法医物证学考点

1、法医物证学：是以法医物证为研究对象，以提供科学证据为目的，研究应用生命科学技术解决案件中与人体有关的生物检材鉴定的一门学科。法医物证学是法医学的分支学科，其研究内容属于法医学中的物证检验部分，是法医学研究的主要内容之一。法医物证的特点：法医物证的稳定性受环境条件的影响；法医物证属于“科学证据”。法医物证学生物检材遗传标记个人识别遗传（heredity）：生物繁衍过程中，子代与亲代相似的现象。变异（variation）：生物繁衍过程中，子代与亲代有所不同的现象。遗传标记（genetic marker，GM）：个体的单位遗传性状作为标志用于法医物证分析时，这种遗传性状就称为遗传标记。遗传性状，即生

2、理生化特征，可作为标志来识别携带它的个体、细胞和染色体。单位遗传性状是指可检测的、由遗传决定的、并能够以一定的规律从亲代传给下一代的形态学、生理学及分子生物学特征。DNA的变性和复性：某些理化因素（温度、PH、离子强度等）会导致DNA双链互补碱基对之间的氢键发生断裂，使双链DNA解离为单链，这种现象称为DNA变性。DNA变性只改变其二级结构，不改变它的核苷酸序列。当变性条件缓慢地除去后，两条解离的互补链可重新配对，恢复原来的双螺旋结构,这种现象称为复性（renaturation）。融链曲线的中点所示温度称作该DNA分子的融链温度（melting temperature，Tm），Tm是一半DNA

3、分子变性时的温度。串联重复序列（tandem repeats）：其结构形式是以相对恒定的短序列作为重复单位，首尾相接，串联连接形成。在人类基因组中，串联重复序列约占10%，主要分布在非编码区，少数分布于编码区。编码区中的重复DNA与功能有关，非编码区串联重复DNA多分布在间隔DNA或内含子。短串联重复序列（short tandem repeats，STR）：可变数目串联重复序列（variable number of tandem repeats，VNTR）：假基因（pseudogene）：是基因组中丧失功能的基因，这类基因或是在复制扩增过程中因为突变失去了调控信号，不再具有转录功能；或丢失拼接

4、加工信号，转录产物无法正确拼接形成成熟mRNA；或在编码区形成终止信号，产生不完整肽链。多基因家族（multigene family）：是指一组具有功能相似，碱基序列相同或部分同源的基因。转座子（transposon）：又称为可移动DNA成分，是指DNA分子内或分子间可以转移的DNA片段。除散布重复序列外，转座子还包括DNA形式转座子和拟反转录病毒反转录转座子元件。端粒（telomere）：线性形式基因组DNA的末端都有一种特殊的结构，是一段DNA和蛋白质形成的复合结构，叫做端粒。DNA的甲基化修饰：生物体在DNA甲基转移酶（DNA methyltransferase，DNMT）的催化下，以S

5、-腺苷甲硫氨酸（SAM）为甲基供体，将甲基转移到特定的碱基上的过程。甲基化修饰修饰限于CG序列中的胞嘧啶。基因突变的分类：生物体的基因组DNA并不稳定，经常会出现各种各样的可遗传的改变，在子代留下变异的遗传信息。在DNA分子水平，DNA损伤的后果之一就是突变（mutation）。主要分为编码区碱基突变和非编码区突变两种。编码区碱基突变：碱基替代在基因组中是最常见的突变形式，分转换（transition）和颠换（transversion）两种。非编码区突变：非编码区DNA没有表达产物，DNA复制中也能够出现碱基的错配、插入和缺失，但是对细胞正常生理过程不构成实质性影响。无论在编码区或非编码区，突

6、变的后果从没有效应到有害效应和有利效应，各种情况都会出现。碱基替换：碱基转换、碱基颠倒碱基序列改变 基因突变碱基排列改变：倒位、易位碱基数目改变：插入、缺失、重复同义突变（same sense mutation）：是指DNA组成变了，但密码子没有改变，或密码子虽然不同，但编码产生同一种氨基酸，这种突变又称中性突变。错义突变（missence mutation）：是指DNA组成改变使编码一种氨基酸的密码子改变成编码另一种氨基酸的密码子。无义突变（nonsense mutation）：是指某一碱基的替换使氨基酸密码子变为终止密码，可过早地终止转录，形成无活性的肽链。移码突变（frameshift

