微生物检测技术作业--生物芯片

1、1.定义定义 生物芯片生物芯片(biochip)是采用光导原位合成或微量点样等方法，将大量生物大分子生物大分子，如核酸片段、多肽分子、细胞，甚至组织切片等生物样品有序地固化于支持物支持物的表面，组成密集的二维分子排列，然后与已标记的待测生物样品中的靶分子进行杂交，通过特定的仪器对杂交信号的强度进行快速、并行、高效地检测分析，从而判断样品中靶分子的数量及质量。 由于这种技术通常采用玻片或硅片作为固相支持物，且在制备过程中模拟计算机芯片的制备方法，所以称之为生物芯片技术生物芯片技术。 常用的固相支持物：硅片、玻璃片、塑料片、凝胶、尼龙膜等 检测仪器：激光共聚焦扫描仪或电荷偶联摄影像机等2.分类分类

2、 根据芯片上固定的探针不同探针不同，分为：基因芯片、蛋白质芯片、细胞芯片和组织芯片； 根据芯片的工作原理工作原理，分为：元件型微阵列芯片、通道型微阵列芯片和生物传感芯片； 根据制作过程制作过程，分为：原位合成芯片和合成点样法制作的芯片。2.分类分类总的来说，生物芯片技术包括三大领域： 基因芯片基因芯片 蛋白质芯片蛋白质芯片 芯片实验室芯片实验室3.生物芯片的工作原理生物芯片的工作原理 3.1 基因芯片基因芯片基本原理基本原理：将大量寡核苷酸分子固定于支持物上，然后与标记的样品进行杂交，通过检测杂交信号的强弱进而判断样品中靶分子的数量和质量。图3-1 基因芯片3.1 基因芯片基因芯片 成千上万网

3、格状密集排列的基因探针，通过已知碱基顺序的DNA片段来结合碱基互补序列的单链DNA，从而确定相应的序列，通过这种方式来识别异常基因或其产物等。 基因芯片使合成和固定高密度的数以万计的探针分子以及对杂交信号进行实时、灵敏、准确地检测分析变得切实可行。3.1 基因芯片基因芯片 基因芯片按照用途可分为三类：测序芯片测序芯片、表表达芯片达芯片和比较芯片比较芯片（诊断芯片诊断芯片）。 其中，测序芯片测序芯片出现的最早，研究的最多，主要用于测序研究。3.1.1 测序芯片的基本工作原理：测序芯片的基本工作原理： 在测序芯片上，5个碱基组成的共451024个所有可能序列均通过末端附着于芯片表面上。待测序的样品

4、样品DNA和一组标记的核苷酸五聚体组标记的核苷酸五聚体（标记探针）以及连接酶连接酶一同在芯片上温育。芯片测序流程图芯片测序流程图芯片测序流程图芯片测序流程图 1024X1024=1048754 最终的序列可通过软件根据探针的重叠而读出来。3.1.2 其他两种基因芯片其他两种基因芯片 表达芯片表达芯片：这种芯片是通过测量特定基因的mRNA的量来推断基因的表达活性的，所以芯片的碱基序列是特异的。杂交的结果必须同阳性对照进行比较才能最终确定。 比较芯片比较芯片(诊断芯片)：这种类型的芯片主要应用于基因组的比较中。采用这种芯片可以检查基因的失常水平。3.2 蛋白质芯片蛋白质芯片 基本原理基本原理：蛋白

5、质芯片, 是指以蛋白质分子蛋白质分子作为配配基基,将其有序地固定在固相载体的表面形成微阵列；用标记了荧光的蛋白质或其他它分子与之作用，洗去未结合的成分，经荧光扫描等检测方式测定芯片上各点的荧光强度，来分析蛋白之间或蛋白与其它分子之间的相互作用关系。3.2.1 蛋白质芯片的分类蛋白质芯片的分类按照制作方法和用途，蛋白质芯片可分为两类：蛋白质检测芯片蛋白质检测芯片 蛋白质功能芯片蛋白质功能芯片3.2.1.1 蛋白质检测芯片蛋白质检测芯片 蛋白质检测芯片，蛋白质检测芯片，是将具有高度亲和特异性的探针分子固定在基片上，用以识别复杂生物样品中的目标多肽，当放射性同位素或荧光标记的靶分子与芯片上的探针分子

6、结合后，通过检测信号的强度，从而判断样品中靶分子的数量。3.2.1.2 蛋白质功能芯片蛋白质功能芯片 蛋白质功能芯片蛋白质功能芯片是研究蛋白质间、蛋白质修饰、 DNA- 蛋白质间、 RNA- 蛋白质间、蛋白质与脂质、蛋白质与药物、酶与底物、小分子蛋白质等相互作用的芯片。它是将所研究体系中的每种天然蛋白质点加在基片上制成芯片 , 用于天然蛋白质活性及分子亲和性的高通量平行研究。3.2.2 蛋白质芯片的工作流程蛋白质芯片的工作流程以抗体芯片为例以抗体芯片为例抗体芯片工作流程：抗体芯片工作流程： 从样品中抽提蛋白质 用荧光染料分别标记蛋白质 (direct labeling, paired Ab s

