一节克隆载体

1、1第一节第一节 克隆载体克隆载体1. 1. 质粒载体（质粒载体（plasimid vectorsplasimid vectors）2. 2. 噬菌体载体（噬菌体载体（phage vectorsphage vectors）3. 3. 柯斯质粒载体（柯斯质粒载体（cosmid vectorscosmid vectors） 4. 4. 人工染色体载体（人工染色体载体（B/Y/HACB/Y/HAC）2噬菌体简介噬菌体简介Bacteriophage(phage) 3 噬菌体或病毒的噬菌体或病毒的DNADNA能被开发能被开发成为基因工程的有用载体，因为：成为基因工程的有用载体，因为： 1.1.高效率的感染

2、性高效率的感染性能使外源基能使外源基因高效导入受体细胞；因高效导入受体细胞； 2.2.自主复制繁殖性能自主复制繁殖性能使外源基使外源基因在受体细胞中高效扩增。因在受体细胞中高效扩增。 4 大肠杆菌的大肠杆菌的- -噬菌体噬菌体（一）（一） - -噬菌体的生物学特性噬菌体的生物学特性1 1、由外壳包装蛋白和、由外壳包装蛋白和-DNA-DNA组成组成2 2、 - -DNADNA的物理图谱的物理图谱（1 1）功能相近的基因在基因组中聚集在一起）功能相近的基因在基因组中聚集在一起 目前已经被确定的基因至少目前已经被确定的基因至少6161种，一半为必需种，一半为必需基因基因548.5kb（2 2）线状双

3、链）线状双链DNADNA，两端各有一个，两端各有一个1212bpbp的互补单链的互补单链（粘性末端，粘性末端，cohesivecohesive-end site-end site），称），称coscos site site ，粘性末端粘连接变成，粘性末端粘连接变成环状环状DNADNA。lcoscos位点是噬菌体包装必需序列。位点是噬菌体包装必需序列。 6u噬菌体基因大致分为噬菌体基因大致分为3 3个区：个区： 功能区：裂解相关功能区：裂解相关S S和和R R，复制相关，复制相关O O和和P P非必须区：非必须区： 非必须，基因重组非必须，基因重组intint（intagrateintagrat

4、e）及及xisxis（excisionexcision）结构区：结构区：A A J19J19个基因，编码个基因，编码头、头、 尾部蛋白质尾部蛋白质783 3、感染周期（溶菌循环）、感染周期（溶菌循环）DNADNA复制早期：一个复制早期：一个ori ori ，双向复制，双向复制晚期：滚环复制晚期：滚环复制-多个多个DNADNA分子形成线状多联体分子形成线状多联体9 头部包装蛋白头部包装蛋白首先结合在首先结合在coscos区区的附近，形成的附近，形成包包装启动复合物装启动复合物，A A蛋白蛋白切割切割coscos位点位点。包装包装104 4、溶源状态的建立、溶源状态的建立 噬菌体感染大肠杆菌后，噬

5、菌体感染大肠杆菌后，DNADNA直接直接整合整合到到宿宿主细胞染色体主细胞染色体DNADNA上，并不裂解细胞，这种情况上，并不裂解细胞，这种情况称为称为溶源状态溶源状态。DNADNA重组技术一般需要噬菌体处于溶源状态。重组技术一般需要噬菌体处于溶源状态。 整合主要由整合主要由cIcI和和intint基因的产物所激活，这两个基因的开放基因的产物所激活，这两个基因的开放与关闭取决于宿主细胞本身的性质。与关闭取决于宿主细胞本身的性质。cIcI基因：基因：编码阻遏蛋白，编码阻遏蛋白，是感染了是感染了噬菌体的寄主细胞进噬菌体的寄主细胞进入溶源化的必要条件。入溶源化的必要条件。cIcI基因失活或缺失基因失

