WesternBlot技术应用指导培训

1、WesternBlot技术应用指导培训 目录目录n Western Blot，即蛋白质印迹法（免疫印迹试验）n 印迹法（blotting）是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。为什么要做Western Blot实验？n研究一些体外的蛋白质分子，寻找目的蛋白是否存在样品当中；n蛋白质的表达情况，上调或下调表达，在不同的样品中，如疾病和正常的样品之间的表达差异性。 目录目录n 将电泳分离后的细胞或组织总蛋白质从凝胶转移到固相支持物NC膜或PVDF 膜上，然后用特异性抗体检测某特定抗原的一种蛋白质，通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中表达

2、情况的信息。n 现己广泛应用于基因在蛋白水平的表达研究、抗体活性检测和疾病早期诊断等多个方面。 目录目录蛋白提取的质量直接决定着WB结果的好坏，因此，根据标本类型和检测类型选择合适的蛋白制备方法是至关重要的！1、根据检测蛋白的位置选择合适的裂解buffer：2、选择合适的蛋白酶抑制剂，避免蛋白降解，从而保证检测的准确性！3、提取蛋白后进行蛋白的定量，以对后续操作进行监控n 蛋白质的快速定量方法主要依靠蛋白质本身的发色基团，或其与其它显色剂反应产生的紫外吸收来进行定量。n 目前常用的主要有直接紫外吸收法、Bradford法和Lorry法三种。也有市售的商业化的蛋白定量试剂盒，可直接购买使用。n

3、紫外吸收法： 大多数蛋白质在280nm波长处有特征的最大吸收，这是由于蛋白质中有酪氨酸，色氨酸和苯丙氨酸存在的缘故，因此，利用这个特异性吸收，可以计算蛋白质的含量。n 如果没有干扰物质的存在，在280nm处的吸收可用于测定0.10.5mg/ml含量的蛋白质溶液。1、变性、还原标本n在标本中加入含有SDS的上样缓冲液，然后在95-100煮沸5-15分钟，以充分变性蛋白，保证蛋白从空间结构变为一级结构（多聚体解散为单聚体，氧化状态转化为还原状态等）。n 标准的上样缓冲液是2X Laemmli buffer，有时为了减少标本的稀释比例，也可以制备4X和6X的上样缓冲液。如果使用4X缓冲液，则缓冲液和

4、标本的比例为3:1。n在加热/煮沸前后，均需要充分漩涡混匀标本。n上样量：一般为20-40ug，根据样本中待测蛋白的表达水平，做出合适的优化。上样量过多会出现非特异性染色；过少则会导致检测不到出现假阴性的结果。SDS上样缓冲液作用上样缓冲液作用2、天然和非还原标本n 有些抗体识别的表位是非连续氨基酸，这些氨基酸虽然在蛋白质一级结构中彼此不连续，但是在空间结构中则是靠在一起的。这些抗体就能识别靶蛋白的空间结构状态（一般在抗体的说明书中都会有特殊说明）。对于这类抗体检测的标本，只需要在缓冲液和凝胶中去除SDS即可，并且不能对蛋白进行加热变性。n而有些抗体只能识别蛋白的非还原状态如氧化状态，对此类标

5、本，就需要将缓冲液和凝胶中的还原剂DTT和-巯基乙醇去除。1、制备凝胶SDS-PAGE凝胶可以购买商业化的也可以自行配制，不论选择哪种，确定合适的凝胶浓度是十分关键的。凝胶的浓度取决于目的蛋白的分子量大小，目的蛋白分子量越大，则凝胶浓度越低。制胶步骤制胶步骤灌制分离胶 压分离胶 灌制浓缩胶 插入梳子2、选择合适的阳性对照：阳性对照为已经明确表达目的蛋白的细胞或组织提取物，同时电泳，杂交，以确定检测结果的准确性以及判定抗体的有效性。3、蛋白质分子量Marker 蛋白质分子量Marker的使用，是检测电泳效果和确定待测靶蛋白分子量大小和正确与否的保证！预染Marker更方便直接观察电泳和转膜效果。

6、4、上样n将处理后的标本直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内即可Staking gelSeparating gel5、电泳n 电泳时间： 通常电泳时溴酚蓝到达胶的底端处附近即可停止电泳，或者可以根据预染蛋白质分子量标准的电泳情况，预计目的蛋白已经被适当分离后（在分离胶下1/3处）即可停止电泳。n 杂交膜是WB进行的介质，选择合适的、高质量的杂交膜对整个WB的实验是非常重要和关键的。n常用的转移膜类型有：PVDF膜、硝酸纤维素膜（NC膜）和尼龙膜，其中PVDF和NC膜的使用频率最高。 PVDF膜需要小心预处理： 将膜剪成合适的大小，在甲醇中浸润1-2分钟后，在预冷的转膜buffer中孵育5分钟，

