第4讲 细胞核移植

1、6.4细胞核移植细胞核移植（一）定义（一）定义细胞核移植（Cell nuclear transfer）是一种利用显微操作技术将一种动物的细胞核移入同种或异种动物的去核成熟卵细胞内的技术。细胞核移植动物培育是用特定发育阶段的核供体及相应的核受体（去核的卵子）体外构建重组胚，通过胚胎移植达到扩繁种群的目的。细胞核移植所得到的动物为核质杂种。克隆动物克隆动物生物的主要遗传物质存在于细胞核中，因此克隆动物可以通过细胞核移植实现。与其他克隆的区别与其他克隆的区别克隆 (Clone)本意是指遗传上完全相同的分子、细胞或来自同一生物个体的无性繁殖群体。广义上的克隆包含有基因水平、细胞水平、胚胎水平、个体水平

2、上的复制。细胞工程的克隆克隆是指通过无性繁殖手段获得遗传背景相同的细胞群或个体的技术。通过植物组织培养再生植物属于植物个体的克隆。克隆动物一般指采用核移植、胚胎移植技术得到的动物。核移植主要包括胚胎细胞核移植和体细胞核移植。利用胚胎分割得到的动物属于广义上的克隆动物。（三）克隆动物的发展历史（三）克隆动物的发展历史1早在1892年，Driesch和Wilson就分别对海胆和文昌鱼分离卵裂球的进行了动物克隆的尝试。21938年，德国胚胎学家斯佩尔曼（Spemann）经提出“分化细胞的核移入卵子中能否指导胚胎发育”这样的设想，并在两栖类脊椎动物进行了克隆动物实验，由于当时技术等方面的原因使他没能找

3、到将细胞核导入卵细胞的方法。31952年Briggs和King成功地在豹蛙上获得了胚胎细胞核移植后代。41980年中国将鲫鱼胚胎细胞移入鲤鱼去核的未受精卵中实现了不同种间的核质杂交，成功地无性繁殖了“鲤鲫核鱼”新品种。5-1984年，丹麦科学家斯丁维拉德森成功利用胚胎细胞克隆出一只绵羊，这是首次证实的通过核移植技术克隆哺乳动物。证明胚胎细胞具有全能性。里程碑式的突破里程碑式的突破61997年，英格兰爱丁堡罗斯林研究所和PPL制药公司利用高度分化的绵羊乳腺上皮细胞，通过核移植克隆了一只雌性小绵羊多莉。这是第一个体细胞克隆动物。 证明：成熟的体细胞也具有全能性。 （二）技术流程（二）技术流程细胞核

4、移植克隆动物技术环节主要包括：核供体细胞的准备受体细胞的去核细胞核移植、激活重组胚的培养与移植核移植后代的鉴定。1核供体细胞获得与取核供核细胞可以是动物原代细胞或传代细胞。分离制备单个动物细胞，体外培养得到正常二倍体体细胞系，然后进行15 天的缺血饥饿培养，诱使细胞处于“静止”状态（一般进入G0 期）。采用细胞松弛素B（Cytochalasin B）诱发细胞排核或者显微操作取核等方法得到细胞核。2受体细胞去核可以用微细玻璃管吸除第一极体及处于分裂中期的染色体和周围的部分细胞质。也用荧光染料Hoechst33342对卵细胞DNA进行染色，在紫外观察下去核可提高去核成功率。也可以使用Hoechst

5、33342与卵细胞DNA结合后，用紫外线定点照射使核功能丧失。3 细胞核移植细胞核移植可以采用胞质内注射和透明带下注射方法。前者是用微吸管吸取供体核后，直接注射进卵子细胞质；后者是把细胞核注射进透明带和卵细胞间的卵周隙中。在细胞核移植时，供体和受体细胞周期的影响非常重要。处于G0/G1 的细胞为二倍体，会凝集成单个染色单体，处于G2 期的4倍体核会凝集成双倍染色单体。处于活跃复制的核（S期）会形成典型的“粉末状”形态，会引起DNA损伤。研究发现将G1期双倍体核移入激活的MII期卵中获得了较高的重构胚发育几率。4激活正常受精卵的发育启动和早期卵裂主要由卵母细胞胞质中母源信息所控制，成熟的卵母细胞