6、活或缺失的的噬菌体无法噬菌体无法使寄主细胞使寄主细胞发生溶源化发生溶源化效应。效应。11噬菌体基因组可以整合到大肠杆菌染色体噬菌体基因组可以整合到大肠杆菌染色体DNADNA上，上，成为成为原噬菌体原噬菌体。适当条件下，原噬菌体又可以脱离寄主染色体，适当条件下，原噬菌体又可以脱离寄主染色体，重新变成独立的复制子，这种过程叫做重新变成独立的复制子，这种过程叫做原噬菌体原噬菌体的删除作用。的删除作用。超感染免疫性超感染免疫性 l噬菌体噬菌体DNADNA的整合与删除：的整合与删除： 溶源性细菌，由于含有溶源性细菌，由于含有原噬菌体原噬菌体，故不能再，故不能再次被次被同种同种噬菌体感染。溶源性细菌所具有

7、的这种噬菌体感染。溶源性细菌所具有的这种抗御抗御同种噬菌体再感染同种噬菌体再感染的特性叫做的特性叫做超感染免疫性超感染免疫性。12噬菌体的溶源和裂解噬菌体的溶源和裂解13 - -DNADNA载体的构建载体的构建噬菌体的缺陷：噬菌体的缺陷： 基因组太大（基因组太大（48.5kb48.5kb）；）； 酶切点太多，它有酶切点太多，它有5 5个个BamH1BamH1位点（位点（GGATCCGGATCC），），6 6个个BgBg位点（位点（AGATCTAGATCT），），5 5个个EcoREcoR位点位点（GAATTCGAATTC）。）。 野生型只能接纳一定长度的野生型只能接纳一定长度的DNADNA。若

8、相当于。若相当于噬菌体噬菌体的的75-105%75-105%，那么只能接纳，那么只能接纳48.5kb48.5kb5%=2.425kb5%=2.425kb的的DNADNA。 重组的重组的DNADNA分子难于直接导入宿主细胞分子难于直接导入宿主细胞利用体外利用体外包装成病毒颗粒，然后通过感染的方法注入包装成病毒颗粒，然后通过感染的方法注入DNADNA。14 切去部分非必须的区域；切去部分非必须的区域； 抹去多余的限制性内切酶切割位点；抹去多余的限制性内切酶切割位点； 插入可供选择的标记基因；插入可供选择的标记基因； 建立体外包装系统。建立体外包装系统。构建构建噬菌体克隆载体的基本策略：噬菌体克隆载

9、体的基本策略：15插入型载体、取代型载体插入型载体、取代型载体 u根据切除的多少，将根据切除的多少，将-DNA分为两大类载体：分为两大类载体：1、缩短长度、缩短长度野生型野生型:上限上限51kb -DNA：48.5kb，外源基因，外源基因2.5kb-DNA上有上有40-50%的的DNA是复制，裂解所不必需的，是复制，裂解所不必需的，切除便提高装载量。切除便提高装载量。16插入型载体（插入型载体（insertion vector）经改造后经改造后只具有只具有一个一个可供外源可供外源DNA插入的插入的克隆位点克隆位点,长度长度为为37kb，为包装的下限，它本身也能被包装，允许插入，为包装的下限，它

10、本身也能被包装，允许插入片段最大为片段最大为14kb.必须携带标记基因必须携带标记基因17取代型载体（取代型载体（substitution vector）具有具有成对的克隆位点成对的克隆位点,空载的载体空载的载体DNA只只26kb，不能被包，不能被包装，无法进入受体细胞中去装，无法进入受体细胞中去,不需要标记基因不需要标记基因.18插入型载体只能承受插入型载体只能承受较小分子量较小分子量（一般在（一般在10kb以内）的外源以内）的外源DNA片段的插入，广泛片段的插入，广泛应用于应用于cDNA及小片段及小片段DNA的克隆。的克隆。替换型载体可承受替换型载体可承受较大分子量较大分子量的外源的外源D

