凝胶渗透色谱法-有机分离_马志

1、马志分析测试中心材料测试组分析测试中心材料测试组凝胶渗透色谱法凝胶渗透色谱法(GPC) 有机分离分析有机分离分析一、引言二、凝胶渗透色谱法的基本原理三、凝胶色谱仪四、载体和色谱柱五、GPC在测定聚合物分子量及其分布中的应用六、GPC的特殊应用举例七、结语八、参考文献主要内容一、引言 凝胶色谱法是一种新型的液体色谱凝胶色谱法是一种新型的液体色谱 (Gel Permeation Chromatography 简称 GPC) 别名：体积排除色谱别名：体积排除色谱(Size Exclusion Chromatography 简称简称 SEC) 凝胶过滤色谱凝胶过滤色谱(Gel Filtration C

2、hromatography 简称简称GFC)等等。 从分离机理看，使用体积排除色谱从分离机理看，使用体积排除色谱(SEC)较为确切。较为确切。 1964年由年由J. C. Moore首先研究成功首先研究成功 (J. Polym. Sci., Part A: Polym. Chem. 1964, 2(2): 835843) 在总结前人经验的基础上，结合大网状结构离子交换树脂制备的在总结前人经验的基础上，结合大网状结构离子交换树脂制备的 经验，将高交联度聚苯乙烯凝胶用作柱填料，同时配以连续式高灵敏经验，将高交联度聚苯乙烯凝胶用作柱填料，同时配以连续式高灵敏 度的示差折光仪，制成了快速且自动化的高聚

3、物分子量及分子量分布度的示差折光仪，制成了快速且自动化的高聚物分子量及分子量分布 的测定仪，从而创立了液相色谱中的凝胶渗透色谱技术。的测定仪，从而创立了液相色谱中的凝胶渗透色谱技术。 一、引言 主要特点主要特点 操作简便快捷、进样量小、操作简便快捷、进样量小、 数据可靠且重现性好、自动化程度高等。数据可靠且重现性好、自动化程度高等。 应用领域应用领域 应用于聚合物分子量及其分布、聚合物的支化度、共聚应用于聚合物分子量及其分布、聚合物的支化度、共聚 物及共混物的组成、聚合物分级及其结构分析、高聚物中微物及共混物的组成、聚合物分级及其结构分析、高聚物中微 量添加剂的分析等。如果配以在线的绝对分子量

4、检测器（如：量添加剂的分析等。如果配以在线的绝对分子量检测器（如： LALLS、Multi-Angle LS、Dual-Angle LS等），凝胶渗透等），凝胶渗透 色谱可以测定高聚物的绝对分子量。色谱可以测定高聚物的绝对分子量。二、凝胶渗透色谱法的基本原理 当被分析的试样随着淋洗溶剂引入柱子后，溶质分子即当被分析的试样随着淋洗溶剂引入柱子后，溶质分子即向填料内部孔洞扩散。较小的分子除了能进入大的孔外，还向填料内部孔洞扩散。较小的分子除了能进入大的孔外，还能进入较小的孔；较大分子则只能进入较大的孔；而比最大能进入较小的孔；较大分子则只能进入较大的孔；而比最大的孔还要大的分子就只能留在填料颗粒之

5、间的空隙中。因此，的孔还要大的分子就只能留在填料颗粒之间的空隙中。因此，随着溶剂的淋洗，大小不同的分子就得到分离，较大的分子随着溶剂的淋洗，大小不同的分子就得到分离，较大的分子先被淋洗出来，较小的分子较晚被淋洗出来。先被淋洗出来，较小的分子较晚被淋洗出来。 二、凝胶渗透色谱法的基本原理VtV0ViVgVt: 色谱柱总体积色谱柱总体积 V0: 载体的粒间体积载体的粒间体积Vi: 载体内部的空洞体积载体内部的空洞体积 Vg: 载体的骨架体积载体的骨架体积体积排除机理溶剂分子：溶剂分子： V0中的溶剂称为流动相；中的溶剂称为流动相； Vi中的溶剂称为固定相中的溶剂称为固定相高分子：高分子：1) 体积