7、mutation）：DNA链上插入或缺失一个或n个核苷酸，使下游密码子阅读框发生变化，导致在插入或缺失部位以后的编码发生相应改变。终止密码突变：是DNA分子中的某一终止密码突变为编码氨基酸的密码子，从而使多肽链的合成至此仍继续下去，直至下一个终止密码为止，形成超长的异常多肽链。沉默突变（silent mutation）：仅改变表达产物的单个氨基酸，对蛋白质的生理功能没有影响的点突变，是形成蛋白质多态性的主要原因。DNA多态性（DNA polymorphisms）：基因水平上的多样性来自基因的突变，当基因突变以等位基因形式在群体中得以保留，并能够从亲代遗传给子代，可形成个体间的遗传差异。不同个体

8、间的遗传差异形式是不同的等位基因组成。等位基因之间的差异可以是点突变引起的序列不同，也可以是因为碱基的插入或缺失引起的片段长度不同，都能构成具有个体特征的DNA遗传标记。DNA遗传标记可以出现在编码区，也可以存在于非编码区。在基因组DNA中，这种由不同碱基结构的等位基因所形成的多态性叫做DNA多态性。DNA长度多态性（DNA length polymorphisms）：是指同一基因座上各等位基因之间的DNA片段长度差异构成的多态性。DNA长度多态性靶序列主要是指可变数目串联重复序列（VNTR），VNTR既存在于小卫星DNA中，也存在于微卫星DNA中。由于命名习惯和为了便于区分，通常小卫星DNA

9、中的可变数目串联重复序列称为VNTR，而把微卫星的可变数目串联重复序列称为短串联重复序列（STR）。DNA序列多态性（sequence polymorphisms）：是指一个基因座上，因不同个体DNA序列有一个或多个碱基的差异而构成的多态性。可以理解为该基因座上所有等位基因DNA长度相同，但是它们之间的序列存在差异。在基因组DNA中，无论是编码区或者非编码区，单碱基替换是最基础的突变形式。在人类基因组范围内，如果任何单碱基突变使特定核苷酸位置上出现两种碱基，其中最少的一种在群体中的频率不少于1%，就形成单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms，SNPs）。

10、限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）：RFLP分析是一种传统的分子生物学检测技术，广泛应用于突变分析、基因诊断、基因定位等各个方面。法医物证鉴定应用RFLP技术主要是对人类基因组中的VNTR基因座进行分型，其技术核心是DNA分子杂交，决定RFLP分析图谱个体特异性的因素是限制性核酸内切酶的特异性和探针的特异性。检测所用的探针多是由人类基因组DNA中筛选出的小卫星序列，选择特异性不同的探针，在不同的杂交条件下，可以只检出单个VNTR基因座，也可同时检出多个VNTR基因座，前者称为DNA纹印，后者称之为DNA指纹，检测所

11、用的相应探针分别被称为单基因探针（single-locus probe）和多基因探针(multi-locus probe)。Southern印迹杂交：是进行基因组DNA特定序列定位的通用方法。一般利用琼脂糖凝胶电泳分离经限制性内切酶消化的DNA片段，将胶上的DNA变性并在原位将单链DNA片段转移至尼龙膜或其他固相支持物上，经干烤或者紫外线照射固定，再与相对应结构的标记探针进行杂交，用放射自显影或酶反应显色，从而检测特定DNA分子的含量。其基本原理是：具有一定同源性的两条核酸单链在一定的条件下，可按碱基互补的原则形成双链，此杂交过程是高度特异的。由于核酸分子的高度特异性及检测方法的灵敏性，综合凝

12、胶电泳和核酸内切限制酶分析的结果，便可绘制出DNA分子的限制图谱。Southern印迹杂交（Southern blot）是研究DNA图谱的基本技术，在遗传病诊断、DNA图谱分析及PCR产物分析等方面有重要价值。Southern印迹杂交的基本方法是将DNA标本用限制性内切酶消化后，经琼脂糖凝胶电泳分离各酶解片段，然后经碱变性，Tris缓冲液中和和高盐下通过毛吸作用将DNA从凝胶中转印至硝酸纤维素膜上、烘干固定后即可用于杂交。凝胶中DNA片段的相对位置在DNA片段转移到滤膜的过程中继续保持着，附着在滤膜上的DNA与32P标记的探针杂交，利用放射自显影术确立探针互补的每一条DNA带的位置，从而可以确

