新课标培训- 微生物的培养和应用

1、 普通高中课程标准实验 生物技术实践陈陈 珊珊 东北师范大学生命科学学院东北师范大学生命科学学院 E-mail: Tel:题专题2 2 微生物的培养和应用微生物的培养和应用课题课题1 1 微生物的实验室培养微生物的实验室培养课题课题2 2 土壤中分解尿素的细菌的土壤中分解尿素的细菌的 分离与计数分离与计数课题课题3 3 分解纤维素的微生物的分离分解纤维素的微生物的分离课题课题1 1 微生物的实验室培养微生物的实验室培养 实验实验1-1 1-1 实验室常用的消毒和灭菌方法实验室常用的消毒和灭菌方法 实验实验1-2 1-2 制备牛肉膏蛋白胨固体培养基制备牛肉膏蛋白胨固

2、体培养基 实验实验1-3 1-3 纯化大肠杆菌纯化大肠杆菌 实验实验1-11-1实验室常用的消毒和灭菌方法实验室常用的消毒和灭菌方法v 高压蒸汽灭菌高压蒸汽灭菌v 干热灭菌干热灭菌v 灼烧灭菌灼烧灭菌 高压蒸汽灭菌高压蒸汽灭菌一、目的要求一、目的要求1.1.了解高压蒸汽灭菌的基本了解高压蒸汽灭菌的基本原理及应用范围。原理及应用范围。2.2.学习高压蒸汽灭菌的操作学习高压蒸汽灭菌的操作方法。方法。二、基本原理二、基本原理 高压蒸汽灭菌是将待灭菌的物品放在一个密闭的加压高压蒸汽灭菌是将待灭菌的物品放在一个密闭的加压灭菌锅内，通过加热，使水蒸气急剧地将锅内的冷空灭菌锅内，通过加热，使水蒸气急剧地将锅

3、内的冷空气从排汽阀中驱尽，然后关闭排气阀，继续加热，此气从排汽阀中驱尽，然后关闭排气阀，继续加热，此时由于蒸汽不能溢出，而增加了灭菌锅内的压力，从时由于蒸汽不能溢出，而增加了灭菌锅内的压力，从而使沸点升高，得到高于而使沸点升高，得到高于100的温度。导致菌体蛋白的温度。导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。质凝固变性而达到灭菌的目的。 在使用高压蒸汽灭菌锅灭菌时，灭菌锅内冷空气的排在使用高压蒸汽灭菌锅灭菌时，灭菌锅内冷空气的排除是否完全极为重要，因为空气的膨胀压大于水蒸气除是否完全极为重要，因为空气的膨胀压大于水蒸气的膨胀压的膨胀压 ，所以，当水蒸气中含有空气时，在同一，所以，当水蒸气中含有

4、空气时，在同一压力下，含空气蒸汽的温度低于饱和蒸汽的温度。压力下，含空气蒸汽的温度低于饱和蒸汽的温度。 一般培养基用一般培养基用0.1MPa，121.5，1530min可达到彻可达到彻底灭菌的目的。灭菌的温度及维持的时间随灭菌物体底灭菌的目的。灭菌的温度及维持的时间随灭菌物体的性质和容量等具体情况有所改变。的性质和容量等具体情况有所改变。 灭菌锅内留有不同分量空气时，压力与温度的关系灭菌锅内留有不同分量空气时，压力与温度的关系压压 力力 数数全部空全部空气排出气排出时的温时的温度度 ()2/3空空气排出气排出时的温时的温度度()l/2空气空气排出时排出时的温度的温度 ()1/3空空气排出气排出

5、时的温时的温度度 ()空气全空气全不排出不排出时的温时的温度度 ()MPakg/cm2 1b/in20.030.070.100.140.170.210.350.701.051.401.752.10 51015202530108.8115.6121.3126.2130.0134.610010911512112613094105112118124128901001091151211267290100109115121三、操作步骤三、操作步骤1. 1. 将内层锅取出，再向外将内层锅取出，再向外 层锅内加入适量的水使层锅内加入适量的水使 水面与三角搁架相平为水面与三角搁架相平为 宜。宜。2.2.放回内

