高中生物《12基因工程的基本操作程序》 新人教版选修3

1、1.2 基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序原核细胞的基因结构原核细胞的基因结构非编码区非编码区非编码区非编码区编码区编码区编码区上游编码区上游 编码区下游编码区下游 与与RNARNA聚合酶结合位点聚合酶结合位点启动子启动子终止子终止子编码区编码区： 能转录，编码蛋白质能转录，编码蛋白质非编码区：非编码区： 不编码蛋白质不编码蛋白质, ,能调控遗传信息表达能调控遗传信息表达真核细胞的基因结构真核细胞的基因结构编码区编码区非编码区非编码区非编码区非编码区启动子启动子终止子终止子编码区上游编码区上游 编码区下游编码区下游 内含子内含子 外显子外显子 与与RNARNA聚合酶聚合酶结合位点结合

2、位点编码区编码区：非编码区：非编码区：外显子：外显子： 内含子：内含子： 能编码蛋白质的序列能编码蛋白质的序列不能编码蛋白质的序列不能编码蛋白质的序列非编码区非编码区非编码区非编码区编码区编码区RNA聚合酶聚合酶结合位点结合位点外显子外显子内含子内含子终止子终止子启动子启动子原原核核真真核核基因的结构基因的结构原核细胞原核细胞真核细胞真核细胞不同点不同点编码区是编码区是_的的编码区是间隔的、编码区是间隔的、_的的相同点相同点都由能够编码蛋白质的都由能够编码蛋白质的_和具和具有调控作用的有调控作用的_区组成的区组成的 基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序 目的基因主要是指目的基因主要是指

3、_编码蛋白质的基因编码蛋白质的基因供体生物细胞供体生物细胞取出取出DNADNA用限制酶剪用限制酶剪去多余部分去多余部分目的基因目的基因即：将需要的基因从供体生物细胞内提取出来即：将需要的基因从供体生物细胞内提取出来目前被广泛提取使目前被广泛提取使用的目的基因有：苏用的目的基因有：苏云金杆菌抗虫基因、云金杆菌抗虫基因、植物抗病基因植物抗病基因人胰岛人胰岛素基因等。也可以是素基因等。也可以是一些具有调控作用的一些具有调控作用的因子因子l 从基因文库中获取目的基因从基因文库中获取目的基因1.1.什么是基因文库？什么是基因文库？2.2.怎样从基因文库中得到我们所需的目的基因？怎样从基因文库中得到我们所

4、需的目的基因？种类：种类：基因组文库：基因组文库：部分基因文库：部分基因文库：( (如如cDNAcDNA文库文库) )基因的核苷酸序列等基因的核苷酸序列等l 利用利用PCRPCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因l 人工合成人工合成 含有一种生物的含有一种生物的全部全部基因基因含有一种生物的含有一种生物的部分部分基因基因根据基因的有关信息：如基因的转录产物根据基因的有关信息：如基因的转录产物mRNAmRNA1.1.用一定的用一定的_切割切割 质粒，使其出现一个切质粒，使其出现一个切 口，露出口，露出_。2.2.用用_切断目切断目 的基因，使其产生的基因，使其产生_ _ _。 核心核心3.3.将切

5、下的目的基因片段插入质粒的将切下的目的基因片段插入质粒的_处，处， 再加入适量再加入适量_，形成了一个重组，形成了一个重组 DNA DNA分子（重组质粒）分子（重组质粒）限制酶限制酶黏性末端黏性末端同一种限制酶同一种限制酶的黏性末端的黏性末端切口切口DNADNA连接酶连接酶相同相同( (二二) )基因表达载体的构建基因表达载体的构建质粒质粒DNADNA分子分子限制酶处理限制酶处理一个切口一个切口两个黏性末端两个黏性末端两个切口两个切口获得目的基因获得目的基因DNADNA连接酶连接酶重组重组DNADNA分子（重组质粒）分子（重组质粒） 核心核心同一种同一种( (二二) )基因表达载体的构建基因表