6、比孔洞尺寸大，淋出体积即为体积比孔洞尺寸大，淋出体积即为V0; ; 2) 体积远小于所有孔洞体积，淋出体积即为体积远小于所有孔洞体积，淋出体积即为V0 +Vi ; 3) 体积中等，淋出体积则大于体积中等，淋出体积则大于V0，小于，小于V0 +Vi.二、凝胶渗透色谱法的基本原理Ve: 溶质的淋出体积；溶质的淋出体积；K : 分配系数分配系数 (孔体积孔体积Vi中可以被溶质分子进入的部分与中可以被溶质分子进入的部分与Vi之比之比) 特别大的溶质分子：特别大的溶质分子：VeV0，K0； 特别小的溶质分子：特别小的溶质分子：VeV0Vi，K1 中等大小的溶质分子：中等大小的溶质分子：V0 Ve V0+

7、Vi，0 K 1VeV0KViK =Ve - ViVi 溶质分子的体积越小，其淋出体积越大。这种解释不考虑溶质溶质分子的体积越小，其淋出体积越大。这种解释不考虑溶质与载体之间的吸附效应以及在流动相和固定相之间的分配效应，其与载体之间的吸附效应以及在流动相和固定相之间的分配效应，其淋出体积仅仅由溶质分子尺寸和载体的孔尺寸决定，分离完全时由淋出体积仅仅由溶质分子尺寸和载体的孔尺寸决定，分离完全时由于体积排除效应所至，故称为于体积排除效应所至，故称为体积排除机理体积排除机理。三、凝胶渗透色谱仪 GPC仪器主要由仪器主要由输液系统输液系统（柱塞泵）、（柱塞泵）、进样器进样器、色谱柱色谱柱、检测系统检测

8、系统（示差折光检测器、多波长（示差折光检测器、多波长UV、FTIR等）及等）及数据采集与处理系统数据采集与处理系统。 三、凝胶渗透色谱仪Waters 1515型凝胶渗透色谱仪四、载体和色谱柱GPC 仪器对载体的要求：仪器对载体的要求： 1.良好的化学稳定性和热稳定性；良好的化学稳定性和热稳定性；2.有一定的机械强度有一定的机械强度 3.不易变形不易变形; 4.流动阻力小流动阻力小 5. 对试样没有吸附作用对试样没有吸附作用 6.分离范围越大越好（取决于孔径分布分离范围越大越好（取决于孔径分布)等等 7.载体的粒度愈小，愈均匀，堆积的愈紧密，色谱柱分离效率愈高。载体的粒度愈小，愈均匀，堆积的愈紧

9、密，色谱柱分离效率愈高。载体是载体是GPC产生分离作用的关键产生分离作用的关键GPC载体的种类：载体的种类： 1.交联聚苯乙烯凝胶交联聚苯乙烯凝胶 2. 多孔性玻璃多孔性玻璃 3. 半硬质及软质填料包括聚乙酸乙烯酯凝胶及聚丙烯酰胺凝胶半硬质及软质填料包括聚乙酸乙烯酯凝胶及聚丙烯酰胺凝胶 4. 木质素凝胶等木质素凝胶等四、载体和色谱柱柱效率柱效率N： 色谱柱的效率可借用色谱柱的效率可借用“理论塔板数理论塔板数”N进行描述。进行描述。 测定测定N的方法：用一种相对分子量均一的纯物质，如邻二氯苯、苯甲醇、的方法：用一种相对分子量均一的纯物质，如邻二氯苯、苯甲醇、乙腈、苯等，作乙腈、苯等，作GPC测定

10、，得到色谱峰，从图上可以求得从样品加入到出现峰测定，得到色谱峰，从图上可以求得从样品加入到出现峰顶位置的淋洗体积顶位置的淋洗体积VR，以及由峰的两侧曲线拐点出作出切线与基线所截得的基，以及由峰的两侧曲线拐点出作出切线与基线所截得的基线宽度即峰底宽线宽度即峰底宽W，然后按照下式进行计算，然后按照下式进行计算N： 评价色谱柱性能的两个重要参数评价色谱柱性能的两个重要参数2)(16WVNR对于相同长度的色谱柱，对于相同长度的色谱柱，N值越大，意味着柱效率越高。值越大，意味着柱效率越高。 式中，式中，V1，V2分别为对应于样品分别为对应于样品1和样品和样品2的两个峰值的淋洗体积；的两个峰值的淋洗体积；