6、锅层，并装入待灭放回内锅层，并装入待灭菌物品。注意不要装得太菌物品。注意不要装得太挤，以免防碍蒸汽流通而挤，以免防碍蒸汽流通而影响灭菌效应，三角烧瓶影响灭菌效应，三角烧瓶与试管口端均不要与桶臂与试管口端均不要与桶臂接触，以免冷蒸汽淋湿包接触，以免冷蒸汽淋湿包口的纸而透入棉塞。口的纸而透入棉塞。 3. 3. 加盖，并将盖上的排器软管插入内锅层的排气槽内。加盖，并将盖上的排器软管插入内锅层的排气槽内。再以两两对称的方式同时旋紧相对的两个螺栓，使螺再以两两对称的方式同时旋紧相对的两个螺栓，使螺栓松紧一致。勿使漏气。栓松紧一致。勿使漏气。 4. 用煤气加热，待冷空气完全排尽后，关上排气阀。当锅用煤气加

7、热，待冷空气完全排尽后，关上排气阀。当锅内压力升到所需压力时，控制热源，维持压力至所需时内压力升到所需压力时，控制热源，维持压力至所需时间。本实验用间。本实验用0.1MPa，121.5，20min灭菌。灭菌。 5. 灭菌所需的时间到后，关闭煤气，让灭菌锅内温度自然灭菌所需的时间到后，关闭煤气，让灭菌锅内温度自然下降，当压力表降至下降，当压力表降至“0时，打开排气阀，旋松螺栓，时，打开排气阀，旋松螺栓，打开盖子，取出灭菌物品。打开盖子，取出灭菌物品。 6. 将取出的灭菌培养基放入将取出的灭菌培养基放入37温箱培养温箱培养24h，经检查若经检查若无杂菌生长，即可待用。无杂菌生长，即可待用。干热灭菌

8、干热灭菌 将灭菌物品放入干热灭菌箱内，将灭菌物品放入干热灭菌箱内，在在160170C加热加热12h可可达到灭菌的目的。能耐高温的、达到灭菌的目的。能耐高温的、需要保持干燥的物品，如玻璃需要保持干燥的物品，如玻璃器皿（吸管、培养皿）和金属器皿（吸管、培养皿）和金属用具等，可以采用这种方法灭用具等，可以采用这种方法灭菌。菌。灼烧灭菌灼烧灭菌 将微生物的接种工具，如接种将微生物的接种工具，如接种环、接种针或其他金属工具，环、接种针或其他金属工具，直接在酒精灯火焰的充分燃直接在酒精灯火焰的充分燃烧层灼烧，可以迅速彻底地烧层灼烧，可以迅速彻底地灭菌。此外，接种过程中，灭菌。此外，接种过程中，试管口或瓶口

9、等容易被污染试管口或瓶口等容易被污染的部位，也可以通过火焰灼的部位，也可以通过火焰灼烧来灭菌。烧来灭菌。接种环的灼烧灭菌（接种环的灼烧灭菌（1、2、3表示先后顺序）表示先后顺序） 除了以上方法外，实验室里还用紫外线或化除了以上方法外，实验室里还用紫外线或化学药物进行消毒。例如，接种室、接种箱或学药物进行消毒。例如，接种室、接种箱或超净工作台在使用前，可以用紫外线照射超净工作台在使用前，可以用紫外线照射30min，以杀死物体表面或空气中的微生物。以杀死物体表面或空气中的微生物。在照射前，适量喷洒石碳酸或煤酚皂溶液等在照射前，适量喷洒石碳酸或煤酚皂溶液等消毒液，可以加强消毒效果。消毒液，可以加强消

10、毒效果。 实验实验1-21-2制备牛肉膏蛋白胨固体培养基制备牛肉膏蛋白胨固体培养基 培养基是人工配制的适合微生物生长繁殖或积累代谢培养基是人工配制的适合微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质。产物的营养基质。 培养基的种类多培养基的种类多 培养基一般应含有水分、碳源、氮源、能源、无机盐、培养基一般应含有水分、碳源、氮源、能源、无机盐、生长因子等。生长因子等。 霉菌和酵母菌的培养基的霉菌和酵母菌的培养基的pH一般是偏酸性的，而细菌一般是偏酸性的，而细菌和放线菌的培养基的和放线菌的培养基的pH一般为中性或微碱性的。一般为中性或微碱性的。一、目的要求一、目的要求1明确培养基的配制原理。明确培养基的配