6、质能使移入的细胞核在形态上和功能上发生变化，从而导致供核回复到初始状态，基因从头开始顺序表达。重组胚的发育需要进一步激活，可以采用电激活和化学激活方法。电激活是可把重组胚放在电融合槽两极之间，用几次瞬时直流脉冲刺激使其激活。化学激活常用的激活剂包括乙醇、SrCl2、放线菌酮、离子霉素等。5重组胚培养和移植激活后的重组胚可以采用体内和体外两种培养方式。体内培养是将重组胚植入同种或异种动物的输卵管中发育至囊胚或桑葚胚，然后进行胚胎移植。体外培养是将重组胚在特定培养液中培养至囊胚，选择优质胚胎移入同种的同期发情的受体中继续发育。6体细胞核移植后代的鉴定对于体细胞核移植培育的动物，可以从形态性别上鉴定

7、，还可以采用分子生物学技术鉴定。（三）胚胎细胞克隆动物（三）胚胎细胞克隆动物（四）（四）体细胞克隆动物体细胞克隆动物（1）定义）定义体细胞克隆体细胞克隆技术是将动物体细胞经过抑制培养使其处于休眠状态，利用细胞核移植技术将其导入去核卵母细胞，培育成早期胚胎，将胚胎移植至受体，妊娠产仔培育出与核供体一样的成体动物的一种细胞工程技术。 （2）意义问题思考：问题思考：A-理论价值理论价值：高度分化的高度分化的体细胞具有全能性B-实践意义实践意义：由于体细胞数量丰富并且易于获得，因此体细胞克隆动物技术在加快珍稀动物繁殖，抢救濒危动物（如大熊猫）方面意义重大。可以用患者本人细胞培育出新组织。（3）基本过程

8、）基本过程核供体动物的选择与细胞核的获得。核受体动物的选择与细胞核的移出。供体核的移入及原核的取出。胚泡的体外试管培养。代母的选择与胚泡移入子宫。克隆动物的体内发育与出生。应用举例应用举例多莉羊多莉羊技术路线：技术路线：具体步骤具体步骤1-供核细胞获得与取核供核细胞获得与取核取一只6岁已妊娠到后期的白色的芬兰多特西母羊的乳腺组织，酶消化分解成单个细胞，将这些细胞平铺在新鲜的细胞营养层（滋养层）上培养7天，将这些细胞转移到却乏营养的培养基上培养传代，其培养基的胎牛血清浓度从10%下降至0.5%，这样使细胞停在休止期（G0） 。（传到7-9代时，供体细胞可停在休止期，此时细胞染色体为54个，是二倍

9、体）。在倒置显微镜下，用显微吸管将核吸出。2-卵母细胞收集与去核卵母细胞收集与去核受体卵细胞来自于苏格兰黑绵养，在注射促性腺释放素(GnRH)28-33h时，收集卵细胞。在倒置显微镜的视野下用显微吸管刺入，吸取中期染色体和少量细胞质。去核后卵细胞放在无钙镁，但含有1%胎牛血清的磷酸盐缓冲液中复原，然后转移到37度无钙、但含有10%的胎牛血清的M2培养液中保存备用。3-3-细胞核融入卵细胞细胞核融入卵细胞将核和已去核卵细胞放入同一培养皿中，在交变脉冲电压为3伏的电场中融合5分钟，再用1.25千伏/厘米，80微秒，直流电脉冲3次，将乳腺细胞核融入卵中形成一个含有新遗传物质的卵细胞，称之为重构胚。4

