（区（220-300nm）显示特征的吸收谱带，最大光吸收（显示特征的吸收谱带，最大光吸收（ max）分别为分别为279、278、和和259nm。由于大多数蛋白质都含有这些氨。由于大多数蛋白质都含有这些氨基酸残基，因此用紫外分光光度法可测定蛋白质含量基酸残基，因此用紫外分光光度法可测定蛋白质含量。 氨基酸的性质氨基酸的性质（1 1 ）两性解离和等电点）两性解离和等电点 （2 2 ）光学性质）光学性质 （3 3 ）重要化

14、学反应）重要化学反应a. a. 与茚三酮反应与茚三酮反应: :用于氨基酸定量定性测定用于氨基酸定量定性测定. .b.b.与与2,42,4一二硝基氟苯一二硝基氟苯( (DNFB)DNFB)的反应（的反应（sangersanger反应）反应）: :鉴鉴定氨基酸定氨基酸, ,也可用于蛋白质的结构测定也可用于蛋白质的结构测定. . c. c. 与苯异硫氰酯（与苯异硫氰酯（PITCPITC）的反应（的反应（EdmanEdman反应），反应）， 用用于蛋白于蛋白N-N-端测定，蛋白质顺序测定仪设计原理的依据。端测定，蛋白质顺序测定仪设计原理的依据。3.氨基酸的两性解离性质及等电点氨基酸的两性解离性质及等电

15、点 pH = pI 净电荷净电荷=0 pH pI净电荷为负净电荷为负CHRCOOHNH3+CHRCOONH2CHRCOONH3+ + H+ OH- + H+ OH-(pK 1)(pK 2) 当氨基酸溶液在某一定当氨基酸溶液在某一定pH值时，使某特定氨基酸分子上所带正负值时，使某特定氨基酸分子上所带正负电荷相等，成为两性离子，在电场中既不向阳极也不向阴极移动，此电荷相等，成为两性离子，在电场中既不向阳极也不向阴极移动，此时溶液的时溶液的pH值即为该氨基酸的值即为该氨基酸的等电点等电点(isoelectric point，pI)。TrpTyrPhe的的 紫外紫外吸收吸收光谱光谱摩尔吸收系数摩尔吸收

16、系数波长波长氨基酸与茚三酮反应氨基酸与茚三酮反应+3H20水合茚三酮水合茚三酮(无色无色)NH3CO2 RCHO+还原性茚三酮还原性茚三酮紫色化合物紫色化合物(弱酸弱酸)加热加热水合茚三酮水合茚三酮+ 2NH3 +还原性茚三酮还原性茚三酮氨基酸与氨基酸与2,42,4一二硝基氟苯一二硝基氟苯( (DNFB)DNFB)的反应的反应（sangersanger反应）反应）DNFB（dinitrofiuorobenzene）DNP-AA(黄色黄色)+ HF弱碱中弱碱中氨基酸氨基酸氨基酸与苯异硫氰酯（氨基酸与苯异硫氰酯（PITCPITC）的反应的反应（EdmanEdman反应）反应）PITC（phenyl

17、isothiocyanate）+苯乙内酰硫脲衍生物苯乙内酰硫脲衍生物(PTH-AA) （phenylisothiohydantion-AA）弱碱中弱碱中(400 C)(硝基甲烷硝基甲烷 400 C)H+第三节第三节 肽肽一一 、肽、肽( (peptide)peptide)和肽键和肽键( (peptide bend)peptide bend)的概念的概念二、肽的重要性质二、肽的重要性质 酸碱性质、重要化学反应类似于氨基酸性质酸碱性质、重要化学反应类似于氨基酸性质三、天然存在的活性肽三、天然存在的活性肽 生理活性肽的功能类别：激素、抗菌素、辅助因子生理活性肽的功能类别：激素、抗菌素、辅助因子 实例