11、制原理。2通过对牛肉膏蛋白胨培养基的配制，掌握通过对牛肉膏蛋白胨培养基的配制，掌握 配制培养基的一般方法和步骤。配制培养基的一般方法和步骤。3掌握倒平板的基本操作技术。掌握倒平板的基本操作技术。 牛肉膏蛋白胨牛肉膏蛋白胨培养基中含有牛肉膏、蛋白胨和培养基中含有牛肉膏、蛋白胨和NaCl。其中牛肉膏为微生物提供碳源、能源、磷酸盐和维生其中牛肉膏为微生物提供碳源、能源、磷酸盐和维生素，蛋白胨主要提供氮源和维生素，而素，蛋白胨主要提供氮源和维生素，而NaCl提供无机提供无机盐。在配制固体培养基时还要加入一定量的琼脂作为盐。在配制固体培养基时还要加入一定量的琼脂作为凝固剂，琼脂在凝固剂，琼脂在96时溶化

12、，时溶化，40时凝固，通常不被时凝固，通常不被微生物分解利用。微生物分解利用。二、基本原理二、基本原理 牛肉膏牛肉膏 5.0g 蛋白胨蛋白胨 10.0 g NaCl 5.0 g 琼脂琼脂 20.0 g 水水 1000 ml pH 7.47.6牛肉膏蛋白胨培养基的配方牛肉膏蛋白胨培养基的配方 溶液或试剂溶液或试剂 牛肉膏，蛋白胨，牛肉膏，蛋白胨，NaCl，琼脂，琼脂，lmol/L NaOH lmol/L HCl。仪器或其他用具仪器或其他用具 试管，三角瓶，烧杯，量筒，试管，三角瓶，烧杯，量筒，玻棒，天平，牛角匙，高压蒸气灭菌锅，玻棒，天平，牛角匙，高压蒸气灭菌锅，pH试纸，棉花，牛皮纸，记号笔，

13、麻绳，纱布试纸，棉花，牛皮纸，记号笔，麻绳，纱布等。等。三、实验器材三、实验器材1计算计算 根据牛肉膏蛋白胨培养基配方的比例，计算配根据牛肉膏蛋白胨培养基配方的比例，计算配制制100mL的培养基时，各种成分的用量。的培养基时，各种成分的用量。2称量称量 按培养基配方比例依次准确地称取牛肉膏、蛋按培养基配方比例依次准确地称取牛肉膏、蛋白胨、白胨、NaCl。牛肉膏比较黏稠，常用玻棒挑取，放在牛肉膏比较黏稠，常用玻棒挑取，放在称量纸上称量，称量后直接放入水中，这时如稍微加称量纸上称量，称量后直接放入水中，这时如稍微加热，牛肉膏便会与称量纸分离，然后立即取出纸片。热，牛肉膏便会与称量纸分离，然后立即取

14、出纸片。牛肉膏和蛋白胨都容易吸潮，称取时动作要迅速，称牛肉膏和蛋白胨都容易吸潮，称取时动作要迅速，称后要及时盖上瓶盖。后要及时盖上瓶盖。四、操作步骤四、操作步骤 3溶化溶化 将称好的牛肉膏连同称量纸一同放入烧杯，加将称好的牛肉膏连同称量纸一同放入烧杯，加入少量的水，加热。当牛肉膏溶化并与称量纸分离后，入少量的水，加热。当牛肉膏溶化并与称量纸分离后，用玻棒取出称量纸。往烧杯中加入称量好的蛋白胨和用玻棒取出称量纸。往烧杯中加入称量好的蛋白胨和氯化钠，用玻棒搅拌，使其溶解。加入琼脂，加热使氯化钠，用玻棒搅拌，使其溶解。加入琼脂，加热使其熔化。在此过程中，不断用玻棒搅拌，防止琼脂糊其熔化。在此过程中，

15、不断用玻棒搅拌，防止琼脂糊底而导致烧杯破裂。当琼脂完全熔化后，补加自来水底而导致烧杯破裂。当琼脂完全熔化后，补加自来水至至100mL。 4调调pH 在未调在未调 pH前，先用精密前，先用精密 pH试纸测量培养试纸测量培养基的原始基的原始 pH，如果偏酸，用滴管向培养基中逐滴加入如果偏酸，用滴管向培养基中逐滴加入 lmolL NaOH，边加边搅拌，并随时用边加边搅拌，并随时用 pH试纸测其试纸测其pH，直至直至pH达达7.6。反之，用。反之，用 lmolL HCl进行调节。进行调节。 5加塞加塞 培养基分装完毕后，在试管口或三角烧瓶口培养基分装完毕后，在试管口或三角烧瓶口上塞上棉塞，以阻止外界微