13、定在众多消化产物中含某一特定序列的DNA片段的位置和大小。（琼脂糖凝胶电泳硝酸纤维素膜吸印）。限制性内切酶常见的有那些？限制性内切酶（restriction endonuclease）：一种在特殊核甘酸序列处水解双链DNA的内切酶。型限制性内切酶既能催化宿主DNA的甲基化，又催化非甲基化的DNA的水解；而型限制性内切酶只催化非甲基化的DNA的水解。合成引物的要点，PCR的反应组成：标准的PCR反应体系10×扩增缓冲液10l4种dNTP混合物200l引物10100l模板DNA0.12gTaq DNA聚合酶2.5 lMg2+1.5mmol/L加双或三蒸水100 lPCR反应五要素：参加P

14、CR反应的物质主要有五种即： 模板DNA，寡核苷酸引物，dNTP，反应缓冲液，TaqDNA聚合酶。PCR基本原理：PCR技术是模拟生物体内DNA的半保留复制，在体外合成DNA链的方法，在模板、DNA、引物、dNTP、Taq酶存在的条件下经过：“高温变性低温退火中温延伸”三步循环，获得大量扩增片段。合成引物的要点：引物合成是通过测定引物的OD值，溶解引物，最终合成引物的一个完善的过程。目前引物合成基本采用固相亚磷酰胺三酯法。亚磷酰胺三酯法合成DNA片段，具有高效、快速的偶联以及起始反应物比较稳定的特点。亚磷酰胺三酯法是将DNA固定在固相载体上完成DNA链的合成的，合成的方向是由待合成引物的3端向

15、5端合成的，相邻的核苷酸通过35磷酸二酯键连接。第一步，是将预先连接在固相载体CPG上的活性基团被保护的核苷酸与三氯乙酸反应，脱去其5-羟基的保护基团DMT，获得游离的5-羟基。第二步，合成DNA的原料，亚磷酰胺保护核苷酸单体，与活化剂四氮唑混合，得到核苷亚磷酸活化中间体，它的3端被活化，5-羟基仍然被DMT保护，与溶液中游离的5-羟基发生缩合反应。第三步，带帽(capping)反应，缩合反应中可能有极少数5-羟基没有参加反应(少于2%)，用乙酸酐和1-甲基咪唑终止其后继续发生反应，这种短片段可以在纯化时分离掉。第四步，在氧化剂碘的作用下，亚磷酰形式转变为更稳定的磷酸三酯。经过以上四个步骤，一

16、个脱氧核苷酸被连接到固相载体的核苷酸上。再以三氯乙酸脱去它的5-羟基上的保护基团DMT，重复以上步骤，直到所有要求合成的碱基被接上去。常染色体STR与性染色体STR有什么不同？常染色体STR：短串联重复序列(STR)是广泛存在于人类基因组中的一类具有长度多态性的DNA序列。它由26 个碱基对构成核心序列,呈串联重复排列,其长度多态性主要由核心序列拷贝数目的变化而产生。一般认为,人类基因组平均每610kb就有1个STR基因座,为法医个人识别和亲子鉴定提供了高信息基因座的丰富来源。与限制性片段长度多态性产生的DNA 指纹相比,用聚合酶链反应技术(PCR)扩增STR 基因座产生的DNA纹印具有更高的

17、灵敏度。STR扩增片段较短(100300bp),对于常见含部分降解 DNA的陈旧斑痕,PCR扩增STR比DNA指纹分析更容易成功。性染色体STR：人类Y染色体属于近端着丝粒染色体，由长臂Yq和微小的短臂Yp组成，DNA长度约60Mb。Y-DNA中大致有五类多态性遗传标记：卫星DNA、小卫星DNA、微卫星DNA、插入或缺失及SNP。Y染色体STR基因座（Y-STR）是其中一种重要的遗传标记。与常染色体STR基因座相比，大多数Y-STR基因座具有复杂的串联重复结构：一个基因座内常含有两种以上不同的重复单位，恒定重复序列和可变重复序列同时存在。与常染色体STR基因座比较，Y-STR分型的法医学应用具