18、：谷胱甘肽实例：谷胱甘肽( (glutathione,glutathione,GSHGSH) ) 短杆菌肽短杆菌肽促甲状腺素释放因子（促甲状腺素释放因子（TRH） - -天冬氨酸天冬氨酸- -苯丙氨酸甲酯（甜味剂）苯丙氨酸甲酯（甜味剂）肽和肽键的形成肽和肽键的形成肽单位肽单位肽键肽键肽平面肽平面肽单位谷胱甘肽谷胱甘肽 谷胱甘肽在体内参与氧化还原过程，作为某些氧化还谷胱甘肽在体内参与氧化还原过程，作为某些氧化还原酶的辅因子，或保护巯基酶，或防止过氧化物积累。原酶的辅因子，或保护巯基酶，或防止过氧化物积累。促甲状腺素释放因子促甲状腺素释放因子 （TRH）短杆菌肽短杆菌肽S - -天冬氨酰天冬氨酰-

19、 -苯丙氨酸甲酯苯丙氨酸甲酯CH2NH2 CH C NH CH C OO CH2COOH O CH3第四节第四节 蛋白质的分子结构蛋白质的分子结构一、一、 蛋白质的结构层次的划分蛋白质的结构层次的划分二、二、 蛋白质的一级结构蛋白质的一级结构三、三、 多肽主链折叠的空间限制和多肽主链折叠的空间限制和 维持蛋白质构象的作用力维持蛋白质构象的作用力四、四、 蛋白质的二级结构蛋白质的二级结构五、五、 蛋白质的超二级结构和结构域蛋白质的超二级结构和结构域六、六、 蛋白质的三级结构蛋白质的三级结构七、七、 蛋白质的四级结构蛋白质的四级结构蛋蛋白白质质结结构构的的主主要要层层次次一级结构一级结构四级结构四

20、级结构二级结构二级结构三级结构三级结构primary structureprimary structuresecondary structuresecondary structureTertiary structureTertiary structurequariernary structurequariernary structure超二级结构超二级结构结构域结构域 supersecondary structuresupersecondary structureStructure domanStructure doman二、蛋白质的一级结构二、蛋白质的一级结构多肽链中氨基酸的排列顺序，包括二

21、硫键的位置称为蛋白多肽链中氨基酸的排列顺序，包括二硫键的位置称为蛋白质的一级结构质的一级结构( (primary structure)primary structure)。这是蛋白质最基本的结构，这是蛋白质最基本的结构，它决定蛋白质高级结构和生物功能的信息。它决定蛋白质高级结构和生物功能的信息。一级结构测定一级结构测定例：例：牛胰岛素的一级结构牛胰岛素的一级结构一级结构测定一级结构测定基本战略基本战略：片段重叠法氨基酸顺序直测法：片段重叠法氨基酸顺序直测法 要点：要点：a a. .测定蛋白质的分子量及其氨基酸组分测定蛋白质的分子量及其氨基酸组分 b.b. 测定肽键的测定肽键的N N末端和末端和

22、C C末端末端 c.c. 应用两种或两种以上的肽键内切酶分别在多肽键的应用两种或两种以上的肽键内切酶分别在多肽键的专一位点上断裂肽键；也可用溴化氰法专一性地断裂甲硫氨酸专一位点上断裂肽键；也可用溴化氰法专一性地断裂甲硫氨酸位点，从而得到一系列大小不等的肽段。位点，从而得到一系列大小不等的肽段。 d.d. 分离提纯所产生的肽段，并分别测定它们的氨基酸分离提纯所产生的肽段，并分别测定它们的氨基酸顺序顺序 e.e. 将这些肽段的顺序进行跨切口重叠，进行比较分析将这些肽段的顺序进行跨切口重叠，进行比较分析，推断出蛋白质分子的全部氨基酸序列。，推断出蛋白质分子的全部氨基酸序列。蛋白质顺序测蛋白质顺序测