16、生物进入培养基内而造成上塞上棉塞，以阻止外界微生物进入培养基内而造成污染，并保证有良好的通气性能。污染，并保证有良好的通气性能。 6包扎包扎 加塞后，外包牛皮纸，用麻绳以活结形式扎加塞后，外包牛皮纸，用麻绳以活结形式扎好，使用时容易解开。好，使用时容易解开。 7灭菌灭菌 将上述培养基和用纸包好的培养皿（将上述培养基和用纸包好的培养皿（58套套培养皿作一包）以培养皿作一包）以 0.103 MPa 121，20min高压蒸气高压蒸气灭菌。灭菌。 8倒平板倒平板 待培养基冷却至待培养基冷却至50左右时，在酒精灯火左右时，在酒精灯火焰附近倒平板。焰附近倒平板。倒平板操作示意图倒平板操作示意图倒平板操作

17、示意图倒平板操作示意图1. 培养基灭菌后，需要冷却到培养基灭菌后，需要冷却到50左右时，才能用来倒左右时，才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的温度？平板。你用什么办法来估计培养基的温度？2为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰?五、思考题五、思考题可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的温可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板了。度下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板了。通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。 3平板冷凝后，为什么要将平板倒置平板冷凝后，为什么要将平板

18、倒置?平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以使培养基面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。落入培养基，造成污染。空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生，空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生， 因此最好不要用这个平板培养微生物。因此最好不要用这个平板培养微生物。4.在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，

19、这个平板还能用来培养微生物吗？皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？为什么？ 实验实验1-31-3纯化大肠杆菌纯化大肠杆菌1明确分离纯化大肠杆菌的原理。明确分离纯化大肠杆菌的原理。2掌握分离纯化微生物的一般方法和步骤。掌握分离纯化微生物的一般方法和步骤。一、目的要求一、目的要求v平板划线法通过接种环在琼脂固体培养基表面连续平板划线法通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。在数次划线后培养，可以分离到由一个细的表面。在数次划线后培养，可以分离到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体，这就是

20、菌落胞繁殖而来的肉眼可见的子细胞群体，这就是菌落(colony)。v 稀释涂布平板法则是将菌液进行一系列的梯度稀释，稀释涂布平板法则是将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。在稀释度足够高的菌液里，基的表面，进行培养。在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的微生物将被分散成单个细胞，从而能聚集在一起的微生物将被分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成单个的菌落。在培养基表面形成单个的菌落。二、基本原理二、基本原理 溶液或试剂溶液或试剂 牛肉膏蛋白胨平板培养基牛肉膏蛋白胨平板培养基 大肠杆菌悬液大肠杆菌悬液

21、 仪器或其他用具仪器或其他用具 酒精灯酒精灯 烧杯烧杯 涂布器涂布器 试管试管 移液管移液管 接种针等接种针等 三、实验器材三、实验器材四、操作步骤四、操作步骤 1.系列稀释操作 将分别盛有将分别盛有9ml水的水的6支试管灭菌，并按支试管灭菌，并按101106的顺的顺 序编号。序编号。 用移液管吸取用移液管吸取ml培养的菌液，注入培养的菌液，注入101倍稀释的试管倍稀释的试管中。反复吹吸三次，使菌液与水充分混合均匀。中。反复吹吸三次，使菌液与水充分混合均匀。 从从101倍稀释的试管中吸取倍稀释的试管中吸取1ml稀释液，注入稀释液，注入102倍稀释倍稀释的试管中，重复第的试管中，重复第2步的混匀

22、操作。依次类推，直到步的混匀操作。依次类推，直到完成最后一支试管的稀释。完成最后一支试管的稀释。稀释操作示意图稀释操作示意图2 2、涂布平板操作、涂布平板操作 将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中。将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中。 取少量菌液（不超过取少量菌液（不超过0.1ml）滴加到培养基表滴加到培养基表面。面。 将沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃，待将沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃，待酒精燃尽后，冷却酒精燃尽后，冷却810s。 用涂布器将菌液均匀的涂布在培养基表面。用涂布器将菌液均匀的涂布在培养基表面。涂布时可转动培养皿，使涂布均匀。涂布时可转动培养皿，使涂布均匀。涂布平板操作示意图涂布平板操作示