10、-重构胚的培养将重构胚种植在绵羊结扎的输卵管中培养，大约培养6天后，大多数胚胎发育到桑椹期或囊胚期（816个细胞）。再选择发育优良的重构胚移植到苏格兰黑绵羊的子宫中，每只受体母羊移植1-3个重构胚。5-妊娠监护妊娠60天时用超声波诊断妊娠。每两周进行一次全方位监护胎儿发育。分娩时由兽医外科医生助产。产下多莉即为6岁母羊的复制品，也为白色。人类胚胎克隆与克隆人人类胚胎克隆与克隆人2001年研究人员将一枚卵细胞中的DNA全部剔除，然后用一枚成年人皮肤细胞中的细胞核替代上述DNA，得到3个早期胚胎，其中两个发育到4细胞阶段，另一个至少发育到6细胞阶段。证明人体单个细胞的遗传物质能被诱导发育成为幼胚胎

11、，因此这项研究被认为是向着克隆人的方向迈出了关键一步。克隆人？克隆人？布瓦瑟利耶安蒂诺里克隆引起的伦理学问题讨论讨论题：讨论题：1-动物可以无休止地被克隆吗？动物可以无休止地被克隆吗？2-你是否同意生殖性克隆？无性生殖是否是你是否同意生殖性克隆？无性生殖是否是人类的倒退？人类的倒退？3-英雄、伟人可以通过克隆再生吗？英雄、伟人可以通过克隆再生吗？问题1：克隆羊多莉刚出生时，它的染色体显示已经有好几岁了。2003年它已经永远离开了我们。6岁。供体6岁。苏格兰罗斯林研究院的科学家们对多莉的染色体做了仔细的研究，发现其染色体末端端粒比同龄的普通绵羊短。端粒是决定细胞老化的主要因素，端粒越短的细胞越接

12、近死亡。变短的端粒或许表明遗传的蓝本会随着时间流逝而老化，无休止地克隆一个动物是不可能的。关于端粒关于端粒每一条染色体的末端都有特殊的结构叫端粒(telomere)。每一个端粒都含有一系列的短的正向重复顺序。在细胞中，端粒总是和一些非组蛋白相结合，形成复合体。它可以保持染色体的稳定性，丢失了端粒的染色体很容易和别的染色体相接形成双着丝粒染色体或自身首尾相联形成环状染色体，前者在减数分裂后期会产生染色体桥(chromosome bridge)，最终引起染色体的重复与缺失。生殖细胞可以重建与延长端粒的DNA；而体细胞则随着复制次数的增加端粒DNA会逐渐缩短。Harley等（1989年）用人的端粒重

13、复片段为探针对胎儿、新生儿、青年和老年人的细胞株的端粒长度进行了研究，发现随着年龄的增加，人成纤维细胞端粒的长度不断下降。因此端粒DNA可能决定了细胞的寿命，并与细胞的自然凋亡与癌变密切相关。1990年Harely等则认为端粒的长度可反映细胞有丝分裂的次数。端粒象是细胞分裂的“计数器”。问题2：许多国家出台法律禁止生殖性克隆。有性生殖是历史进化的结果，利于种族繁衍和生存，以及优良性状的形成。选择无性生殖克隆的方式不利于遗传多样性的保护。从有性繁殖到无性繁殖，就进化而言是一种退化。克隆动物存在的问题克隆动物存在的问题1） 技术尚不成熟技术尚不成熟得到的克隆动物具有极大的偶然性和随机性。迄今为止，

14、克隆试验的成功率始终很低。例如，在培育多莉的过程中，科学家共克隆出个绵羊胚胎，最终成功使母羊受孕并生产的只有多莉一个。目前，多莉羊的制备还不能重复，更不能肯定克隆多莉羊的方法也适用于其它动物或其它不同组织器官的细胞。2） 遗传、疾病问题 克隆动物夭折率高，不少克隆动物天生患有疾病或体形过大。克隆羊和克隆牛都有体形过度庞大的问题。该缺陷在克隆鼠身上也存在。克隆牛、羊、猪都存在发育不良、免疫系统 缺陷和心肺功能不健全的问题。克隆动物没有遗传物质的交流和互补，将会加剧一些遗传疾病的发生。 3） 克隆人带来的社会、伦理学问题父子？兄弟？母亲？归属感？人的唯一性问题。犯罪问题我是谁？“多利羊”制造者反对克隆人伊斯维姆伊斯维姆.穆特穆特“我认为，已经有足够的证据表明，克隆人的行动是完全不负责