11、W1，W2分分别为峰别为峰1和峰和峰2的峰底宽。的峰底宽。 显然，若两个样品达到完全分离，显然，若两个样品达到完全分离，R应等于或大于应等于或大于1，如果，如果R小于小于1，则分离是，则分离是不完全的。不完全的。2112-2WWVVR分离度分离度R：五、GPC在测定聚合物分子量及其分布中的应用 5.1 聚合物的分子量及分子量分布聚合物的分子量及分子量分布 聚合物分子量聚合物分子量：统计平均分子量：统计平均分子量 假定在某一高分子试样中含有若干中分子量不等的分子，该试样的总假定在某一高分子试样中含有若干中分子量不等的分子，该试样的总质量为质量为w，总摩尔数为，总摩尔数为n，种类数用，种类数用i表

12、示，第表示，第i种分子的分子量为种分子的分子量为Mi，摩尔，摩尔数为数为ni，重量为，重量为wi，在整个试样中的重量分数为，在整个试样中的重量分数为Wi，摩尔分数为，摩尔分数为Ni，则这，则这些量之间存在下列关系：些量之间存在下列关系： 数均分子量数均分子量：以数量为统计权重，定义为：以数量为统计权重，定义为：五、GPC在测定聚合物分子量及其分布中的应用重均分子量重均分子量：以重量为统计权重，定义为：以重量为统计权重，定义为：Z均分子量均分子量：以：以Z值为统计权重，值为统计权重，Zi=wiMi，定义为：定义为：粘均分子量粘均分子量：用稀溶液粘度法测得的平均分子量，定义为：用稀溶液粘度法测得的

13、平均分子量，定义为：五、GPC在测定聚合物分子量及其分布中的应用五、GPC在测定聚合物分子量及其分布中的应用检测器信号检测器信号H：比例于淋出液的浓度；比例于淋出液的浓度；保留体积（淋出体积）：保留体积（淋出体积）：分子尺寸的大小分子尺寸的大小Ve 换算成分子量换算成分子量M，即为分子量分布曲线，即为分子量分布曲线 对于对于GPC来说，级分的含量即是淋出液的浓度。只要选择与溶液浓度来说，级分的含量即是淋出液的浓度。只要选择与溶液浓度由线性关系的某种物理性质，即可通过对其测量以测定溶液的浓度。由线性关系的某种物理性质，即可通过对其测量以测定溶液的浓度。 常用的方法：常用的方法：示差折射仪。示差折

14、射仪。测定出淋出液的折光指数与纯溶剂的折光测定出淋出液的折光指数与纯溶剂的折光指数之差，以表征溶液的浓度。指数之差，以表征溶液的浓度。 此外还有此外还有UV和和IR等各种类型的浓度检测器。等各种类型的浓度检测器。 虽然从谱图已能直观地了解分子量分布的虽然从谱图已能直观地了解分子量分布的某些信息，某些信息，但要定量地得到分子量及分子量分但要定量地得到分子量及分子量分布的数据，还要做一些处理。布的数据，还要做一些处理。 5.2 GPC谱图谱图根据根据GPC分离机理，保留体积分离机理，保留体积(或淋出体积或淋出体积)Ve与分子量之间有线性关系与分子量之间有线性关系 式中：式中：A和和B为常数，其值与

15、溶质、溶剂、温度、载体及仪器结构有关，可由为常数，其值与溶质、溶剂、温度、载体及仪器结构有关，可由分子量淋出体积曲线的直线段的截距和斜率求出。分子量淋出体积曲线的直线段的截距和斜率求出。首先测定一组分子量不同的单分散或窄分布样品（已用其它方法精确确定了首先测定一组分子量不同的单分散或窄分布样品（已用其它方法精确确定了分子量）的淋出体积和分子量的分子量）的淋出体积和分子量的GPC谱图（图谱图（图7-15），然后以），然后以logM对对Ve作图，作图，得到反得到反S形工作曲线（图形工作曲线（图7-16）。工作曲线中间的直线部分就是标定曲线。）。工作曲线中间的直线部分就是标定曲线。log MABVe