23、定基本策略定基本策略将肽段顺序进行叠联以确定完整的顺序将肽段顺序进行叠联以确定完整的顺序 将肽段分离并测出顺序将肽段分离并测出顺序专一性裂解专一性裂解末端氨基酸测定末端氨基酸测定二硫键拆开二硫键拆开纯蛋白质纯蛋白质酰胺平面与酰胺平面与-碳原子的二面角（碳原子的二面角（ 和和 ） 二面角二面角 两相邻酰胺平面之间，能以共同的两相邻酰胺平面之间，能以共同的C为为定点而旋转，绕定点而旋转，绕C-N键旋转的角度称键旋转的角度称角角，绕，绕C-C键旋转的角度称键旋转的角度称角。角。和和称作称作二面角，亦称构象角。二面角，亦称构象角。完全伸展的多肽主链构象完全伸展的多肽主链构象-碳原子碳原子酰胺平面酰胺平

24、面=1800，=1800=00，=00的多肽主链构象的多肽主链构象酰胺平面酰胺平面=00，=00侧链侧链非键合原子非键合原子接触半径接触半径维持蛋白质分子构象的作用力维持蛋白质分子构象的作用力a.盐键盐键 b.氢键氢键 c.疏水键疏水键 d.范德华力范德华力 e.二硫键二硫键多肽链多肽链四、蛋白质的二级结构四、蛋白质的二级结构( () ) 螺旋（螺旋（helixhelix）() 折叠（折叠（-pleated sheet）() 转角（转角（-turn）() 无规则卷曲（无规则卷曲（nonregular coil）蛋白质的二级结构（蛋白质的二级结构（secondary structuresecon

25、dary structure）指肽链指肽链主链不同区段通过自身的相互作用，形成氢键，沿某一主主链不同区段通过自身的相互作用，形成氢键，沿某一主轴盘旋折叠而形成的局部空间结构，是蛋白质结构的构象轴盘旋折叠而形成的局部空间结构，是蛋白质结构的构象单元主要有以下类型：单元主要有以下类型：特征特征：1 1、 每隔每隔3.63.6个个AAAA残残基 螺 旋 上 升 一 圈 ， 螺 距基 螺 旋 上 升 一 圈 ， 螺 距0.540.54nm;nm; 2 、 螺旋体中所有氨基螺旋体中所有氨基酸残基酸残基R侧链都伸向外侧，侧链都伸向外侧，链中的全部链中的全部C=0 和和N-H几几乎都平行于螺旋轴乎都平行于螺

26、旋轴; 3、每个氨基酸残基的、每个氨基酸残基的N-H与前面第四个氨基酸残与前面第四个氨基酸残基的基的C=0形成氢键，肽链上形成氢键，肽链上所有的肽键都参与氢键的形所有的肽键都参与氢键的形成。成。 螺旋（螺旋（helix）形成因素形成因素：与组成和排与组成和排列顺序直接相关。列顺序直接相关。多态性多态性：多数为右手（较稳多数为右手（较稳定），亦有少数左手螺旋存定），亦有少数左手螺旋存在（不稳定在（不稳定）；存在尺寸不同）；存在尺寸不同的螺旋。的螺旋。折叠（折叠（-pleated sheet-pleated sheet）特征特征：两条或多两条或多条伸展的多肽链条伸展的多肽链（或一条多肽链（或一条多

27、肽链的若干肽段）侧的若干肽段）侧向集聚，通过相向集聚，通过相邻肽链主链上的邻肽链主链上的N-HN-H与与C=OC=O之间有之间有规则的氢键，形规则的氢键，形成锯齿状片层结成锯齿状片层结构，即构，即折叠折叠片。片。类别类别：平行平行 反平行反平行 转角（转角（-turn-turn）特 征特 征 ： 多 肽多 肽链 中 氨 基 酸链 中 氨 基 酸残基残基n n的羰基的羰基上 的 氧 与 残上 的 氧 与 残基（基（n+3n+3）的的氮 原 上 的 氢氮 原 上 的 氢之 间 形 成 氢之 间 形 成 氢键 ， 肽 键 回键 ， 肽 键 回折折1801800 0 。 无无规规则则卷卷曲曲示示意意图

