16S信息分析报告2-北京奥维森

1、精选优质文档-倾情为你奉上 16srDNA信息分析1.标准信息分析（初级）1.1 基本数据处理（使用内部撰写的程序对原始的测序数据进行基本处理） 通过Illumina平台（Miseq）进行Paired-end测序，下机数据经过去除低质量reads(Q20, 90%标准过滤)，并trim掉reads2 尾部100bp 低质量序列；每个样品数据产出详细统计结果见下表：表1-1 reads数据统计：# Samples# HQ reads (total)# HQ reads (mean±SD)CA17110,6516,509±2,175HC19163,6908,615±3

2、,081LK13127,4169,801±2,858Total49401,7578,199±2,992注：原来的样本中CA15由于原始Reads数太少（只有23条）而被删除，因此目前的样本总数为49个 1.2 去除 barcode 序列，引物序列及 tags过滤通过COPE软件（Connecting Overlapped Pair-End，V1.2.3.3），利用重叠关系将双末端测序得到的成对reads组装成一条序列。利用内部编写程序去除两端barcode 序列，引物序列。 Paired End Reads通过reads之间的overlap （19个碱基）关系拼接成Tags

3、；然后去掉barcode序列，引物序列。为了得到高质量的Tags，将拼接的Tags按照长度过滤，去嵌合体等的处理。(这里等的意思就是按照拼接条件过滤:1, 碱基的ASCII value值低于33的过滤掉。2.overlap取19个碱基，这19个碱基相互匹配率低于98%的过滤掉。3.去掉引物序列的时候，允许一个错配，错配多于一个的过滤掉。) 表1-2 tags的详细信息Sample IDRaw Tag NumFinal Tag numHC11756017,319HC296729,604HC31805317,826HC41218112,107HC51155811,477HC81148811,404

4、HC91635416,095HC102158421,270HC1179897926HC121156111,449HC132490924,660HC142297922,736HC152074720,549HC161485714,728HC172117121,002HC181070010,605HC191135911,247CA81620316,040CA101092510,560CA1182547,690CA1294799,053CA1479477,584CA1682218,093CA171066610,479CA181078710,651CA51634416,154CA960475,861CA

5、131029010,1652 高级信息分析2.1 OUT及其丰度分析2.1.1 OUT统计 拼接的Tags经过优化后，在0.97相似度下利用qiime（v1.8.0）软件将其聚类为用于物种分类的OTU(Operational Taxonomic Units)，统计各个样品每个OTU中的丰度信息，OTU的丰度初步说明了样品的物种丰富程度。49个样品共产生3029个OTU，其中Singletons OTU（即丰度为1的OTU）个数为0，Non singletons OTU个数为3029。表4.样品OUT统计SampleNameOTUsTagsHC154117,319HC22699,604HC353

6、017,826HC421512,107HC520611,477HC821411,404HC945516,095HC1060021,270HC1226211,449HC1329424,660CA1045310,560CA117107,690CA126509,053CA145197,584CA162408,093CA1733010,479CA1828910,651CA533616,154CA93475,861HC111427,926CA1326910,165表5 OTU 统计IndexOTU numNo. of OTUs3029Assigned to families1,708 Assigned

7、to genera1,172 Assigned to species314No. of OTUs per sample368±147Min no. of OTUs per sample127Max no. of OTUs per sample7192.1.2 OTU分布的韦恩图如下：在0.97的相似度下，得到了每个样品的OTU个数，利用R（v3.1.1）画图软件绘出Venn图可以展示多样品共有和各自特有OTU数目，直观展示样品间OTU的重叠情况。结合OTU所代表的物种，可以找出不同环境中的核心微生物。图2-1 OTU venn 分析。不同颜色图形代表不同样品或者不同组别，不同颜色图形

8、之间交叠部分数字为两个样品或两个组别之间共有的OTU个数。同理，多个颜色图形之间交叠部分数字为多个样品或组别之间共有OTU个数。Venn图容许2-5个样品或组别。2.1.3 OUT水平的PCA图如下：R（v3.1.1）画图软件PCA 分析(Principal Component Analysis)，即主成分分析，是一种分析和简化数据集的技术。主成分分析经常用于减少数据集的维数，同时保持数据集中的对方差贡献最大的特征。这是通过保留低阶主成分，忽略高阶主成分做到的。这样低阶成分往往能够保留住数据的最重要方面。通过分析不同样品OTU（97%相似性）组成可以反映样品的差异和距离，PCA运用方差分解，将