16、5.3 分子量淋出体积标定曲线分子量淋出体积标定曲线五、GPC在测定聚合物分子量及其分布中的应用5.4 分子量淋出体积普适标定曲线分子量淋出体积普适标定曲线五、GPC在测定聚合物分子量及其分布中的应用 实际上，对大多数聚合物很难获得窄分布标准样品，由容易获得的阴离子聚合实际上，对大多数聚合物很难获得窄分布标准样品，由容易获得的阴离子聚合的聚苯乙烯的聚苯乙烯(Mw/Mn 1.1)测得的校准曲线，也不能直接用于其他高分子，因为不同测得的校准曲线，也不能直接用于其他高分子，因为不同高分子尽管分子量相同，但体积却不一样。因而必须寻找一个分子结构参数代替分高分子尽管分子量相同，但体积却不一样。因而必须寻

17、找一个分子结构参数代替分子量，希望用这一参数求出的标定关系对所有高分子普遍适用，称为子量，希望用这一参数求出的标定关系对所有高分子普遍适用，称为普适标定普适标定。 根据爱因斯坦（根据爱因斯坦（Einstein）公式）公式 式中：式中：h特性粘数；特性粘数； NA阿伏加德罗常数；阿伏加德罗常数； Vh流体力学体积。流体力学体积。 具有体积的量纲，可当作具有体积的量纲，可当作流体力学体积流体力学体积。不同高分子的。不同高分子的 校准曲线应当相同，大量实验事实已证明了这一点（图校准曲线应当相同，大量实验事实已证明了这一点（图7-177-17）。）。流体力学体积流体力学体积：在聚合物溶液中，高分子链卷

18、曲缠绕成无规线团状，在流动时，在聚合物溶液中，高分子链卷曲缠绕成无规线团状，在流动时，其分子链间总是裹挟着一定量的溶剂分子，所表现出的体积称之为流体力学体积。其分子链间总是裹挟着一定量的溶剂分子，所表现出的体积称之为流体力学体积。5.4 分子量淋出体积普适标定曲线分子量淋出体积普适标定曲线五、GPC在测定聚合物分子量及其分布中的应用若已知一种聚合物的若已知一种聚合物的M1，只须简单计算，就，只须简单计算，就能得到同一保留体积的另一种聚合物的能得到同一保留体积的另一种聚合物的M2。 根据马克公式有根据马克公式有 式中式中K、对每一特定高对每一特定高分子溶剂体系是常数。将此分子溶剂体系是常数。将此

19、两式代入上式，并整理后得到两式代入上式，并整理后得到 5.5 GPC数据处理数据处理5.5.1 单分散试样单分散试样五、GPC在测定聚合物分子量及其分布中的应用 单分散试样分子量均一，不存在分布和平均值问题，可以根单分散试样分子量均一，不存在分布和平均值问题，可以根据据GPC谱图求出谱图求出Ve值，根据标定曲线求得其分子量值，根据标定曲线求得其分子量5.5.2 多分散试样多分散试样五、GPC在测定聚合物分子量及其分布中的应用许多聚合物的许多聚合物的GPC谱图是对称的（图谱图是对称的（图7-19），近似于高斯分布，），近似于高斯分布，可以用正态分布函数来处理，由以下公式计算分子量可以用正态分布函

20、数来处理，由以下公式计算分子量： 式中：式中：Mp峰值分子量，从图中峰值分子量，从图中Vp通过校准曲线求得；通过校准曲线求得；: 校准偏差，等于峰宽校准偏差，等于峰宽W的四分之一；的四分之一；B: 校准曲线的斜率。校准曲线的斜率。 5.5.3 加宽效应的改正加宽效应的改正五、GPC在测定聚合物分子量及其分布中的应用 对于单分散样品，对于单分散样品，GPC谱图理应是一条谱线，但实际上却是一个窄峰。峰加宽谱图理应是一条谱线，但实际上却是一个窄峰。峰加宽效应来源于多流路效应、纵向分子扩散、高分子在凝胶孔洞中的扩散，以及凝胶对效应来源于多流路效应、纵向分子扩散、高分子在凝胶孔洞中的扩散，以及凝胶对试样

21、的吸附作用。加宽效应使高分子的试样的吸附作用。加宽效应使高分子的GPC谱图比实际的分子量分布要宽。谱图比实际的分子量分布要宽。 一种简单的改正方法是把分子量计算值做数值上的修正，即一种简单的改正方法是把分子量计算值做数值上的修正，即 式中 改正前的表观值改正前的表观值 其中其中0为用小分子化合物为用小分子化合物(常用亚甲基蓝等常用亚甲基蓝等)测测定得到的标准偏差，定得到的标准偏差，B的定义同前。的定义同前。 G改正因子，改正因子， 5.5.4 离散型或不对称谱图离散型或不对称谱图五、GPC在测定聚合物分子量及其分布中的应用 将谱峰下的将谱峰下的Ve分成若干等分（如右图），分成若干等分（如右图）