28、图无规则卷曲无规则卷曲细胞色素细胞色素C的三级结构的三级结构五、五、 蛋白质的超二级结构和结构域蛋白质的超二级结构和结构域(2) (2) 结构域（结构域（structure domainstructure domain）蛋白质中相邻的二级结构单位（即单个蛋白质中相邻的二级结构单位（即单个螺旋或螺旋或折叠或折叠或转角）组合在一起，形成有规则的、在空间上能辩认的二级结构组转角）组合在一起，形成有规则的、在空间上能辩认的二级结构组合体称为蛋白质的超二级结构合体称为蛋白质的超二级结构基本组合方式基本组合方式：；在二级结构的基础上，多肽进一步卷曲折叠成几个相对独立、近在二级结构的基础上，多肽进一步卷曲折

29、叠成几个相对独立、近似球形的三维实体，再由两个或两个以上这样的三维实体缔合成三级似球形的三维实体，再由两个或两个以上这样的三维实体缔合成三级结构，这种相对独立的三维实体称为结构域。结构，这种相对独立的三维实体称为结构域。 形成意义：形成意义： 动力学上更为合理动力学上更为合理 蛋白质（酶）活性部位往往位于结构域之间，使其更具柔性蛋白质（酶）活性部位往往位于结构域之间，使其更具柔性( () )超二级结构（超二级结构（ supersecondary structuresupersecondary structure ）超二级结构类型超二级结构类型1 2 3 4 5 5 2 3 4 1 -链链 -迂

30、回迂回回形拓扑结构回形拓扑结构回形拓扑结构回形拓扑结构 -迂回迂回卵溶菌酶的三级结构中的两个结构域卵溶菌酶的三级结构中的两个结构域 -螺旋螺旋 -转角转角 -折叠折叠二硫键二硫键结构域结构域1结构域结构域2 丙酮酸激酶结构域丙酮酸激酶结构域4 羧肽酶羧肽酶 腺苷酸激酶腺苷酸激酶 (a) (b) 丙糖磷酸异构酶丙糖磷酸异构酶 乳酸脱氢酶结构域乳酸脱氢酶结构域1黄素蛋白黄素蛋白平行平行 -折叠的结构比较（折叠的结构比较（a） -园桶形排布，（园桶形排布，（b）马蹄形排布马蹄形排布六、六、 蛋白质的三级结构蛋白质的三级结构 多肽键在二级结构的基础上，通过侧链基团的相互多肽键在二级结构的基础上，通过侧

31、链基团的相互作用进一步卷曲折叠，借助次级键维系使作用进一步卷曲折叠，借助次级键维系使螺旋、螺旋、折叠片、折叠片、转角等二级结构相互配置而转角等二级结构相互配置而形成特定的构象形成特定的构象。三级结构的形成使肽链中所有的原子都达到空间上的。三级结构的形成使肽链中所有的原子都达到空间上的重新排布。重新排布。 实例：肌红蛋白实例：肌红蛋白 核糖核酸酶核糖核酸酶肌肌红红蛋蛋白白三三级级结结构构核糖核酸酶三级结构示意图核糖核酸酶三级结构示意图 N His12CHis119Lys41七、蛋白质的四级结构七、蛋白质的四级结构四级结构是指由相同或不同的称作亚基（四级结构是指由相同或不同的称作亚基（subuni

32、tsubunit）的亚单位按照一定排布方式通过非共价键聚合而成的蛋白的亚单位按照一定排布方式通过非共价键聚合而成的蛋白质结构，维持四级结构稳定的作用力是疏水键、离子键、质结构，维持四级结构稳定的作用力是疏水键、离子键、氢键、范德华力。亚基本身都具有球状三级结构，一般只氢键、范德华力。亚基本身都具有球状三级结构，一般只包含一条多肽链，也有的由二条或二条以上由二硫键连接包含一条多肽链，也有的由二条或二条以上由二硫键连接的肽链组成。的肽链组成。 实例：血红蛋白实例：血红蛋白 血红蛋白四级结构血红蛋白四级结构烟草花叶病毒外壳蛋白四级结构的自我组装烟草花叶病毒外壳蛋白四级结构的自我组装第五节第五节 蛋白

