肿瘤分子检测与质量控制课件

1、.深圳市人民医院病理科分子实验室 姜阳阳2015-10-27肿瘤分子检测方法与质量控制肿瘤分子检测方法与质量控制.医学发展历程的启示医学发展历程的启示经验医学经验医学循证医学循证医学精准医学精准医学诊断靠治疗后期经验积累。诊断治疗以人群、科学研究证据指导临床实践。诊断治疗以个体为基础，更加提前、具体与精确。分子时代分子时代.腺癌腺癌鳞癌鳞癌21%25%36%7.8%3.3%2.6%2.2%0.8%0.7%0.7%0.1%肺腺癌：肺腺癌：EGFRKRASBRAFALK-ROS1RET等检测已是共识；等检测已是共识；肺鳞癌发生模式不同，检测靶标以扩增为主，同时肺鳞癌发生模式不同，检测靶标以扩增为主

2、，同时EGFR、ALKROS1某些病例也有必要检测某些病例也有必要检测。.我们可以用的分子生物学手段：实时荧光PCR方法（扩增阻碍突变系统法（Amplification Refractory Mutation System，ARMS）、PCR-高分辨溶点曲线分析（HRM）、数字PCR等）PCR-杂交法（膜上、芯片基因芯片 、乳胶颗粒Luminex）PCR-Sanger测序PCR-焦磷酸测序新一代高通量测序新一代高通量测序PCR-SSCP、RFLP、dHPLC等荧光原位杂交（荧光原位杂交（FISH）直接杂交免疫组化免疫组化.分子病理检测的主要方法分子病理检测的主要方法基因突变基因突变(SNPs)

3、拷贝数改变拷贝数改变(Copy Number Variation, CNV)基因重排基因重排（Gene rearrangement)检测技术检测技术蛋白蛋白(质质)表达表达(Protein expression)免疫组织化学（免疫组织化学（IHC）基因表达基因表达(mRNA/RNA expression）反转录反转录+荧光定量荧光定量PCR（RT-qPCR)FISHDNA sequencing， ARMS检测对象检测对象检测基因检测基因检测水平检测水平EGFR，KRAS，BRAF，BRCA, BCR-ABL，JAK2EML4-ALK，ROS1，HER2，RETBRCA1，TOP2A，TYMSE

4、GFR，EML4-ALK，HER2. 是RT-PCR平台上的特异扩增技术（易开展易开展） 共发表300多篇文献 著名的大型临床研究大型临床研究 - 如IPASS、INFORM等国际肺癌协会专家共识国际肺癌协会专家共识中国基因突变检测专家共识中国基因突变检测专家共识日本临床专家共识日本临床专家共识IPASSINFORM大型临床研究所采用大型临床研究所采用ARMS技术技术被临床证明的肿瘤基因突变检测技术被临床证明的肿瘤基因突变检测技术.DNA 基因重排基因重排融合融合mRNA或或5/3 mRNA差异表达差异表达嵌合蛋白表达嵌合蛋白表达肺癌中肺癌中ALKALK基因变异的表达调控基因变异的表达调控FI

5、SH/CISH NGSRT-PCR 5/3比较比较qRT-PCRRACE-PCRIHC.荧光原位杂交技术（荧光原位杂交技术（FISH）2个信号分离直径的要求，使实际应用中结果难以判断个信号分离直径的要求，使实际应用中结果难以判断有有5-11%出现假阳性信号分离出现假阳性信号分离1，2，3工作强度大，费时工作强度大，费时主观性强，受人为因素影响大主观性强，受人为因素影响大横向横向纵向纵向1. FISH技术是技术是美国美国药物临床试验中所采用的检测方法。药物临床试验中所采用的检测方法。2. 采用采用“分离分离”分析，基因倒位和分析，基因倒位和ALK重排后，红色和绿色探针分开重排后，红色和绿色探针分

6、开3. 15%的样本细胞中呈现分开的红色和绿色信号表示阳性结果的样本细胞中呈现分开的红色和绿色信号表示阳性结果1.p 操作简单，时间短操作简单，时间短p 结果客观，易于判读，减少人为因素的影响结果客观，易于判读，减少人为因素的影响p 除除FFPE样本外，还适用其他类型样本组织样本外，还适用其他类型样本组织1p 与与EGFR、RET、ROS1等其他检测不冲突，共用相同组织切片和等其他检测不冲突，共用相同组织切片和PCR扩增程序，扩增程序，节约有限资源和时间节约有限资源和时间p 中国荧光中国荧光PCR仪器普及率更高，更加适合国情仪器普及率更高，更加适合国情NTCPCFusionSample实时逆转