7、andwich assay). 洗涤去掉未结合的染料 与蛋白芯片反应 扫描，分析结果两种标记方法两种标记方法直接标记直接标记Direct Labeling 双抗体夹心法双抗体夹心法 Dual Antibody Sandwich 直接标记直接标记Direct Labeling 样本中所有的蛋白都用荧光或者生物素biotin进行标记 优点：优点： 对于每个靶蛋白只需要一个特异性的抗体，可检测那些只有一个抗体的靶蛋白 缺点缺点: 检测灵敏度的下降和数据准确性的下降 标记位点可能严重改变抗原结合位点，导致抗原 抗体结合位点的破坏 双抗体夹心法双抗体夹心法 Dual Antibody Sandwich

8、抗体点在芯片上，捕捉抗原底物后，再加入检测抗体 ，后续加入每个抗体与点于芯片上的抗体是一一对应关系，即对应着同一个抗原。 优点优点: 通过两个特异性抗体与抗原的结合，提高了特异性，因而夹心法比直接标记法更灵敏 缺点缺点: 可能导致交叉反应和抗体的沉淀 ELISA 方法检测抗体芯片结果：方法检测抗体芯片结果： The Enzyme-Linked Immunoab Sorbent Assay 是经典的用于检测样品中抗原抗体结合的方法。ELISA技术在抗原或抗体上结合了酶反应基团。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，由此进行定性或定量分析。 DNA芯片

9、与蛋白芯片最大的区别是靶分子和探针芯片与蛋白芯片最大的区别是靶分子和探针分子的结构差异分子的结构差异 相对于DNA 芯片, 蛋白质芯片技术面临更多困难。 蛋白质之间的相互作用的变化性更强。 相对于PCR 技术这样可以大量扩增DNA 的技术, 尚未有可以大量扩增蛋白质的成熟技术。 蛋白质的表达和纯化工作十分艰巨, 而且经常不能保持蛋白质的完整功能。 许多蛋白质很不稳定。3.2.3 捕获分子捕获分子捕获分子对于开发特异、敏感的蛋白芯片至关重要。捕获分子对于开发特异、敏感的蛋白芯片至关重要。 理想的捕获分子应具有下列特点理想的捕获分子应具有下列特点 : 对靶分子有高度的特异性和亲和力 ; 容易进行生

10、产和操作 ; 具有可利用的大分子文库用来建立高度密集的微阵列 ; 如果困难可以实现信号放大作用。主要的捕获分子主要的捕获分子： 抗体 适配体（寡聚核苷酸） 多肽与肽样寡聚体 小分子配体 重组蛋白3.3 芯片实验室芯片实验室(lab-on-a-chip)芯片实验室芯片实验室为高度集成化的集样品制备、基因扩增、核酸标记及检测为一体的便携式生物分析系统，它最终的目的是实现生化分析全过程均集成在一片芯片上完成，从而使现有的许多繁琐、费时、不连续、不精确和难以重复的生物分析过程自动化、连续化和微缩化，是未来生物芯片发展的最终目标。 现在已有由加热器、微泵、微阀、微流量控制器、微电极、电子化学和电子发光探

11、测器等组成的芯片实验室问世，并出现了将生化反应、样品制备、检测和分析等部分集成的生物芯片。 总结：芯片实验室特点总结：芯片实验室特点 高度集成化的集样品制备、基因扩增、核酸标记及检测为一体的便携式生物分析系统。 实现生化分析全过程集成在一片芯片上完成，从而使生物分析过程自动化、连续化和微缩化。 芯片实验室是生物芯片技术发展的最终目标。 芯片实验室的操作流程芯片实验室的操作流程 分子层面的单元操作主要包括进样、样品处理、混进样、样品处理、混合、反应及分离合、反应及分离。 进样进样：利用芯片平台处理样品，需要将样品引入芯片的样品处理通道或通道网络，该步骤通常称为进样。进样通常又可分为上样和取样两个

12、步骤。芯片实验室处理的对象一般是流体。 混合混合：混合是一个物理过程，其目的是实现参与过程的不同组分的均一分布。溶质混合有两种机理：一种为对流传质，另一种为扩散传质。 反应反应：利用微反应器进行，微反应器利用微芯片反应技术，其优点是可通过并行单元来实现柔性生产、规模放大、快速和高通量筛选等。 分离分离：电泳是芯片微分离中采用最为普遍的一种形式，芯片电泳的分离模式多种多样，如区带电泳、胶束电动芯片电泳、介电电泳及电色谱等。以电泳分离为主体的分离技术，在整个芯片平台技术的研究中占有特殊的地位。4.生物芯片的应用生物芯片的应用 4.1 基因芯片的应用 4.1.1.感染性疾病的诊断 在生物芯片发展之前