33、质的分子结构与功能的关系蛋白质的分子结构与功能的关系一、一、 蛋白质蛋白质一级结构与功能一级结构与功能二、二、 蛋白质蛋白质高级构象与功能高级构象与功能 蛋白质复杂的组成和结构是其多种多样生物学功能的蛋白质复杂的组成和结构是其多种多样生物学功能的基础；而蛋白质独特的性质和功能则是其结构的反映。蛋基础；而蛋白质独特的性质和功能则是其结构的反映。蛋白质一级结构包含了其分子的所有信息，并决定其高级结白质一级结构包含了其分子的所有信息，并决定其高级结构，高级结构和其功能密切相关。构，高级结构和其功能密切相关。 一级结构决定高级结构，一级结构决定高级结构，也决定蛋白质的功能也决定蛋白质的功能1 1、蛋白

34、质一级结构的种属差异与同源性、蛋白质一级结构的种属差异与同源性 实例：细胞色素实例：细胞色素2 2、蛋白质一级结构的变异与分子病、蛋白质一级结构的变异与分子病 实例：血红蛋白质异常病变实例：血红蛋白质异常病变镰刀型贫血镰刀型贫血病3 3、蛋白质前体的激活与一级结构、蛋白质前体的激活与一级结构 实例：胰岛素原的激活实例：胰岛素原的激活 高级构象决定蛋白质的功能高级构象决定蛋白质的功能1 1 、蛋白质高级构象破坏，功能丧失蛋白质高级构象破坏，功能丧失 实例：核糖核酸酶的变性与复性实例：核糖核酸酶的变性与复性2 2 、蛋白质在表现生物功能时，构象发生蛋白质在表现生物功能时，构象发生一定变化（一定变化

35、（变构效应变构效应） 实例：血红蛋白的变构效应和输氧功能实例：血红蛋白的变构效应和输氧功能不同生物与人的不同生物与人的CytcCytc的的AAAA差异数目差异数目生物生物 与人不同的与人不同的AAAA数目数目黑猩猩黑猩猩 0恒河猴恒河猴 1兔兔 9袋鼠袋鼠 10牛、猪、羊、狗牛、猪、羊、狗 11马马 12鸡、火鸡鸡、火鸡 13响尾蛇响尾蛇 14海龟海龟 15金枪鱼金枪鱼 21角饺角饺 23小蝇小蝇 25蛾蛾 31小麦小麦 35粗早链孢霉粗早链孢霉 43酵母酵母 44 不不同同生生物物来来源源的的细细胞胞色色素素c c中中不不变变的的AAAA残残基基14106100134323029271817

36、675952514845413887848280706891GlyGlyPheCysGlyGlyGlyArgLysGlyCysLysPheHisProLeuGlyArgTyrAlaAsnTrpTyr707580LysLysLysProProTyrIleGlyThrMetAsnLeu血红素血红素细胞色素细胞色素c c分子的空间结构分子的空间结构不变不变的的AAAA残基残基 35个不变的个不变的AA残基，是残基，是Cyt C 的生物功能所不的生物功能所不可缺少的。其中有的可能参加维持分子构象；有的可缺少的。其中有的可能参加维持分子构象；有的可能参与电子传递；有的可能参与可能参与电子传递；有的可能参

37、与“识别识别”并结合并结合细胞色素还原酶和氧化酶。细胞色素还原酶和氧化酶。正常红细胞与正常红细胞与镰刀形红细胞镰刀形红细胞的扫描电镜图的扫描电镜图镰刀形镰刀形红细胞红细胞正常红正常红细胞细胞 -链链N端氨基酸排列顺序端氨基酸排列顺序 1 2 3 4 5 6 7 8 Hb-A（正常人）正常人） Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu-Glu-Lys Hb-S（患患 者）者） Val-His-Leu-Thr-Pro-Val-Glu-Lys猪胰岛素原激活成形成胰岛素示意图猪胰岛素原激活成形成胰岛素示意图 核糖核酸酶变性与复性作用核糖核酸酶变性与复性作用Native ribonucleaseD