18、有以下特点：Y染色体为男性所特有，Y-STR呈父系遗传特征，只能有父亲传递给儿子，在减数分裂过程中，Y-特异性区不发生重组，评估Y-STR鉴别能力的指标是遗传差异度，和mtDNA一样，Y-STR分型结果不具有唯一性，其法医学应用价值在于排除，而不能认定。X-STR基因座具有伴性遗传的特征，X-STR的遗传特征既不同于常染色体，也不同于Y染色体，表现为性连锁特征。进行分型检测时，男性个体X-STR显现一条片段，女性杂合子则显示两条等位基因片段。低拷贝DNA（low copy number，LCN）：是指基因组含量小于100pg的样本。PCR循环测序的基本原理：PCR技术能够快速、特异性地扩增靶D

19、NA，应用PCR技术测定DNA序列分为两个步骤：先利用PCR扩增靶序列片段，制备测序模板，然后再利用PCR直接测定序列。PCR测序采用了热循环高效合成DNA的特性并结合双脱氧核苷酸终止法，使引物链终止的延伸产物数量在热循环过程中得到增加，因此称为循环测序。每个测序循环包括：PCR扩增制备的模板DNA变性成单链形式；标记引物与其中的一条链上的互补序列退火；退火后的引物在耐热DNA聚合酶催化下发生链延伸终止反应。本次循环产生的模板链与延伸终止链形成的双链的产物，在下一轮测序循环中，再次被变性，释放出模板链，作为又一轮引发反应的模板，同时积累下一轮循环产生的链终止产物。上述循环步骤重复2040次，使

20、链终止产物以线性方式获得扩增。DNA自动测序技术：DNA自动测序技术是以4种荧光染料基团分别作为4种ddNTP终止链的标记物，于20世纪80年代末期建立的一种高效、快速、自动化的序列测定技术。4种荧光染料分别作为测序反应中4种ddNTP终止链的标记物，即4种被双脱氧核苷酸终止的DNA片段分别带上4种不同的颜色。这些DNA片段的混合物同时加在一个样品槽中电泳展开，相互间仅差1个碱基的DNA片段形成一条具有4种颜色的阶梯分布图像。阶梯中的每- DNA片段由标记在该片段上的特征性荧光基团发出的荧光所指示。荧光染料基团作为标记物的基本要求是经过激光诱发的吸收光谱波长在可见光波长范围内，不影响延伸反应，

21、不影响标记后DNA片段的电泳性质。其次要求4种荧光的吸收和激发光波长要有足够的差异，便于检测。荧光染料的掺入的方式有两种：一种是将荧光染料预先标记在测序反应通用引物的5端。4种荧光标记形成4种标记引物，测序反应分4个反应管进行，特定的荧光染料与相应的ddNTP是对应关系，例如荧光示踪染料JOE标记的通用引物总是与ddATP加在同一个反应管内，因此由ddATP终止的所有延伸链都带有JOE。这种方式被称为Dye-Primers。另一种是将荧光染料基团连在ddNTP上，4种荧光染料分别与4种ddNTP底物连接，反应产生的4组DNA片段分别由特定ddNTP所终止，并且标记有4种不同的荧光发色基团，A、

22、C、G和T分别携带有绿、红、蓝、黄4种荧光。这种方式被称为Dye-Terminators。两种方式各有特点，不过前者要求A，G，C，T分4个反应进行，而后者的4组反应可以在同一管中完成。上述两种方法都能确定4种荧光与4种ddNTP所终止的DNA片段之间的对应关系，这是后来从电泳中检测标记物信号以及最终读序的基础。自动测序仪器无论是变性PAG平板凝胶电泳还是毛细管电泳，都配置有激光束激发系统和荧光信号收集检测系统。当DNA片段电泳通过检测窗口时，在激光束的激发下，片段的电泳时间和被激发荧光的波长、强度等信号都被记录，由计算机自动作数据处理，最后在屏幕上显示每一样品的各终止片段电泳分离的模拟图像。