6、达载体的构建4.4.过程过程: : 科学家在培育抗虫棉时，经过了许多复杂的科学家在培育抗虫棉时，经过了许多复杂的过程和不懈的努力，才获得成功。过程和不懈的努力，才获得成功。 起初把苏云金芽孢杆菌的抗虫基因插入载体起初把苏云金芽孢杆菌的抗虫基因插入载体质粒中，然后导入棉花的受精卵中，结果抗虫基质粒中，然后导入棉花的受精卵中，结果抗虫基因在棉花体内没有表达。因在棉花体内没有表达。 然后在插入抗虫基因的质粒中插入启动子然后在插入抗虫基因的质粒中插入启动子( (抗抗虫基因首端虫基因首端) )，导入棉花受精卵，长成的棉花植株，导入棉花受精卵，长成的棉花植株还是没有抗虫能力。科学家又在有启动子、抗虫还是没

7、有抗虫能力。科学家又在有启动子、抗虫基因的质粒中插入终止子基因的质粒中插入终止子( (抗虫基因末端抗虫基因末端) )，导入，导入棉花受精卵，结果成长的植株，有了抗虫能力。棉花受精卵，结果成长的植株，有了抗虫能力。 目的：使目的基因在受体细胞中稳定存目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。的基因能够表达和发挥作用。a、目的基因、目的基因b、启动子、启动子c、终止子、终止子d、标记基因、标记基因( (三三) )将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞转化转化目的基因进入目的基因进入_内，并且在内，并且在 受

8、体细胞内维持受体细胞内维持_和和_的过程的过程受体细胞受体细胞稳定稳定表达表达方法方法导入植物细胞导入植物细胞导入动物细胞导入动物细胞导入微生物细胞导入微生物细胞农杆菌转化法农杆菌转化法基因枪法基因枪法花粉管通道法花粉管通道法显微注射法显微注射法 感受态细胞吸收感受态细胞吸收DNADNA分子分子( (三三) )将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞( (四四) )目的基因的检测与鉴定目的基因的检测与鉴定检查是否成功检查是否成功检测检测鉴定鉴定检测转基因生物染色体的检测转基因生物染色体的DNA DNA 上是否插入了目的基因上是否插入了目的基因检测目的基因是否转录出了检测目的基因是否转录出了

9、mRNAmRNA检测目的基因是否翻译成蛋白质检测目的基因是否翻译成蛋白质抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等方法方法方法方法方法方法DNADNA分子杂交分子杂交分子杂交分子杂交抗原抗原- -抗体杂交抗体杂交直接分离法直接分离法: :2. 构建基因文库构建基因文库直接分离法直接分离法：供体细胞中的供体细胞中的DNADNA许多许多DNADNA片段片段运载体运载体限制酶限制酶分别与分别与 载体连接载体连接受体细胞受体细胞分别分别 导入导入2. 构建基因文库构建基因文库mRNA 反转录反转录cDNA(互补互补DNA） DNA聚合酶聚合酶双链双链DNA反转录法：反转录法：2. 构

10、建基因文库构建基因文库cDNA合成过程 第一步，反转录酶以第一步，反转录酶以RNA为模板合成一条与为模板合成一条与RNA互补互补的的DNA单链，形成单链，形成RNA-DNA杂交分子。杂交分子。 第二步，核酸酶第二步，核酸酶H使使RNA-DNA杂交分子中的杂交分子中的RNA链链降解，使之变成单链的降解，使之变成单链的DNA。 第三步，以单链第三步，以单链DNA为模板，在为模板，在DNA聚合酶的作用下聚合酶的作用下合成另一条互补的合成另一条互补的DNA链，形成双链链，形成双链DNA分子。分子。 文库类型文库类型cDNAcDNA文库文库基因组文库基因组文库文库大小文库大小小小大大基因中基因中启动子启

11、动子无无有有基因中基因中内含子内含子无无有有基因多少基因多少某种生物的部分基因某种生物的部分基因某种生物的全部基因某种生物的全部基因物种之间的基物种之间的基因交流因交流可以可以部分基因可以部分基因可以说明说明基因文库的组建过程就包含基因工程的基本操基因文库的组建过程就包含基因工程的基本操作步骤作步骤。从基因文库中获取目的基因的优点是。从基因文库中获取目的基因的优点是操作简便，缺点是工作量大，具有一定的盲目操作简便，缺点是工作量大，具有一定的盲目性性. .依据：目的基因的有关信息。依据：目的基因的有关信息。如：根据如：根据基因的核苷酸序列基因的核苷酸序列基因的功能、基因在染色体上的位置基因的功能