9、多组数据的差异反映在二维坐标图上，坐标轴取能够最大反映方差值两个特征值。如果两个样品距离越近，则表示这两个样品的组成越相似。不同处理或不同环境间的样品可能表现出分散和聚集的分布情况，从而可以判断相同条件的样品组成是否具有相似性。图2-2 基于OTU丰度的PCA分析。横坐标表示第一主成分，括号中的百分比则表示第一主成分对样品差异的贡献值；纵坐标表示第二主成分，括号中的百分比表示第二主成分对样品差异的贡献值。图中点分别表示各个样品。不同颜色代表样品属于不同的分组。2 .2 Core microbiome分析图表都是通过qiime（v1.8.0）软件得到的共有OTU数与样本数的关系：图2-3 覆盖所

10、有样本的微生物组。横坐标表示样品占的比率，纵坐标表示包含OUT的数目。 这些样本的core microbiome（即覆盖所有样本的微生物组）共包含17个OTUs，其物种分类信息如下表2-1。表2-1 覆盖所有样本的OTUsOTUTaxonomy levelTaxonomy nameGenusStreptococcusGenusCapnocytophagaSpeciesdisparGenusCampylobacterGenusFusobacteriumGenusStreptococcusGenusStreptococcusGenusPeptostreptococcusGenusGranulica

11、tellaGenusCampylobacterGenusNeisseriaGenusFusobacterium2008GenusNeisseria21908GenusNeisseriaGenusCampylobacterFamilyGemellaceae1212GenusGranulicatella2.3 生物多样性分析2.3.1 单个样品复杂性分析通过计算Shannon index, Chao1 index, Phylogenetic diversity (PD, whole tree) 和observed number of species共四个指数来进行生物多样性分析。通过qiime（v

12、1.8.0）软件计算样品的Alpha多样性值并用R（v3.1.1）软件做出相应的稀释曲线，盒型图。稀释曲线是利用已测得16S rDNA序列中已知的各种OTU的相对比例，来计算抽取n个（n小于测得Reads序列总数）Tags时各Alpha指数的期望值，然后根据一组n值（一般为一组小于总序列数的等差数列）与其相对应的Alpha指数的期望值绘制曲线。如样品有提供分组信息，且每组样品个数不小于3，将对组间的Alpha多样性指数进行差异分析。差异分析的检验方法为秩和检验，如果组数为2，采用两样品比较的Wilcoxon Rank-Sum Test（R中的wilcox.test）；如果组数大于2，采用多样品

13、比较的Kruskal-Wallis Test（R中的kruskal.test）。最后利用Alpha多样性指数绘制盒形图。差异分析与作图均通过R软件（v3.1.1）进行。 基于 OTU 的结果，我们计算了样品的 Alpha 多样性（表2-2）。Alpha 多样性是对单个样品中物种多样性的分析。chao1多样性估算指数是根据所测得的 tags 数和 OTU 的数量以及相对比例来预测样品中微生物的种类（OTU 的数量），是基于已知结果所得相对值。Shannon 指数是一个综合 OTU 丰度和 OTU 均匀度两方面因素的一个多样性指数，Shannon 及observed number of speci

14、es、 Phylogenetic diversity (PD, whole tree) 指数越大，则表示该样品中的物种越丰富。表2-2 样品的 Alpha 多样性#Alphamean(CA)mean(HC)mean(LK)Pvalue(KW)p-vaule(CA-HC)p-vaule(CA-LK)p-vaule(HC-LK)chao1488.357.422.0.0.0.0.observed_species243.161.199.0.0.0.0.PD_whole_tree16.13.15.0.0.0.0.shannon3.2.3.0.0.0.0.Rarefaction分析（样本不分组）：图2-4

15、 单个样品内的Alpha 多样性Rarefaction分析（样本分组）：图2-5 每组样品内的Alpha 多样性。图中红色,黄色,蓝色线分别表示CA, HC, LK组的rarefaction分析结果图2-6为组Alpha多样性盒形图，更直观显示组间Alpha多样性差异。盒形图可以显示5个统计量（最小值，第一个四分位数，中位数，第三个中位数和最大值，及由下到上的5条线），异常值以“º”标出。 Alpha多样性的比较，以Shannon index为例可以看出多样性CA>LK>HC，其中CA/HC有明显差异(P=0.008, Students t test)，而CA/LK, H

16、C/LK差异不显著2.3.2 样品间复杂度比较分析Beta多样性（Beta diversity）分析是用来比较一对样品在物种多样性方面存在的差异大小。本分析中通过QIIME（v1.8.0）软件，采用迭代算法，分别在加权物种分类丰度信息和不加权物种分类丰度信息的情况下，随机抽取各样品中75% Reads单独进行差异计算，迭代100次之后综合统计得到最终的统计分析结果表及PCoA展示图。Beta多样性热图使用R（v3.1.1）软件中的NMF包的aheatmap进行作图。 UniFrac是通过利用系统进化的信息来比较样品间的物种群落差异。其计算结果可以作为一种衡量beta diversity的指数，

