酸乳中乳酸菌的分离鉴定及其活力的测定

1、指导老师：李作美班级：2012级食品质量与安全学生：芦雯学号：51206041015目录概述12材料与方法3结果与分析4结论5致谢背景 酸奶是日常生活中的一种传统的受欢迎的发酵型的乳制品，它的营养价值含量相当的丰富，并且对人体有很好的保健功效。意义蒙牛冠益乳中的乳酸菌主要为保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌。测定乳酸菌的OD值和产生酸能力来评定酸乳中乳酸菌的活力，对乳酸菌活力的测定，判定酸奶的最佳饮用时间，为酸奶的消费提供科学的依据，同时也对微生物做出研究。1. 概述2. 材料与方法 材料与设备酸奶中乳酸菌的培养分离 酸奶中乳酸菌 菌落数的测定生化试验鉴定乳酸菌产酸能力的测定生长曲线的绘制实验方法1培

2、养基的配制培养基的配制 称取MRS琼脂培养基66.2g，加热溶解于1000ml蒸馏水中，加热煮沸后，装入锥形瓶中，121高灭菌15min备用。2菌悬液的配制菌悬液的配制（1）拿1支洁净的锥形瓶，加入225mL的生理盐水；（2）取7只洁净的试管，各盛9mL的生理盐水；（3）塞上棉塞，用报纸包裹扎紧后，放入103kPa、121高压蒸汽灭菌20min； （4）用玻璃棒将酸奶样品搅拌均匀，吸取酸奶25mL，加入放有225mL无菌生理盐水的锥形瓶中，充分振摇，让酸奶样品均匀散布，这就是10-1的酸奶样品稀释液； （5）将7支盛有9mL生理盐水的无菌试管，分别标记为10-1、10-2、10-3、10-4、

3、10-5、10-6、10-7、10-8，利用无菌移液管吸取10-1的酸奶样品稀释液1mL，分别加入盛有9mL无菌生理盐水的试管中，再次稀释，得到10-2稀释液，同理得到 10-3-10-8的样品稀释液。3倒平板倒平板把经高温高压灭菌的MRS琼脂培养基冷却到45左右，按无菌操作法倒7只平板，倒平板时注意量的把握，浅浅的一层，待凝固。 4分离方法分离方法 用一支1mL无菌移液管分别吸取10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7和10-8的稀释菌悬液各1mL，分别接种在与之相对应的7个无菌平板中，每个平皿放稍许；马上用无菌玻璃涂棒将样品菌液均匀地涂布在平板，放置一段时间后，将之倒置，

4、最后放入37恒温箱中培养48h。5菌落观察菌落观察 恒温培养48h过后，取出培养平板；观察培养基内菌落的形态，找出乳酸菌菌落。6镜检镜检 选取一块干净的载玻片，在载玻片的中央滴加一滴生理盐水，在无菌操作法的环境下，用接种环挑取少量乳酸菌涂片；结晶紫初染碘液媒染乙醇脱色番红复染，干燥后用油镜观察。生化试验鉴定乳酸菌 糖发酵试验 试验方法：在无菌操作的环境下,用接种环挑取一定的量培养基上的乳酸菌,使之接种在发酵液体的培养基的试管中。在完成接种任务后,将乳酸菌培养基试管放入培养箱中培养。每天定时观察试验结果,观察培养基内颜色有没有发生变化，即有没有产酸。查看小倒管中有没有气泡产生,若出现微小气泡，也

5、可视为产气阳性。我们有的时候还能观察到接种的乳酸菌有没有动力,如果有动力,乳酸菌培养物就能飘散着生长在培养基中。 将麦芽糖、七叶苷、乳糖、蔗糖和葡萄糖五种糖的发酵培养基，分别加入试管中，高度约为整个试管的三分之二。分别用接种环挑取MRS琼脂培养基中的乳酸菌的疑似菌落接种在这几个试管中，放入二氧化碳培养箱中培养2-3d（37）。 各种生化指标的鉴定，获得乳酸菌的生化特性。 酸奶中乳酸菌菌落数的测定 （1）配置酸奶溶液 吸取1ml酸奶于一支标有10-1标号的无菌生理盐水中配成1：10的稀释液。 （2）稀释 吸取lmL混合均匀的1：10的酸奶稀释液加入标有10-2标号试管内，同理作10倍递增稀释液。

6、 吸取10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8八个梯度的酸奶稀释液，依次放入相应的无菌平皿中，每个平皿放浅浅的一层。 (3) 倒平板 平皿中加入稀释液后，马上把冷至45左右的改良TJA培养基加入平皿中，用1mL无菌生理盐水作空白对照，等待培养基凝固之后，把平板倒置，放入恒温培养箱中培养，温度在37左右，培养时间为48h。 (4) 观察计数： 观察乳酸菌菌落的形态特点，把菌落数在30-300之间的平板挑选出来，开始计数。则1mL检样中乳酸菌数为：(N1+N2) X A/2 注： 单位是：cfu/mL N1、N2-平行平皿中乳酸菌落个数 A-稀释倍数 挑选出乳