11、NA片段的插入，所以适用于片段的插入，所以适用于克隆高等克隆高等真核生物的染色体真核生物的染色体DNA。19 删除重复的酶切位点删除重复的酶切位点: :野生型野生型DNA链上有链上有5个个EcoRI位点和位点和7个个HindIII位点，不利于重位点，不利于重组操作，必须删除至组操作，必须删除至1-2个个. 为了便于为了便于各种来源的各种来源的DNA片段的克隆，还片段的克隆，还需要需要增加增加一些一些单一的酶切位点单一的酶切位点. 2、酶切位点的删除或增加、酶切位点的删除或增加 采用定点突变技术或甲基化酶处理必采用定点突变技术或甲基化酶处理必需区内的酶识别序列使其失活。需区内的酶识别序列使其失活

12、。203、灭活某些与裂解周期有关的基因、灭活某些与裂解周期有关的基因 将将无义突变无义突变引入噬菌体裂解周期所需的基因引入噬菌体裂解周期所需的基因，如如将头部包装蛋白基因的将头部包装蛋白基因的CAG突变成突变成UAG。这些这些噬菌体只能在具有噬菌体只能在具有特异校正基因编码产物的特异校正基因编码产物的菌株内菌株内繁殖。繁殖。 当这种当这种DNA进入一般大肠杆菌菌株后，不能合进入一般大肠杆菌菌株后，不能合成成有活性的头部蛋白有活性的头部蛋白，也就，也就不能被包装和裂解细不能被包装和裂解细菌菌，可阻止有害重组体的生物污染及扩散。，可阻止有害重组体的生物污染及扩散。基因工程实验中使用的受体是具有基因

13、工程实验中使用的受体是具有琥珀型突变琥珀型突变体校正功能体校正功能的菌株。的菌株。214、加装选择标记、加装选择标记 野生型野生型-DNA上缺少合适的选择标记，因此加上缺少合适的选择标记，因此加装选择标记是装选择标记是-DNA克隆载体构建的重要内容。克隆载体构建的重要内容。选择标记主要有两类：选择标记主要有两类：l免疫功能类标记免疫功能类标记l颜色反应类标记颜色反应类标记22(1)(1)免疫功能失活标记免疫功能失活标记 (cI(cI筛选筛选) )l 加装选择标记加装选择标记cIcI基因基因l cIcI基因基因编码一种编码一种阻止阻止-噬菌体进噬菌体进入入溶菌循环溶菌循环的阻遏物。的阻遏物。l

14、含有完整标记基因的含有完整标记基因的-载体进入载体进入受体细胞后，建立受体细胞后，建立溶源状态溶源状态，细，细菌生长缓慢，菌生长缓慢，形成混浊斑形成混浊斑；当当外源外源DNA插入插入到标记基因中，到标记基因中，基因灭活，基因灭活， -重组分子便进入重组分子便进入溶菌循环，溶菌循环，形成形成透明斑。透明斑。23(2)(2)加装选择标记加装选择标记lacZlacZ（蓝白斑筛选）蓝白斑筛选）l lacZ基因编码基因编码-半乳半乳糖苷酶，糖苷酶，能催化无色的能催化无色的X-gal生成生成蓝色化合物蓝色化合物。当外源基因插入到当外源基因插入到lacZ基因中，基因灭活，基因中，基因灭活，不能不能合成合成蓝

15、色化合物蓝色化合物；而空载体而空载体-DNA则产则产生生蓝色透明斑蓝色透明斑。245、建立、建立 -噬菌体的体外包装系统噬菌体的体外包装系统体外包装原理：体外包装原理： 噬菌体的头部和尾部的装配是分开进行的噬菌体的头部和尾部的装配是分开进行的。头部基因头部基因发生了发生了突变突变的噬菌体只能的噬菌体只能形成尾部和形成尾部和头部蛋白所需的蛋白因子头部蛋白所需的蛋白因子； 将这两种突变型的噬菌体的将这两种突变型的噬菌体的提取物混合起来，提取物混合起来，便能够在便能够在体外装配成有生物活性体外装配成有生物活性的噬菌体颗粒。的噬菌体颗粒。尾部基因尾部基因发生了发生了突变突变的噬菌体则只能形成的噬菌体则只能形成头部和头部和尾部蛋白所需的蛋白因子。尾