23、意图涂布平板涂布平板菌落分离效果图菌落分离效果图3 3、平板划线操作、平板划线操作 将接种环放在火焰上灼烧，直到接种环烧红。将接种环放在火焰上灼烧，直到接种环烧红。 在火焰旁冷却接种环，并打开盛有菌液的试管的棉塞。在火焰旁冷却接种环，并打开盛有菌液的试管的棉塞。 将试管口通过火焰。将试管口通过火焰。 将已冷却的接种环伸入菌液中，沾取一环菌液。将已冷却的接种环伸入菌液中，沾取一环菌液。 将试管口通过火焰，并塞上棉塞。将试管口通过火焰，并塞上棉塞。 左手将皿盖打开一条缝隙，右手将沾有菌种的接种环左手将皿盖打开一条缝隙，右手将沾有菌种的接种环迅速伸入平板内，划三至五条平行线，盖上皿盖。注迅速伸入平板

24、内，划三至五条平行线，盖上皿盖。注意不要划破培养基。意不要划破培养基。 灼烧接种环，待其冷却后，从第一区域划线的末端开灼烧接种环，待其冷却后，从第一区域划线的末端开始往第二区域内划线。重复以上操作，在三、四、五始往第二区域内划线。重复以上操作，在三、四、五区域内划线。注意不要将最后一区的划线与第一区相区域内划线。注意不要将最后一区的划线与第一区相连。连。 将平板倒置，放入培养箱中培养。将平板倒置，放入培养箱中培养。平板划线操作示意图平板划线操作示意图平板划线操作示意图 平板划线菌落分离效果图平板划线菌落分离效果图五、结果分析与评价五、结果分析与评价 1.未接种的培养基表面是否有菌落生长未接种的

25、培养基表面是否有菌落生长?如果有菌落生如果有菌落生长，说明了什么长，说明了什么?如果未接种的培养基在恒温箱中保温如果未接种的培养基在恒温箱中保温12d后无菌落生后无菌落生长，说明培养基的制备是成功的，否则需要重新制长，说明培养基的制备是成功的，否则需要重新制备。备。如果培养基上生长的菌落的颜色、形状、大小基本一致，如果培养基上生长的菌落的颜色、形状、大小基本一致，并符合大肠杆菌菌落的特点，则说明接种操作是符合并符合大肠杆菌菌落的特点，则说明接种操作是符合要求的；如果培养基上出现了其他菌落，则说明接种要求的；如果培养基上出现了其他菌落，则说明接种过程中，无菌操作还未达到要求，需要分析原因，再过程

26、中，无菌操作还未达到要求，需要分析原因，再次练习。次练习。2. 在接种大肠杆菌的培养基上，你是否观察到了独立的在接种大肠杆菌的培养基上，你是否观察到了独立的菌落菌落?这些菌落的颜色、形状和大小相似吗这些菌落的颜色、形状和大小相似吗? 3. 培养培养12h和和24h后，观察到的实验结果相同吗后，观察到的实验结果相同吗?如果不同，请分析产生差异的原因。如果不同，请分析产生差异的原因。培养培养12 h与与24 h后的大肠杆菌菌落的大小会有明显后的大肠杆菌菌落的大小会有明显不同，及时观察记录的同学会发现这一点，并能不同，及时观察记录的同学会发现这一点，并能观察到其他一些细微的变化。这一步的要求主要观察

27、到其他一些细微的变化。这一步的要求主要是培养学生良好的科学态度与习惯。是培养学生良好的科学态度与习惯。1.1.无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还有什么目的？生物污染外，还有什么目的？六、思考题六、思考题无菌技术还能有效避免操作者自身被微生物感染。无菌技术还能有效避免操作者自身被微生物感染。2.请你判断以下材料或用具是否需要消毒或灭菌。如请你判断以下材料或用具是否需要消毒或灭菌。如果需要，请选择合适的方法。果需要，请选择合适的方法。（1） 培养细菌用的培养基与培养皿培养细菌用的培养基与培养皿（2） 玻棒、试管、烧瓶和吸管玻棒