7、酸菌生长繁殖适宜的三个培养基平板，将培养分离出来的乳酸菌菌株，用接种环挑取一定量的菌种，将它接种在MRS培养基中，将之分别标号为1、2、3，然后将之放入恒温培养箱中，进行摇床培养。每隔2h测量一次乳酸菌的OD值，直至OD值不再明显变化为止。并通过实验所得到的OD值，绘制出乳酸菌的生长曲线，最后观察每个生长期的变化，找出指数期的时间段。活力的测定是指该菌种产酸能力，把正处在指数生长期的乳酸菌按3%的量接种到60mL的新鲜牛奶中，然后每隔2h测定一次牛奶的酸度变化，直至牛奶酸度变化不再明显。生长曲线的绘制产酸能力的测定3. 结果与分析酸奶中乳酸菌的分离培养糖发酵试验生理生化试验结果酸奶中乳酸菌的菌

8、落数测定结果生长曲线的绘制产酸能力的测定酸奶中乳酸菌的分离培养经过对乳酸菌菌落的观察，发现在MRS 琼脂培养基的7个平板上，10-7稀释度的菌落观察是最好的。经过MRS琼脂培养基分离的菌株, 有较大的菌落、透明、呈灰白的颜色、两面是凸起来的。镜检进一步观察，革兰氏染色阳性，油镜下观察，呈杆状的为保加利亚乳杆菌，呈链状并且为一个一个小球形的为是热链球菌。嗜热链 球菌的生 化鉴定结果嗜热链球菌的试验分析：葡萄糖和蔗糖糖发酵试管中的培养基由原来的紫色变化为黄色, 麦芽糖发酵培养基没有改变颜色, 45的温度下可以生长繁殖保加利亚乳杆菌的生化鉴定结果保加利亚乳杆菌的试验分析：乳糖发酵试管中的培养基由原来

9、的紫色变成了黄色, 葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、七叶苷均都没有改变颜色糖发酵试验 嗜热链球菌的生化鉴定结果保加利亚乳杆菌的生化鉴定结果 链球菌的生化特性 嗜热链球菌：能在 50条件下生长 30 min, 不能在 pH9.2、4.0% NaCl 条件下生长, 不可以水解精氨酸, 不产生氨气, 而且麦芽糖、蔗糖、棉子糖发酵都为阴性反应的乳酸链球菌。乳杆菌的生化特性 保加利亚乳杆菌不可以水解精氨酸, 乳糖发酵反应是阳性, 而其他四种糖（阿拉伯糖、麦芽糖、七叶苷、蔗糖、棉子糖、纤维二糖、核糖发酵）都是阴性反应的乳杆菌。生理生化试验结果酸奶中乳酸菌的菌落数测定结果 用直接计数法，记录每个平板的菌落数，然后计算

10、每个样液同一稀释度下的两个平板的平均菌落数。观察计数发现稀释度在10-7时计数最适宜，菌落数在30-300之间。酸奶样品测定在出厂间隔时间为3d时，蒙牛酸奶中的乳酸菌数分别为295、297；酸奶样品测定在出厂间隔时间为6 d时，蒙牛酸奶中的乳酸菌数分别为273、271；酸奶样品测定在出厂间隔时间为9 d时，蒙牛酸奶中的乳酸菌数分别为212、213。所以酸奶菌落总数为：样品的测定与出厂的间隔时间为3d：N=(N1+N2) X A/2=（295+297）X 107/2=296 X 107cfu/mL样品的测定与出厂的间隔时间为6d：N=(N1+N2) X A/2=（273+271）X 107/2=

11、272 X 107 cfu/mL样品的测定与出厂的间隔时间为9d：N=(N1+N2)X A/2=（212+213）X 107/2= 213 X 107cfu/mL实验分析：酸奶中所含的乳酸菌数，随着出厂天数的延长会出现明显下降的趋势。结果分析：到结果分析：到10h10h时，三时，三个平板的酸奶中的乳酸个平板的酸奶中的乳酸菌的菌的ODOD值均不再明显变值均不再明显变化，说明乳酸菌生长到化，说明乳酸菌生长到了对数生长期。了对数生长期。 生长曲线的绘制酸奶中乳酸菌的OD值根据酸奶中乳酸菌的OD值，分别绘出三个平板中的酸奶中的乳酸菌的生长曲线结果分析：由上图乳酸菌的生长曲线可得，乳酸菌的生长指数期在4

12、-8h。产酸能力的测定由上述实验结果得出，应该选取生长5h的乳酸菌接种入新鲜的牛奶中，每隔2h测定牛奶的pH值，根据每次测定的pH值来绘制酸度曲线。结果分析：随着培养时间加长，产酸能力逐渐下降，活力下降。经过MRS琼脂培养基分离的菌株, 有较大的菌落、透明、呈灰白的颜色、两面是凸起来的。细胞成细杆状, 即为乳杆菌；细胞成球形或卵圆形, 即为球菌。嗜热链球菌的试验分析：葡萄糖和蔗糖糖发酵试管中的培养基由原来的紫色变化为黄色, 麦芽糖发酵培养基没有改变颜色；保加利亚乳杆菌的试验分析：乳糖发酵试管中的培养基由原来的紫色变成了黄色, 葡萄糖，蔗糖，麦芽糖，七叶苷都没有改变颜色 。酸奶中所含的乳酸菌数，伴随着出厂日期的延长呈明显下降的趋势；实验表明，由绘制的生长曲线得出，乳酸菌的生长指数期在4-8h；活力的测定是指该菌种产酸能力，随着培养时间加长，产酸能力逐渐下降，活力下降。4.