23、不同颜色的峰标示各自标记的碱基及其排列顺序(如图所示)：MVP（minisatellite variant repeat）序列：称为具有变异核心序列的小卫星DNA，是一类既有长度多态性又有序列差异的DNA重复序列。线粒体DNA的特点：人类线粒体的基因排列得非常紧凑，除与mtDNA复制及转录有关的一小段区域外，无内含子序列。mtDNA为高效利用DNA有5个阅读框架，缺少终止密码子，仅以U或UA结尾。mtDNA的突变率高于核中DNA，并且缺乏修复能力。mtDNA为母系遗传。部分mtDNA的密码子不同于核内DNA的密码子。血型（blood group）：是人类血液由遗传控制的个体性状之一，是血液的遗

24、传标记（genetic marker）。红细胞血型是指红细胞表面抗原由遗传决定的个体差异。化学结构抗原分布红细胞膜上分泌液中血浆中糖脂质HAB、PILea、Leb莫内蛋白Rh、Kell糖蛋白（寡糖+多肽）MN、HLAHAB、Lea、Leb蛋白质Gm、KmABO血型（重点）：ABO血型系统是最早发现，最重要的血型系统。人类学与遗传学研究、器官移植，以及法医学实践中的个人识别与亲子鉴定均需应用这个系统。.一、ABO血型.4种普通血型的划分及存在相应的抗体.1.红细胞ABO血型系统的分型。ABO血型系统分四种型：即O型、A型、B型与AB型。.2.四种血型个体血清中存在的相应抗体：血清中有天然抗体，B

25、型血清中有抗A抗体；A型血清中有抗B抗体；O型血清中有抗A、抗B及抗A，B等抗体；AB型血清中没有抗体ABO血型抗体恒定地存在于正常人的血清中，可以预测其存在，故称为规则抗体。.3.正常的A、B、AB、O型的检测。利用抗A与抗B血清，以及A与B型红细胞，可以测定未知血液的ABO血型。.二、ABO血型抗体.正常情况下，凡红细胞没有某一种或某两种ABO抗原，又无明显的外来A或B抗原的刺激，其血清中含有与红细胞上缺失抗原相对应的天然抗A、抗A1或抗B抗体。.(一) 抗A、抗B抗体的生成.新生儿血中的IgG抗A与抗B抗体多来自母体，故一般不对新生儿进行血型测定。36个月以内的婴儿，多数尚未产生抗A与抗

26、B抗体；6个月以后，抗体逐渐产生；510岁抗体效价达最高峰；随着年龄的增长，抗体效价逐渐降低，老年人抗体水平明显地低于年轻的成年人。.(二) 抗A、抗B抗体的特性.1、抗A与抗B抗体最显著的血清效应是凝集反应，在适当的条件下也可以发生溶血反应；.2、ABO血型测定都在室温中(2225)进行，偶尔在4下进行；.3、抗A和抗B抗体可以是天然的，也可以是免疫抗体；.4、B型与A型血液中的天然抗A与抗B抗体大多数是IgM；.5、天然IgM与IgG抗A与抗B抗体均能在盐水介质中使红细胞发生凝集反应，在室温中具有抗体活性。.(三)抗H抗体.由于O、A、B或AB型红细胞结构上含有H成分，故其血清中很少有抗H

27、抗体。.三、ABO血型的遗传.(一) 各种不同表型的双亲所生子女的血型。.(二) ABO血型按孟德尔规律遗传.ABO血型系统按孟德尔定律遗传，人类染色体上的一个座位为.A、B、O.三个等位基因之一所占，每一个体有一对染色体，一条来自父亲，另一条来自母亲，红细胞ABO型的表达由基因决定。ABO血型有4种普通型，由复等位基因.A、B及O.所控制，有6种基因型，决定4种表现型。四种表现型、六种基因型，一个基因座位，三个等位基因。.何谓ABO血型的正反定型？正定性试验：根据RBC与特异性抗体的反应来分型，即用抗A抗体判定A抗原，用抗B抗体判定B抗原。反定型试验：依据血清中的凝集素与标准型RBC膜上的凝