38、enative reduced ribonucleaseNative ribonuclease8 M urea and -mercapotoethanolDialysis变性变性复性复性血红蛋白输氧功能和构象变化血红蛋白输氧功能和构象变化O2HbHb- O2O2血红蛋白和肌红蛋白的氧合曲线血红蛋白和肌红蛋白的氧合曲线活动肌肉毛细活动肌肉毛细血管中的血管中的PO20 20 40 60 80 100肺泡中的肺泡中的PO2MyoglobinHemoglobin第六节蛋白质的重要性质第六节蛋白质的重要性质一、一、 两性解离性质及等电点两性解离性质及等电点二、二、 蛋白质胶体性质蛋白质胶体性质三、三、

39、蛋白质的沉淀蛋白质的沉淀四、四、 蛋白质的变性与复性蛋白质的变性与复性五、五、 蛋白质的紫外吸收特性蛋白质的紫外吸收特性六、六、 蛋白质呈色反应蛋白质呈色反应 蛋白质两性解离性质和等电点蛋白质两性解离性质和等电点pH = pI 净电荷净电荷=0 pH pI净电荷为负净电荷为负PrCOOHNH3+ + H+ OH- + H+ OH-PrCOO-NH2PrCOO-NH3+ 当蛋白质溶液在某一定当蛋白质溶液在某一定pH值时，使某特定蛋白质分子上所带正负值时，使某特定蛋白质分子上所带正负电荷相等，成为两性离子，在电场中既不向阳极也不向阴极移动，此电荷相等，成为两性离子，在电场中既不向阳极也不向阴极移动

40、，此时溶液的时溶液的pH值即为该蛋白质的值即为该蛋白质的等电点等电点 （isoelectric point，pI）。）。 蛋白质胶体性质蛋白质胶体性质 由于蛋白质分子量很大，在水溶液中形成由于蛋白质分子量很大，在水溶液中形成1-1001-100nmnm的颗的颗粒，因而具有胶体溶液的特征。可溶性蛋白质分子表面分布粒，因而具有胶体溶液的特征。可溶性蛋白质分子表面分布着大量极性氨基酸残基，对水有很高的亲和性，通过水合作着大量极性氨基酸残基，对水有很高的亲和性，通过水合作用在蛋白质颗粒外面形成一层用在蛋白质颗粒外面形成一层水化层水化层，同时这些颗粒带有，同时这些颗粒带有电电荷荷，因而蛋白质溶液是相当稳

41、定的亲水胶体。，因而蛋白质溶液是相当稳定的亲水胶体。 蛋白质胶体性质的应用蛋白质胶体性质的应用 透析法透析法: :利用蛋白质不能透过半透膜的的性质，将含有小分子杂质的蛋利用蛋白质不能透过半透膜的的性质，将含有小分子杂质的蛋白质溶液放入透析袋再置于流水中，小分子杂质被透析出，大分子蛋白质白质溶液放入透析袋再置于流水中，小分子杂质被透析出，大分子蛋白质留在袋中，以达到纯化蛋白质的目的。这种方法称为透析（留在袋中，以达到纯化蛋白质的目的。这种方法称为透析（dialysisdialysis）。）。 盐析法盐析法: :在蛋白质溶液中加入高浓度的硫酸铵、氯化钠等中性盐，可有在蛋白质溶液中加入高浓度的硫酸铵

42、、氯化钠等中性盐，可有效地破坏蛋白质颗粒的水化层。同时又中和了蛋白质表面的电荷，从而使效地破坏蛋白质颗粒的水化层。同时又中和了蛋白质表面的电荷，从而使蛋白质颗粒集聚而生成沉淀，这种现象称为盐析（蛋白质颗粒集聚而生成沉淀，这种现象称为盐析（salting outsalting out）。）。蛋白质的沉淀蛋白质的沉淀 如果加入适当的试剂使蛋白质分子处于等电点状态或如果加入适当的试剂使蛋白质分子处于等电点状态或失去水化层（失去水化层（消除相同电荷，除去水膜消除相同电荷，除去水膜），蛋白质胶体溶），蛋白质胶体溶液就不再稳定并将产生沉淀。液就不再稳定并将产生沉淀。 沉淀方法类别沉淀方法类别: : 1 1