7、凝胶也需要在预冷的转膜buffer中平衡35分钟。否则在转膜过程中会出现皱缩，导致出现转移的条带变形。转膜原理转膜原理n 湿转：大分子量（100KD以上）建议湿转n 半干转膜n 转膜时间一般为30-60分钟。也可以在15-20mA转膜过夜。具体的转膜时间要根据目的蛋白的大小而定，目的蛋白的分子量越大，需要的转膜时间越长，目的蛋白的分子量越小，需要的转膜时间越短。大片段的50KD的可以选用350mA,小片段的可以用250mA。n在转膜过程中，特别是高电流快速转膜时，通常会有非常严重的发热现象，最好把转膜槽放置在冰浴中进行转膜。n转膜缓冲液一定要事先预冷，最好提前一天配好放4 冰箱，但是甲醇要现加

8、。n半干转移系统中，滤纸和膜切成与凝胶相同大小很重要，这样电流必须通过凝胶。否则，在凝胶边缘处滤纸重叠将导致电流短路。n两种转移系统中都必须注意防止在滤纸、凝胶和膜之间的任何地方存在气泡，气泡阻碍转移并在印迹膜上产生“秃斑”（即非转移区）。n 转膜后，确定转膜效率至为重要，可通过以下方法检测：n 在转膜后使用丽春红（可逆染色）对杂交膜染色，同时使用考马斯亮蓝对转膜后的凝胶进行染色，检测凝胶上的蛋白是否已经完全充分的转移到杂交膜上。（膜有很清晰的蛋白条带，而凝胶上无蛋白存在）。n 使用预染蛋白Marker，检测Marker的转移情况，当和目的蛋白大小相当的Marker完全转移后即可停止，但是有时

9、需要相对延长一些时间，因为Marker相对目的蛋白会比较容易转移。大分子量或者小分子量蛋白的转膜注意事项大分子量或者小分子量蛋白的转膜注意事项n 对于大分子量蛋白(100 kD) 1、大分子量蛋白转移很慢，就像他们在凝胶中分离的比较慢一样。确保大分子量蛋白的凝胶浓度低于8%。2、大分子量蛋白容易沉淀在凝胶中，难于转移，可在转膜缓冲液中加入0.1%的SDS来缓解该现象。另外甲醇可能会将SDS从蛋白中去除，所以将转膜缓冲液中的甲醇浓度降到10%或以下，可以使转膜更加容易进行。3、只有在使用硝酸纤维素膜（NC膜）时，甲醇才是必须的。如果使用PVDF膜，可将甲醇从转膜缓冲液中去除（只在前期膜处理的时候

10、使用甲醇）。4、选择在4转膜过夜，来替代常规的半干转膜。n 对于小分子量蛋白(100 kD) 1、SDS不利于蛋白质和膜的结合，小分子量蛋白尤其明显。如果目的蛋白很小的话，可将SDS从转膜缓冲液中去除。2、保持甲醇的浓度在20%。1、避免直接使用手碰杂交膜，使用镊子。因为手上的蛋白和油脂会影响转膜效率并会使膜脏掉。2、夹好膜和凝胶后，确定在凝胶/膜和滤纸之间没有气泡存在，否则会导致转膜不完全。3、保证膜和滤纸的大小和凝胶完全一样，过大或过小都会影响转膜效率。4、鸡来源的抗体与PVDF和尼龙膜有较强的结合能力，从而产生较高的背景，故如果选择鸡来源的抗体最好使用硝酸纤维素膜。n为什么要封闭？ 杂交

11、膜上有很多非特异性的蛋白质结合位点，为防止这些位点与抗体结合引起非特异的染色和背景，一般用惰性蛋白质或非离子去污剂封闭膜上的未结合位点来降低抗体的非特异性结合。封闭剂应该封闭所有未结合位点而不替换膜上的靶蛋白、不结合靶蛋白的表位，也不与抗体或检测试剂有交叉反应。n常用的封闭试剂有1-3%的BSA或者5%的脱脂奶粉，缓冲液一般选择PBST或者TBST。n一般封闭条件为：室温或者371-2hr，特殊情况也可4过夜。根据结果情况调整封闭试剂的浓度和类型。n封闭完成后要进行洗膜，以去除膜上未结合的封闭试剂。洗涤液使用TBST或者PBST，其中的Tween有助于去除非特异性的结合，减少背景。n同时短时间多次的洗膜（如5-6次，每次3分钟）比长时间少次数的洗膜更有效。n 把膜放在密闭塑料袋或者培养皿中，根据膜面积以0.1mL/cm2的量加入一抗溶液，摇床上平缓摇动，于室温孵育1-2小时或4过夜（一般大于18个小时）。n回收一抗溶液，用TBST漂洗膜5次，3min、5min、315min。n加入用封闭液配制的二抗，摇床上缓慢摇动，于室温孵育1-2小时。 n用TBST漂洗膜4次，3min、5min、210min。 内参的使用内参的使用 WB过程监测以及目的蛋白定量的标准！过程监测以及目的蛋白定量的标准！注意：1、如果背景不是很高，很多抗体在含有低浓度BSA或脱脂奶粉（0.25-0.5%）