17、它考虑了物种间的进化距离，该指数越大表示样品间的差异越大。报告中给出的UniFrac结果分为加权UniFrac（weighted UniFrac）与非加权UniFirac（unweighted UniFrac）2种，其中weighted UniFrac考虑了序列的丰度，unweighted UniFrac不考虑序列丰度。 从下面盒形图看，CA组内的物种丰度最大。Weighted Unifrac 图2-7 Beta多样性的盒形图Unweighted UnifracUnifrac距离的主坐标分析(PCoA)如下：Weighted UnifracUnweighted Unifrac图2-8 Beta

18、多样性的主坐标分析(PCoA)图。 如果两个样品距离越近，则表示这两个样品的组成越相似。不同处理或不同环境间的样品可能表现出分散和聚集的分布情况，从而可以判断相同条件的样品组成是否具有相似性。图2-9 UniFrac距离分布heatmap。通过对UniFrac结果的聚类，具有相似beta多样性的样品聚类在一起，反应了样品间的相似性。2.3.3 物种组成分析本分析中分组后各水平的分类比较柱形图是用QIIME（v1.8.0）软件得到的，单个样品的群落分布柱形图和盒型图是根据QIIME（v1.8.0）软件计算的结果用R（v3.1.1）软件画的。 样品的群落分布图，直观的反应各样品的群落组成。从门水平

19、的群落分布图中可以看出，在这批样品中，占主要地位的门有 Firmicutes，Proteobacteria。2.3.3.1 门(phylum)水平比较 图2-10 分组后门水平的分类比较。从左至右分别为CA,HC,LK的物种组成。 图2-11样品的门水平群落分布图2.3.3.2 纲(class)水平比较图2-12 分组后纲水平的分类比较。从左至右分别为CA,HC,LK的物种组成。 图2-13样品的纲水平群落分布图2.3.3.3 属(genus)水平比较 图2-14样品的属水平群落分布图含量最高的25个属的物种组成如下： 可以看出，这些样本中含量最高的属为Streptococcus, Neiss

20、eria, Neisseriaceae (family), Campylobacter, Bacillus, Gemellaceae, TM7-32.3.4 多组样本的比较分析下面的表格都是通过QIIME（v1.8.0）软件计算出的，热图是用R（v3.1.1）软件画的。2.3.4.1.1 OTU水平的比较分析下表是在不同组样本间有显著差异的OTUs（P<0.05, Kruskal-Wallis test），共35个OTUP valueCA_meanHC_meanLK_meanLineage0.0.0.0.s_Streptococcus_infantis0.1.334E-059.02E-0

21、53.309E-05s_Streptococcus_infantisCU.OTU36090.0.4.302E-057.37E-05s_Streptococcus_infantisCU.OTU39510.0.0.0.s_Streptococcus_infantis0.4.506E-052.515E-050.s_Selenomonas_noxia0.0.2.728E-053.53E-05s_Prevotella_tannerae0.0.0.0.s_Haemophiluspara_influenzae0.4.681E-057.871E-050.s_Capnocytophaga_ochraceaCU.

22、OTU15120.0.5.314E-054.729E-05s_Campylobacter_rectusCU.OTU42480.3.144E-053.67E-050.s_Actinobacillus_porcinusCU.OTU46690.0.00.o_LactobacillalesCU.OTU28840.0.0.0.o_Gemellales0.0.0.0.g_Streptococcus0.1.213E-057.16E-050.g_Streptococcus0.0.2.432E-054.272E-05g_Streptococcus0.0.0.0.g_Prevotella0.0.2.607E-05

23、5.232E-05g_Leptotrichia0.08.912E-050.g_Cardiobacterium0.0.0.0.g_Capnocytophaga0.0.7.529E-050.g_Capnocytophaga0.0.00.g_BacillusOTU190.0.0.0.g_Abiotrophia0.0.0.0.f_StreptococcaceaeCU.OTU44370.6.529E-055.103E-060.f_StreptococcaceaeOTU20.4.005E-059.346E-060.f_PasteurellaceaeCU.OTU38810.0.6.821E-050.f_Ne

24、isseriaceaeCU.OTU20270.0.8.193E-050.f_Neisseriaceae0.0.0.0.01988f_GemellaceaeCU.OTU1600.0.8.61E-063.201E-05f_Clostridiaceae0.0.0.0.f_Clostridiaceae6.38E-056.461E-058.711E-050.f_Carnobacteriaceae0.0.0.0.f_Carnobacteriaceae0.0.0.0.f_CarnobacteriaceaeOTU100.0.00.c_BacilliCU.OTU310.0.2.232E-053.781E-05 p_Firmicutes2.3.4.2 属水平的比较分析首先，PCA分析能够看出3组样本之间有一定程度的差异：其次，通过Kruskal-Wallis test分析可以找出在不同组间有明显差异(P<0.05)的属如下（共19个