22、， 归一化处理，则各点的重量分数为归一化处理，则各点的重量分数为根据分子量的定义，有根据分子量的定义，有重均分子量重均分子量 数均分子量数均分子量 六、GPC的特殊应用举例 6.1 GPC/LALLS(小角激光光散射小角激光光散射)联用联用 联用：将试样通过联用：将试样通过GPC进行分离，令淋洗液通过进行分离，令淋洗液通过常规的常规的浓度检测器测定其浓度浓度检测器测定其浓度，同时，同时通过通过LALLS仪测量其散射光强仪测量其散射光强。由于浓度和散射光强的信号都是连续测定的，根据需要把淋由于浓度和散射光强的信号都是连续测定的，根据需要把淋洗谱图分割成若干区间，计算每个区间的中均分子量洗谱图分割

23、成若干区间，计算每个区间的中均分子量Mi以及以及相应的浓度相应的浓度Ci，根据这两组数据求出整个试样的分子量分布根据这两组数据求出整个试样的分子量分布曲线，并计算出试样的各种平均分子量及多分散指数。曲线，并计算出试样的各种平均分子量及多分散指数。 将将相对法相对法变成变成绝对法绝对法，不用标样直接测定不用标样直接测定试样的各种平试样的各种平均分子量，并可做扩展效应的校准与改正。均分子量，并可做扩展效应的校准与改正。六、GPC的特殊应用举例 6.2 GPC测定共聚物的组成分布与分子量分布测定共聚物的组成分布与分子量分布 共聚物除了分子量的多分散性以外，还有组成的多分散性。共聚物除了分子量的多分散

24、性以外，还有组成的多分散性。分子量分布和组成分布都是影响共聚物产品性能的重要因素。分子量分布和组成分布都是影响共聚物产品性能的重要因素。共聚物组成分布研究的常规方法：共聚物组成分布研究的常规方法： 首先利用交叉分级法将待测试样分成很多级分，然后再借首先利用交叉分级法将待测试样分成很多级分，然后再借助于光谱、核磁共振谱、气相色谱等分析方法测定各个级分的助于光谱、核磁共振谱、气相色谱等分析方法测定各个级分的组成。组成。缺点：缺点：实验耗时长，分级效果不佳，所得级分的分子量和组成实验耗时长，分级效果不佳，所得级分的分子量和组成都不是单分散的，因此测得的组成也只是每个级分的平均值。都不是单分散的，因此

25、测得的组成也只是每个级分的平均值。六、GPC的特殊应用举例 6.2 GPC测定共聚物的组成分布与分子量分布测定共聚物的组成分布与分子量分布共聚物组成分布研究的共聚物组成分布研究的GPC方法方法优点优点：分析时间大大缩短，分离效率得到提高。：分析时间大大缩短，分离效率得到提高。 将将GPC配以光谱、核磁共振等方法，或直接再配以光谱、核磁共振等方法，或直接再GPC中使用双检中使用双检测器，如示差折光仪测器，如示差折光仪/紫外吸收光谱，示差折光仪紫外吸收光谱，示差折光仪/红外吸收光谱，就红外吸收光谱，就可以快速而细致地同时测定共聚物的组成分布和分子量分布。可以快速而细致地同时测定共聚物的组成分布和分

26、子量分布。举例：丁二烯苯乙烯共聚物举例：丁二烯苯乙烯共聚物UV检测器检测器 l=260 nm：用以测定含苯环的聚苯乙烯链段的浓度用以测定含苯环的聚苯乙烯链段的浓度RI示差折光仪：示差折光仪：对两组分都有响应，但灵敏度不同。对两组分都有响应，但灵敏度不同。六、GPC的特殊应用举例 6.3 GPC在高分子涂料中的应用在高分子涂料中的应用 样品在做凝胶色谱前，需要除去样品中的粉质和溶剂。常用溶剂去除方法样品在做凝胶色谱前，需要除去样品中的粉质和溶剂。常用溶剂去除方法有室温自然干燥法和红外灯干燥。对一些和氧气有反应的树脂如醇酸树脂，使有室温自然干燥法和红外灯干燥。对一些和氧气有反应的树脂如醇酸树脂，使