28、、试管、烧瓶和吸管（3） 实验操作者的双手实验操作者的双手（1）、（）、（2）需要灭菌；（）需要灭菌；（3）需要消毒。）需要消毒。 3.为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？什么？ 操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物；每次划线前灼烧接种环是为在的微生物污染培养物；每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下了杀死上次划线结束后，接种环上残

29、留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落。划线结束后灼烧接的数目逐渐减少，以便得到菌落。划线结束后灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。染环境和感染操作者。4.在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？ 划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，划线后，线条末端细菌的数目比线条起

30、始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。细菌繁殖而来的菌落。以免接种环温度太高，杀死菌种。以免接种环温度太高，杀死菌种。5.在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？次划线的末端开始划线？ 课题课题2 2 土壤中分解尿素的细菌的土壤中分解尿素的细菌的分离与计数分离与计数 尿素是一种重要的农业氮肥。但是，尿素并不能直接尿素是一种重要的农业氮肥。但是，尿素并不

31、能直接被农作物吸收。只有当土壤中的细菌将尿素分解成氨被农作物吸收。只有当土壤中的细菌将尿素分解成氨之后，才能被植物利用。土壤中的细菌之所以能分解之后，才能被植物利用。土壤中的细菌之所以能分解尿素，是因为它们能合成脲酶。尿素，是因为它们能合成脲酶。 尿素尿素CO(NH2)2最初是从人的尿液中发现的。当时，最初是从人的尿液中发现的。当时，人们普遍相信有机物只能由有生命活力的生物产生，人们普遍相信有机物只能由有生命活力的生物产生，而无法通过化学方法合成。但是，而无法通过化学方法合成。但是，1828年，德国化学年，德国化学家维勒成功地通过无机物的化学反应合成了尿素，揭家维勒成功地通过无机物的化学反应合

32、成了尿素，揭开了历史上人工合成有机物的新篇章。此后，尿素的开了历史上人工合成有机物的新篇章。此后，尿素的生产走向了工业化，尿素也逐步成为农业生产中重要生产走向了工业化，尿素也逐步成为农业生产中重要的氮肥。的氮肥。一、目的要求一、目的要求1 1掌握从土壤种分离纯化微生物的基本操掌握从土壤种分离纯化微生物的基本操 作技术。作技术。2 2学习平板菌落计数的基本原理和方法。学习平板菌落计数的基本原理和方法。 自然界中各种微生物混杂在一起，即使取很少量的样品自然界中各种微生物混杂在一起，即使取很少量的样品也是微生物共存的群体。人们要研究某种微生物的特性，也是微生物共存的群体。人们要研究某种微生物的特性，

33、首先须把该种微生物从混杂的群体中分离出来。绝大多首先须把该种微生物从混杂的群体中分离出来。绝大多数微生物都能利用葡萄糖，但是，只有能合成脲酶的微数微生物都能利用葡萄糖，但是，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，因此可采用生物才能分解尿素，因此可采用以尿素为唯一氮源的选以尿素为唯一氮源的选择性培养基，将土壤中能分解尿素的细菌分离出来。择性培养基，将土壤中能分解尿素的细菌分离出来。二、基本原理二、基本原理 在细菌分解尿素的化学反应中，细菌合成的脲酶将尿在细菌分解尿素的化学反应中，细菌合成的脲酶将尿素分解成了氨。氨会使培养基的碱性增强，素分解成了氨。氨会使培养基的碱性增强，pH升高。升高。因此可以通

34、过检测培养基因此可以通过检测培养基pH的变化来判断该化学反应的变化来判断该化学反应是否发生。是否发生。 在以尿素为唯一氮源的尿素琼脂培养基中在以尿素为唯一氮源的尿素琼脂培养基中加入酚红指示剂，培养某种细菌后，如果加入酚红指示剂，培养某种细菌后，如果pH升高，指升高，指示剂将变红。这样即可准确地鉴定该种细菌能够分解示剂将变红。这样即可准确地鉴定该种细菌能够分解尿素。尿素。 是将待测样品经适当稀释之后，其中的微生物充分分是将待测样品经适当稀释之后，其中的微生物充分分散成单个细胞，取一定量的稀释液接种到平板上，经散成单个细胞，取一定量的稀释液接种到平板上，经过培养，由每个单细胞生长繁殖而形成肉眼可见

