质粒提取及双酶切鉴定

1、LOGO质粒提取及双酶切鉴定质粒提取及双酶切鉴定2011年年5月月9日日 主要内容主要内容实验目的及原理实验目的及原理1实验过程实验过程2实验结果实验结果3思考题思考题4一、实验目的及原理二、实验原理v质粒质粒(Plasmid) (Plasmid) ： 独立于染色体外的，能自主复制且稳定遗传的独立于染色体外的，能自主复制且稳定遗传的遗传因子，是一种环状的双链遗传因子，是一种环状的双链DNADNA分子。分子。 存在于细菌、放线菌、真菌以及一些动植物细存在于细菌、放线菌、真菌以及一些动植物细胞中，在细菌细胞中最多。胞中，在细菌细胞中最多。 本实验采用本实验采用SDSSDS（十二烷基硫酸钠）碱裂解法

2、提取（十二烷基硫酸钠）碱裂解法提取质粒质粒DNADNA。将细菌悬浮液暴露于高。将细菌悬浮液暴露于高pHpH值的强阴离子洗涤值的强阴离子洗涤剂中，会使细胞壁破裂，染色体剂中，会使细胞壁破裂，染色体DNADNA和蛋白质变性，将和蛋白质变性，将质粒质粒DNADNA释放到上清中。在裂解过程中，细菌蛋白质、释放到上清中。在裂解过程中，细菌蛋白质、破裂的细胞壁和变性的染色体破裂的细胞壁和变性的染色体DNADNA会相互缠绕成大型复会相互缠绕成大型复合物，被十二烷基硫酸盐包盖。当用合物，被十二烷基硫酸盐包盖。当用K K+ +取代取代NaNa时，这时，这些复合物会从溶液中有效地沉淀下来。离心除去变性剂些复合物会

3、从溶液中有效地沉淀下来。离心除去变性剂后，就可以从上清中回收复性的质粒后，就可以从上清中回收复性的质粒DNADNA。v 限制性核酸内切酶（限制性核酸内切酶（restriction restriction endonucleaseendonuclease）是一）是一类能识别双链中特定碱基顺序的核酸水解酶，这类能识别双链中特定碱基顺序的核酸水解酶，这些酶都是从原核生物中发现。些酶都是从原核生物中发现。v 根据限制酶的识别切割特性、催化条件及是否具有修饰根据限制酶的识别切割特性、催化条件及是否具有修饰酶活性可分为酶活性可分为、型三大类，我们这里用到的是型三大类，我们这里用到的是型。型。v 型限制性内

4、切酶它们能识别双链的特异顺序，型限制性内切酶它们能识别双链的特异顺序，并在这个顺序内进行切割，产生特异的片段。并在这个顺序内进行切割，产生特异的片段。 如如EcoEcoRIRI的识别顺序为：的识别顺序为： 5 G5 G| |AATTC 3AATTC 3 3 CTTAA 3 CTTAA| |G 5G 5 在双链上交错切割的位置切割后生成在双链上交错切割的位置切割后生成 5G AATTC3 5G AATTC3 3CTTAA G5 3CTTAA G5三、实验材料与试剂（一）材料（一）材料 大肠杆菌大肠杆菌DH5DH5（含有携带插入片段（含有携带插入片段gcpgcp的质粒的质粒PMD19-TPMD19

5、-T）三、实验材料与试剂（二）试剂（二）试剂 (1)(1)溶液溶液: : TrisHCl(pH8.0) 25mmol/L TrisHCl(pH8.0) 25mmol/L EDTA(pH8.0) 10mmol/L EDTA(pH8.0) 10mmol/L 葡萄糖葡萄糖 50mmol/L50mmol/L (2) (2)溶液溶液(新鲜配制新鲜配制) :) : NaOHNaOH 0.2mol/L 0.2mol/L SDS 1%(W/V) SDS 1%(W/V) (3)(3)溶液溶液(100ml):(100ml): 5mol/L 5mol/L乙酸钾乙酸钾 60ml60ml 冰乙酸冰乙酸 11.5ml(p