27、用红外灯干燥时需要使用氮气保护，某些受热易自聚的树脂只能使用自然干燥用红外灯干燥时需要使用氮气保护，某些受热易自聚的树脂只能使用自然干燥的方法除去溶剂。如果溶剂与树脂的峰图不产生重叠干扰也可以不用干燥直接的方法除去溶剂。如果溶剂与树脂的峰图不产生重叠干扰也可以不用干燥直接进样分析。进样分析。 醇酸树脂醇酸树脂是涂料中用量最大的树脂材料。分为长油型、中油型、短油型。是涂料中用量最大的树脂材料。分为长油型、中油型、短油型。不同的涂料品种有不同的分子量要求。因此凝胶色谱技术作为涂料工业的一个不同的涂料品种有不同的分子量要求。因此凝胶色谱技术作为涂料工业的一个重要质量控制设备要被广泛使用。其中长油型主

28、要用于自干性清漆，一般需要重要质量控制设备要被广泛使用。其中长油型主要用于自干性清漆，一般需要有较高的分子量，干燥时容易成膜，重均分子量可达十几万，分布宽度长达有较高的分子量，干燥时容易成膜，重均分子量可达十几万，分布宽度长达20以上。另外两种型号一般分子量及其分布都要小一些。以上。另外两种型号一般分子量及其分布都要小一些。 此外许多其它可以利用凝胶色谱进行分析的高分子涂料还有：环氧树脂、此外许多其它可以利用凝胶色谱进行分析的高分子涂料还有：环氧树脂、氨基树脂、丙烯酸树脂、脲醛树脂、醋酸纤维素、不饱和树脂、聚氨酯固化剂、氨基树脂、丙烯酸树脂、脲醛树脂、醋酸纤维素、不饱和树脂、聚氨酯固化剂、丙烯

29、酸乳液等。丙烯酸乳液等。六、GPC的特殊应用举例 6.4 GPC在农药残留分析中的应用在农药残留分析中的应用 为提高粮食生产率，使用农药进行植物保护是必不可为提高粮食生产率，使用农药进行植物保护是必不可少的重要手段。施用于作物上的农药虽有部分降解，但仍少的重要手段。施用于作物上的农药虽有部分降解，但仍然有部分残留农药最终以食物等方式进入人、畜体内，造然有部分残留农药最终以食物等方式进入人、畜体内，造成人、畜的农药中毒，严重的甚至会危机生命。农产品安成人、畜的农药中毒，严重的甚至会危机生命。农产品安全问题成为影响农产品市场竞争力的主要因素。全问题成为影响农产品市场竞争力的主要因素。 开发建立符合

30、国际标准、快速、可靠、灵敏和实用的开发建立符合国际标准、快速、可靠、灵敏和实用的农药残留分析技术用于控制农药残留，保证食品安全和避农药残留分析技术用于控制农药残留，保证食品安全和避免国际间有关贸易争端，成为国内外实验室研究的重点。免国际间有关贸易争端，成为国内外实验室研究的重点。六、GPC的特殊应用举例 6.4 GPC在农药残留分析中的应用在农药残留分析中的应用 农药残留分析包括样品农药残留分析包括样品预处理预处理(提取提取、浓缩浓缩和和净化净化)和和检测检测两部分。两部分。 预处理过程将有利于净化在样品中存在的、会干扰或阻碍残留农药分预处理过程将有利于净化在样品中存在的、会干扰或阻碍残留农药分析的大量杂质，提高色谱检测分析的分离度、重现性和准确度；同时，预析的大量杂质，提高色谱检测分析的分离度、重现性和准确度；同时，预处理还能富集浓缩样品，使样品中含量过低的待测组分达到色谱仪的最低处理还能富集浓缩样品，使样品中含量过低的待测组分达到色谱仪的最低检测限。检测限。 预处理过程中的净化方法主要有液液分配、柱层析净化、吹扫蒸馏预处理过程中的净化方法主要有液液分配、柱层析净化、吹扫蒸馏法、磺化法、凝结剂沉淀法、低温冷冻法等。传统的方法存在很多局限性，法、磺化法、凝结剂沉淀法、低温冷冻法等。传统的方法存在很多局限性，如使用大量溶剂，样品处理步骤复杂，操作费时费