43、、高浓度中性盐（盐析、盐溶）、高浓度中性盐（盐析、盐溶） 2 2、酸碱（等电点沉淀）、酸碱（等电点沉淀） 3 3、有机溶剂沉淀、有机溶剂沉淀 4 4、重金属盐类沉淀、重金属盐类沉淀 5 5、生物碱试剂和某些酸类沉淀、生物碱试剂和某些酸类沉淀 6 6、加热变性沉淀、加热变性沉淀 蛋白质变性与复性蛋白质变性与复性 蛋白质各自所特有的高级结构，是表现其物理性质和化学特性以蛋白质各自所特有的高级结构，是表现其物理性质和化学特性以及生物学功能的基础。当天然蛋白质受到某些物理因素和化学因素的影及生物学功能的基础。当天然蛋白质受到某些物理因素和化学因素的影响，使其分子内部原有的高级构象发生变化时，蛋白质的理

44、化性质和生响，使其分子内部原有的高级构象发生变化时，蛋白质的理化性质和生物学功能都随之改变或丧失，但并未导致其一级结构的变化，这种现象物学功能都随之改变或丧失，但并未导致其一级结构的变化，这种现象称为称为变性作用变性作用（denaturationdenaturation）。）。 表征表征：生物活性丧失；物理性质（溶解度、粘度、扩散系数、光谱特性等）：生物活性丧失；物理性质（溶解度、粘度、扩散系数、光谱特性等）和化学性质（化学反应，被酶解性）改变和化学性质（化学反应，被酶解性）改变 应用应用：变性灭菌、消毒；变性制食品：变性灭菌、消毒；变性制食品 蛋白质的变性作用如果不过于剧烈，则是一种可逆过程

45、，变性蛋白蛋白质的变性作用如果不过于剧烈，则是一种可逆过程，变性蛋白质通常在除去变性因素后，可缓慢地重新自发折叠成原来的构象，恢复质通常在除去变性因素后，可缓慢地重新自发折叠成原来的构象，恢复原有的理化性质和生物活性，这种现象成为原有的理化性质和生物活性，这种现象成为复性复性（renaturationrenaturation）。）。蛋白质主要呈色反应蛋白质主要呈色反应 双缩脲反应双缩脲反应 酚试剂反应酚试剂反应 蛋白质定量、定性蛋白质定量、定性 茚三酮反应茚三酮反应 测定常用方法测定常用方法 双缩脲反应 蛋白质在碱性溶液中也蛋白质在碱性溶液中也能与硫酸铜发生相同反应，能与硫酸铜发生相同反应，产

46、生红紫色络合物产生红紫色络合物红紫色络合物红紫色络合物(碱性溶液碱性溶液)Cu2+蛋白质的紫外吸收光谱蛋白质的紫外吸收光谱 蛋白质在远紫外光蛋白质在远紫外光区（区（200-230200-230nmnm）有较有较大的吸收，在大的吸收，在280280nmnm有有一特征吸收峰，可利用一特征吸收峰，可利用这一特性对蛋白质进行这一特性对蛋白质进行定性定量鉴定。定性定量鉴定。蛋白质质量浓度蛋白质质量浓度/（mg/ml）=1.55A1cm - 0.76A1cm280 260测定范围：测定范围：0.10.5mg/ml蛋白质的分离纯化基本方法一、盐析与等电点沉淀：根据溶解度不同分离；二、离子交换色谱：根据电荷性质不同分离；三、凝胶过滤：根据相对分子量不同分离；四、亲和色谱：根据特异亲和力不同分离；五、高效液相色谱氨基酸的分离一、滤纸色谱：根据溶解度不同进行的分配色谱；二、离子交换色谱：根据电荷性质不同分离(P74)；三、薄层色谱：根据吸附性的不同分离(P75)；四、纸电泳与薄膜电泳：在电场下的快速分离；五、薄层电泳：可用于氨基酸制备的分离(P76)。蛋白质及氨基酸的分析测定一、蛋白质含量测定：常用定氮法、比色法(双缩尿法