6、H4.8)11.5ml(pH4.8) 水水 28.5ml28.5ml (4) (4) 苯酚苯酚 (5) (5) 氯仿：异戊醇（氯仿：异戊醇（24:124:1） (6) (6) 无水乙醇、无水乙醇、70%70%乙醇、醋酸钠（乙醇、醋酸钠（pH5.2pH5.2）（三）限制性内切酶（三）限制性内切酶 1 1）EcoEcoRIRI 识别顺序为：识别顺序为：5 G5 G| |AATTC 3AATTC 3 3 CTTAA 3 CTTAA| |G 5G 5 2 2）XhoIXhoI 识别顺序为：识别顺序为：5 C5 C| |TCGAG 3TCGAG 3 3 GAGCT 3 GAGCT| |C 5C 5四、实

7、验步骤1. 1. 挑转化后的单菌落接种到含有适当抗生素挑转化后的单菌落接种到含有适当抗生素(Amp)(Amp)的的LBLB液液体培养基中体培养基中,37,37振荡培养过夜。振荡培养过夜。2. 2. 将将1ml1ml的培养物倒入的培养物倒入1.5ml1.5ml的的EPEP管中管中, , 44、12000rpm12000rpm离离心心1min1min。弃去培养液，使细菌沉淀尽可能干燥。弃去培养液，使细菌沉淀尽可能干燥。3. 3. 将细菌沉淀重悬于将细菌沉淀重悬于100100l l冰预冷的溶液冰预冷的溶液中中, , 吹打沉吹打沉淀至完全混匀淀至完全混匀( (无块状悬浮无块状悬浮) )。4. 4. 加

8、加200200l l新配制的溶液新配制的溶液,立即温和颠倒离心管立即温和颠倒离心管5 5次，次，使菌体充分裂解使菌体充分裂解, , 切勿振荡切勿振荡! !将离心管放置于冰上将离心管放置于冰上1-1-2min2min。( (不要超过不要超过2min)2min)。5. 5. 加加150150l l用冰预冷的溶液用冰预冷的溶液III,III, 反复温和颠倒反复温和颠倒5 5次次, , 将将管置于冰上管置于冰上3 35min5min。6. 4 6. 4 、12000rpm12000rpm离心离心15min,15min,将上清液约将上清液约400ul400ul转移到另转移到另一离心管中。一离心管中。7.

9、 7. 加加1/21/2体积的苯酚，体积的苯酚，1/21/2体积的氯仿：异戊醇（体积的氯仿：异戊醇（24:124:1）振荡混匀。振荡混匀。 4 4 、12000rpm12000rpm离心离心10min10min，将上清液约，将上清液约400ul400ul转移到另一离心管中。转移到另一离心管中。8. 8. 加加2 2倍体积的无水乙醇和倍体积的无水乙醇和1/101/10体积的醋酸钠沉淀质粒体积的醋酸钠沉淀质粒DNA,DNA,振荡混匀振荡混匀, ,于于20 20 放置放置15min15min。9.4 9.4 、12000rpm12000rpm离心离心5min5min。小心除去上清液，将附于管。小心除

10、去上清液，将附于管壁的液滴除尽。壁的液滴除尽。10. 10. 加加1ml 701ml 70乙醇溶液洗涤沉淀，乙醇溶液洗涤沉淀，4 4 、12000rpm12000rpm离心离心5min5min。弃去上清液，在空气中使。弃去上清液，在空气中使DNADNA沉淀干燥。沉淀干燥。11. 11. 用用2020l l灭菌的蒸馏水溶解灭菌的蒸馏水溶解DNA,DNA,加加1 1l l胰胰RNARNA酶消化酶消化RNA 30minRNA 30min。（二）双酶切及电泳检测I I 1.5ul 1.5ulXhoIXhoI 1.5ul 1.5ul1010Buffer 2ulBuffer 2ulDDW 8ulDDW 8ul五、实验结果v质粒电泳图质粒电泳图 有三条条带，分别是超螺旋、线性和开环结构