28、集原反应的性质，即用标准的A型RBC判定抗A抗体，用标准的B型RBC判定抗B抗体，同时也应用抗H抗体判定H抗原。试述ABO血型的DNA分型方法 PCR-SSP序列特异性引物PCR技术：特异性强、重复性好；PCR-RFLP。Rh血型：凡是人体血液红细胞上有Rh凝集原者，为Rh阳性。反之为阴性。这样就使已发现的红细胞A、B、O及AB四种主要血型的人，又都分别一分为二地被划分为Rh阳性和阴性两种。在中国，Rh阴性血型只占千分之三到四。RH阴性A型、B型、O型、AB型的比例是3：3：3：1。Rh血型鉴定：RhD抗原分布：Rh血型鉴定一般指Rh系统中D抗原的检测，根据病人红细胞是否带有D抗原分为Rh阳性

29、和Rh阴性。Rh血型鉴定正常值：Rh+，称作“Rh阳性”、“Rh显性”，表示人类红细胞有“Rh因子”；Rh-，称作“Rh阴性”，“Rh隐性”，表示人类红细胞没有“Rh因子”。HLA（human leukocyte antigen）抗原：即人类白细胞抗原，是人类最复杂的显性遗传多态性系统，也是迄今为止人类基因组中密度最高的区域。HLA系统具有极其重要的功能，如抗原的加工、呈递，控制免疫应答，调节免疫细胞间相互作用，对异体移植物的排斥，肿瘤监视，参与大量的自身免疫性疾病的发生。人类白细胞膜上的抗原分为三类：是红细胞血型抗原，如ABH、Lea、Leb、Jka、K、k、Dib等；是白细胞本身特有的抗原

30、，如CD4、CD8、Leu8等；是与其他组织共有的，也是最强的同种抗原，即人类白细胞抗原。HLA抗原的结构和分布：HLA-I类和HLA-II类抗原存在于细胞表面，为跨膜蛋白质，均为异二聚体蛋白。HLA-I类抗原分布广泛，几乎存在于所有的有核细胞表面，以淋巴细胞上的密度最高；含有HLA-II类抗原的组织比I类抗原少得多，密度最高者为树突状细胞、单核细胞，一些吞噬细胞亚群及B细胞。结构：HLA-I类基因产物为HLA-A、B和C抗原，由重链和轻链两条多肽链构成；HLA-II类基因产物为HLA-DR、DQ、DP抗原，均为跨膜糖蛋白，由和两条链构成。HLA遗传：HLA基因定位于6号染色体，占整个人类基因

31、组全部碱基序列的0.12%。HLA区主要有HLA-I、II、III类基因座。表现为：共显性遗传、单倍型遗传、连锁不平衡。HLA遗传特征：共显性遗传：每个HLA基因座表达一对抗原，人类HLA每个基因座上有众多等位基因。故如果血清学方法分型时，个体只检测出了一个抗原则有三种可能：该抗原的纯合子、HLA血清板不完全、存在一种至今尚未发现的抗原。单倍型遗传：单倍体是指一条染色体上HLA各基因座的基因紧密连锁组成的基因遗传单位。连锁不平衡：HLA在实际群体调查发现，各基因座的基因并非完全随机组成单倍型，有些单倍型观察频率高于期望频率或低于期望频率，这种现象称为连锁不平衡。处于连锁部平衡状态说明HLA不同

32、基因座的基因之间存在关联，具有一同遗传的趋向。HLA高多态性。HLA抗原的分布：HLA-I类抗原：分布广发，几乎存在于所有的有核细胞表面，以淋巴细胞上的密度最高；成熟RBC上没有HLA-A、B、和DR抗原，幼稚RBC却有；HLA-II类抗原：密度最高者为DC、单核细胞，一些吞噬细胞亚群及B细胞；II类抗原作为一种分化抗原在不同细胞上表达，大多数骨髓分化细胞具有HLA-II类抗原。HLA命名原则：以大写字母A、D、C.表示HLA遗传区域中的座位；HLA抗原特异性用数字表示；为防止与补体组分命名相混淆，HLA-C抗原特异性以Cw为字首命名；HLA基因命名一般以4位数字表示，其中前2位数字表示对应最相近的HLA抗原特异性，后2位数字则用于表示亚型的等位基因，如A*0101；如果出现第五位数字，则代表“沉默取代”，即该基因虽发生了个别碱基的替换，但新密码子与原密码子属简并密码，不影响所编码的氨基酸序列；第6、7位数字代表相应的启动子序列的多态性；末尾加英文字母N表示无效基因或不表达基因；在不能区分等位基因时，可允许最前面