13、：形态学形态学的观察及血清学血清学的生化分析相互配合； 缺点缺点：耗时、花费许多人力和成本 基因芯片基因芯片：同时观察许多基因的表达，获得的基因表达样式与数据库中的样式做比对，就可以准确地分析出造成感染性疾病的微生物种类。 例：发烧芯片例：发烧芯片 发烧芯片发烧芯片是一块包含400个寡核苷酸的芯片，以一群特殊设计的寡核苷酸片段为探针，29种常见的病原菌可以在发烧芯片上显出各自特有的基因表达式样，再与数据库建立的式样比对后，就可达到快速鉴定感染性病原菌的目的。4.1.2. 16S rDNA和和23S rDNA作为探针来源作为探针来源 核糖体是细菌惟一的细胞器，是蛋白质合成的场所 编码rRNA的基

14、因是按16S-23S-5S的顺序排列的，并由两个非编码区分开 16S rDNA和23S rDNA的保守区对真细菌界的所有细菌均具有同源性，所以要满足能够检测出所有病原菌的需要，可以在此区选择合适的探针和引物。 16S rDNA在科、属、种间的变异程度不同，可以根据需要设计细菌不同阶元的特异性引物和探针。例例1： 4小时以内便可检测和识别病原微生物的方法小时以内便可检测和识别病原微生物的方法 该方法的具体过程是： 使用随机引物通过PCR法扩增法扩增细菌的核糖核糖23S rDNA 将扩增产物与含有特定寡核苷酸探针的芯片进行杂杂交交，然后通过检测系统来检测检测。 利用该法对158例经血培养鉴定为阳性

15、的样品进行检测，结果125份样品(79.7)呈阳性，在所有未检出样品中，9例为芯片上无对应探针，16例为PCR扩增无扩增产物出现，另外8例中，有7例虽然经常规方法鉴定为金黄色葡萄球菌，但随后它们不能进一步被证实，只有一例经分离得到金黄色葡萄球菌，被错误地鉴定为凝固酶阴性葡萄球菌。 例例2：在未知标本中快速检测：在未知标本中快速检测6种立克次体的方法种立克次体的方法 该方法针对每种立克次氏体16S rDNA的可变区，分别设计和合成4条寡核苷酸探针，利用微阵列技术构建立克次氏体检测用生物芯片。 待测立克次氏体染色体DNA用16S rDNA通用引物扩增掺入荧光素，然后与芯片杂交，利用各种立克次氏体的

16、6条特异性探针是否全部出现杂交信号来做出判断。 结果表明以寡核苷酸为探针的生物芯片系统可以实现6种立克次氏体的检测。4.2 蛋白质芯片的应用蛋白质芯片的应用例：利用蛋白质芯片检测例：利用蛋白质芯片检测SARS病毒病毒 在直径约1左右、镶嵌在一个个小方格中的半明半暗小圆球组可以测出SARS病毒抗体，它就是检测抗SARS病毒抗体的蛋白质芯片。该蛋白质芯片的检测系统，包含N蛋白、E蛋白、S蛋白等SARS病毒抗原以及相应的配套对照蛋白。 用该蛋白质芯片对150例正常人和52例SARS病人的血清进行了检测，在95的SARS病人血清样品内发现了针对病毒的抗体，而血清中发现了抗体说明被测人已经感染了SARS

17、病毒。150例正常人未发现这一现象。 在对SARS病毒全基因序列分析的基础上，克隆了10个基因，并对其中的5个基因进行了蛋白质表达，通过筛选发现，其中3个蛋白质能与SARS病人血清发生特异性抗原抗体反应。 通过已建立的蛋白质芯片制备技术平台，用筛选的抗原，研制出了SARS病毒多抗体检测蛋白质芯片。 SARS病毒多抗体检测蛋白质芯片，可同时对SARS病毒5种抗原的抗体进行检测，并可同时检测IgG和IgM两类抗体，每种抗体可同时重复检测4次。 以上设计不仅使诊断结果更加准确，而且使该芯片具有取样微量、稳定性好、灵敏度高、平行检测、结果可量化显示等特点。 SARS病毒抗体检测蛋白质芯片，除了可用于对临床SARS病人的筛选和确诊，还可用于研究SARS病毒编码蛋白质的抗原性、抗体产生特点及规律、疾病转归的分子机理研究、疫苗的评价以及分子流行病学的调查。 除了蛋白质芯片外，还有内置多种“非典”冠状病毒基因序列的基因芯片。新的微探针涉及“非典”冠状病毒的29700个DNA碱基对序列。5.生物芯片技术的研究方向及当前面临的困难生物芯片技术的研究方向及当前面临的困难 尽管基因芯片技术已经取得了长足的发展，但仍然存在着许多难以解决的问题，例如技