12、、基因在染色体上的位置基因的转录产物基因的转录产物mRNAmRNA基因的表达产物蛋白质等特性。基因的表达产物蛋白质等特性。3如何从基因文库中得到所需要的基因？如何从基因文库中得到所需要的基因？利用PCR技术扩增目的基因原理:DNA双链复制前提:要有一段已知目的基因的脱氧核苷酸序列，以便合成引物。 概念：概念：PCRPCR全称为全称为_，是一项，是一项 在生物在生物_复制复制_的核酸合成技术的核酸合成技术 条件：条件：_、 _、_ _ 、 _._.前提条件：前提条件：原理：原理：_方式：以方式：以_方式扩增，即方式扩增，即_ _（n n为扩增循为扩增循 环的次数）环的次数）结果：结果：选修选修1

13、 P1 P6060聚合酶链式反应聚合酶链式反应体外体外特定特定DNADNA片段片段DNADNA双链复制双链复制已知基因的核苷酸序列已知基因的核苷酸序列四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸一对引物一对引物DNADNA聚合酶聚合酶指数指数2 2n n使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增利用利用PCRPCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因过程：过程：a a、DNADNA变性（变性（90-9590-95）：双链）：双链DNADNA模板模板 在热作用下，在热作用下，_断裂，形成断裂，形成_b b、退火（、退火（复性复性55-6555-65）：系统温度降低，引）：系统温

14、度降低，引 物与物与DNADNA模板结合，形成局部模板结合，形成局部_。 c c、延伸（、延伸（70-7570-75）：在）：在TaqTaq酶的作用下，从酶的作用下，从 引物的引物的55端端33端端延伸，合成与模板互补延伸，合成与模板互补 的的_ _。 氢键氢键单链单链DNADNA双链双链DNADNA链链利用利用PCRPCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因PCRPCR技术扩增过程技术扩增过程a a、DNADNA变性（变性（90-9590-95）：双链）：双链DNADNA模板模板 在热作用下，在热作用下， 断裂，形成断裂，形成_ _ b b、复性（、复性（55-6055-60）：系统温度降低，引

15、物）：系统温度降低，引物 与与DNADNA模板结合，形成局部模板结合，形成局部_。 c c、延伸（、延伸（70-7570-75）：在）：在TaqTaq酶的作用酶的作用下，从引物的下，从引物的55端端33端延伸，合成与端延伸，合成与模板互补的模板互补的_。 氢键氢键单链单链DNADNA双链双链DNADNA链链PCRPCR技术技术DNADNA复制复制过程过程DNADNA变性（变性（90909595）退火退火（复性（复性55556060）子链延伸子链延伸（70707575）重复循环重复循环DNADNA复制起始，复制起始，RNARNA引物形成引物形成DNADNA片段生成片段生成RNARNA引物水解引物

16、水解完整的完整的DNADNA分子形成分子形成相同相同点点原则原则碱基互补配对碱基互补配对条件条件模板、原料（模板、原料（dCTPdCTP、dATPdATP、dGTPdGTP、dTTPdTTP）、能量、酶、引物等）、能量、酶、引物等不同不同点点解旋方解旋方式式氢键在高温下断氢键在高温下断裂，双链全部解裂，双链全部解开开解旋酶催化氢键逐步断裂解旋酶催化氢键逐步断裂场所场所体外体外主要在细胞核中主要在细胞核中引物引物DNADNARNARNA酶酶热稳定热稳定DNADNA聚合酶聚合酶（TaqTaq酶）酶）解旋酶、解旋酶、DNADNA聚合酶、聚合酶、DNADNA连接酶等连接酶等结果结果在短时间内形成在短时