7、录法（实时逆转录法（Real Time-PCR）.CFDA批准的基因检测产品批准的基因检测产品项目项目EGFRALKROS1ALK/ROS1IHCFISHReal Time-PCR基于基于Real Time-PCR方法检测驱动基因的分子诊断产品方法检测驱动基因的分子诊断产品获得获得CFDA批准最多批准最多.p2-3 片片FFPE样品样品p同时将同时将DNA和和RNA分离出来分离出来p同时获得同时获得EGFR、ALK和和ROS1检测结果检测结果节约样本、节约时间、节约成本DNA/RNAEGFR突变型ALK阳性或ROS1阳性EGFR野生型ALK阴性ROS1阴性吉非替尼厄洛替尼埃克替尼阿法替尼克唑替

8、尼色瑞替尼其他治疗方式DNA/RNA共分离剂盒共分离剂盒EGFR/ALK+ROS12.5小时小时PCR4.5小时小时FFPE切片1-3片片或活检小标本活检小标本.2015 NSCLC NCCN指南指南对于NSCLC患者建议检测EGFR和ALK基因状态；对于ROS1/MET/RET/BRAF/ HER2等崭露头角的靶基因也给予关注.1.室内质量控制2.室间质量评价分子病理实验室的质量控制分子病理实验室的质量控制.1.建立标准化的实验室2.具备资质且相对固定的人员3.性能稳定的试剂4.持续不断的学习和开展质控.医疗机构临床基因扩增检验室管理办法（卫办医政发医疗机构临床基因扩增检验室管理办法（卫办医

9、政发2010194号）号）医疗机构临床基因扩展检验实验室工作导则医疗机构临床基因扩展检验实验室工作导则（卫办医政发（卫办医政发2010194号）号）.试剂准备区试剂准备区空气流向空气流向标本制备区标本制备区空气流向空气流向扩增区扩增区空气流向空气流向产物分析区产物分析区空气流向空气流向缓冲间缓冲间缓冲间缓冲间缓冲间缓冲间缓冲间缓冲间 工作走向工作走向 .FISHFISH实验区实验区.临床基因扩增实验室标准化操作文件（sop）1.写你所做2.做你所写3.实验室的精髓可操作性的可操作性的sopsop文件文件.人员资质人员资质.理想的试剂理想的试剂l试剂方法的性能验证及每批试剂的质检l性能指标： 重

10、复性（精密度）重复性（精密度） 准确性（定量：回收率、标准物质等；定性：方法学比较等） 线性范围（定量） 分析特异性 测定下限测定下限 抗干扰能力抗干扰能力. 资质认证资质认证 试剂质量试剂质量试剂反应性能前后批号结果一致性测定下限批内变异（10%)和批间变异（15-25%).你其实做了这些，但是你有记录么？1.日常维护2.定期保养3.维修记录实验室最忠实的员工-仪器.全流程：标本接收全流程：标本接收- -石蜡切片石蜡切片- -核酸提纯核酸提纯- -实时实时荧光定量荧光定量PCRPCR扩增扩增- -结果分析结果分析分析前：标本接收、制片、填写检测申请单分析前：标本接收、制片、填写检测申请单分析

11、中：核酸提取、扩增、产物分析、检测分析中：核酸提取、扩增、产物分析、检测有效性判断有效性判断分析后：结果分析、报告审核、结果解释分析后：结果分析、报告审核、结果解释标准：重复，可控，规范标准：重复，可控，规范全流程室内质控. 组织蜡块 切片 病理学评估病理学评估 核酸纯化 实验/数据DNA模板质量质量更重要，建议对提取的DNA模板进行质量检测： OD260/OD280=1.80.2， OD260/OD2301.7全流程室内质控.检查设定参数检查设定参数平台期平台期背景荧光背景荧光阈值线阈值线设定阈值设定阈值检查对照组及内外控曲线情况检查对照组及内外控曲线情况阳性质控品阳性质控品突变样本突变样本突变分析突变分析.RNARNA制备制备 逆转录逆转录 选用选用CFDA认证认证的检测试剂的检测试剂认证的核酸认证的核酸抽提试剂抽提试剂病理小样本病理小样本中性福尔马林中性福尔马林组织保护液组织保护液快速低温放置快速低温放置微量紫外分光微量紫外分光光度计