17、间内形成大量的大量的DNADNA片段片段形成完整的形成完整的DNADNA分子分子2.2.微生物作受体细胞原因：微生物作受体细胞原因：将目的基因导入微生物细胞将目的基因导入微生物细胞3.3.转化方法：转化方法：大肠杆菌大肠杆菌繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少处理细胞处理细胞细胞细胞表达载体与感受态细胞混合表达载体与感受态细胞混合 _ _细细胞吸收胞吸收DNADNA分子。分子。CaCa2+2+感受态感受态感受态感受态1.1.常用菌：常用菌： 目的基因插入目的基因插入TiTi质粒的质粒的T-DNAT-DNA上上 农杆菌农杆菌 导入植物细胞导入植物细胞 整合到受体细

18、胞的染色体上整合到受体细胞的染色体上 目的基因的遗传特性得以维持稳定和表达目的基因的遗传特性得以维持稳定和表达 1. 1.农杆菌特点：农杆菌特点：易感染双子叶植物和裸子植物。易感染双子叶植物和裸子植物。TiTi质粒的质粒的T-DNAT-DNA可转移至受体细胞的染色体上可转移至受体细胞的染色体上2.转转化化细胞细胞类型类型常用方法常用方法 受体细受体细胞胞转化过程转化过程植物植物细胞细胞农杆菌转农杆菌转化法化法体细胞体细胞将目的基因插入将目的基因插入TiTi质粒的质粒的T-DNAT-DNA上上转入农杆菌转入农杆菌导入植物细胞导入植物细胞整整合到受体细胞的合到受体细胞的DNADNA动物动物细胞细胞

19、显微注射显微注射技术技术受精卵受精卵将含有目的基因的表达载体提纯将含有目的基因的表达载体提纯取卵取卵受精卵受精卵显微注射显微注射早期胚早期胚胎培养胎培养胚胎移植胚胎移植发育成为具有发育成为具有新性状的动物新性状的动物微生微生物细物细胞胞CaCa2+2+处理处理法法原核细原核细胞胞用用CaCa2+2+处理细胞处理细胞感受态细胞感受态细胞重重组表达载体组表达载体DNADNA分子与感受态细胞分子与感受态细胞混合混合感受态细胞吸收感受态细胞吸收DNADNA分子分子检测检测步骤步骤目的目的方法方法原理原理工具工具现象现象1 1DNADNA分子分子杂交技术杂交技术碱基互碱基互补配对补配对放射性同位素作放射

20、性同位素作标记的含目的基标记的含目的基因的因的DNADNA片段片段杂交带杂交带2 2检测目的基因是检测目的基因是否转录出了否转录出了mRNAmRNADNADNA分子分子杂交技术杂交技术碱基互碱基互补配对补配对放射性同位素作放射性同位素作标记的含目的基标记的含目的基因的因的DNADNA片段片段杂交带杂交带3 3检测目的基因是检测目的基因是否翻译成蛋白质否翻译成蛋白质抗原抗原- -抗抗体杂交体杂交抗体的抗体的专一性专一性特定抗体特定抗体杂交带杂交带( (阳阳性反应性反应) )2 2、下列属于获取目的基因的方法的是、下列属于获取目的基因的方法的是( )( )利用利用mRNAmRNA反转录形成从基因组

21、文库中提取反转录形成从基因组文库中提取从受体细胞中提取从受体细胞中提取 利用利用PCRPCR技术技术 利用利用DNADNA转录转录 人工合成人工合成A.A. B. B. C. C. D. D.1 1、 在基因工程中，把选出的目的基在基因工程中，把选出的目的基因（共因（共10001000个脱氧核苷酸对，其中腺嘌岭个脱氧核苷酸对，其中腺嘌岭脱氧核苷酸是脱氧核苷酸是460460个）放入个）放入DNADNA扩增仪中扩扩增仪中扩增增4 4代，那么，在扩增仪中应放入胞嘧啶代，那么，在扩增仪中应放入胞嘧啶脱氧核苷酸的个数是（脱氧核苷酸的个数是（ ）个）个A. 540 B. 8100 C. 17280 D. 75603.细菌的质粒分子带有一个抗菌素抗性基因，该抗细菌的质粒分子带有一个抗菌素抗性基因，该抗性基因在基因工程中的主要