35、的菌过培养，由每个单细胞生长繁殖而形成肉眼可见的菌落，即一个单菌落应代表原样品中的一个单细胞。统落，即一个单菌落应代表原样品中的一个单细胞。统计菌落数，根据其稀释倍数和取样接种量即可换算出计菌落数，根据其稀释倍数和取样接种量即可换算出样品中的含菌数。样品中的含菌数。平板菌落计数法平板菌落计数法 但是，由于待测样品往往不易完全分散成单个细胞，但是，由于待测样品往往不易完全分散成单个细胞，所以，长成的一个单菌落也可能来自样品中的所以，长成的一个单菌落也可能来自样品中的23或更或更多个细胞。因此平板菌落计数的结果往往偏低。为了多个细胞。因此平板菌落计数的结果往往偏低。为了清楚地阐述平板菌落计数的结果

36、，现在已倾向使用菌清楚地阐述平板菌落计数的结果，现在已倾向使用菌落形成单位（落形成单位（colony-forming units，cfu）而不以绝对而不以绝对菌落数来表示样品的活菌含量。菌落数来表示样品的活菌含量。1菌种菌种 取自不同地域的土壤取自不同地域的土壤2. 培养基培养基 尿素琼脂培养基尿素琼脂培养基3溶液或试剂溶液或试剂 酚红，盛酚红，盛9 ml无菌水的试管，盛无菌水的试管，盛90 ml 无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶。无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶。4仪器或其他用具仪器或其他用具 无菌玻璃涂棒，无菌吸管，接种环，无菌玻璃涂棒，无菌吸管，接种环， 无菌培养皿等无菌培养皿等 三、实验器材三

37、、实验器材 尿素琼脂培养基尿素琼脂培养基 KH2PO4 1.4g Na2HPO4 2.1g MgSO47H2O 0.2g 葡萄糖葡萄糖 10.0g 尿素尿素 1.0g 琼脂琼脂 15.0g 水水 1 000ml四、操作步骤四、操作步骤 1 1稀释涂布平板法稀释涂布平板法 （1）倒平板）倒平板 将尿素琼脂培养基加热溶化，待冷至将尿素琼脂培养基加热溶化，待冷至5560时倒平板。时倒平板。 （2）制备土壤稀释液）制备土壤稀释液 称取土样称取土样 10 g，放入盛放入盛 90ml无无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶中，振摇约菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶中，振摇约20min，使土使土样与水充分混合，将细胞分散。

38、用一支样与水充分混合，将细胞分散。用一支1ml无菌吸管从无菌吸管从中吸取中吸取 lml土壤悬液加入盛有土壤悬液加入盛有9ml无菌水的大试管中充无菌水的大试管中充分混匀，然后用无菌吸管从此试管中吸取分混匀，然后用无菌吸管从此试管中吸取 lml加入另一加入另一盛有盛有9ml无菌水的试管中，混合均匀，以此类推制成无菌水的试管中，混合均匀，以此类推制成101、102、103、104、105、106倍稀释的倍稀释的土壤溶液。土壤溶液。 （3）涂布）涂布 将上述培养基的三个平板底面分别用记号将上述培养基的三个平板底面分别用记号笔写上笔写上104、105和和106倍稀释三种稀释度，然后用无菌倍稀释三种稀释度

39、，然后用无菌吸管分别由吸管分别由104、105和和106倍稀释的三管土壤稀释液中倍稀释的三管土壤稀释液中各吸取各吸取0.1ml对号放入已写好稀释度的平板中，用无对号放入已写好稀释度的平板中，用无菌玻璃涂棒在培养基表面轻轻地涂布均匀，室温下静菌玻璃涂棒在培养基表面轻轻地涂布均匀，室温下静置置510min，使菌液吸附进培养基。使菌液吸附进培养基。 （4）培养）培养 平板倒置于平板倒置于 35温箱中培养温箱中培养2448h。样品的稀释和稀释液的取样培养流程样品的稀释和稀释液的取样培养流程（5）计数）计数 培养培养48 h后，取出培养平板，算出同一稀释度三个平板后，取出培养平板，算出同一稀释度三个平板

40、上的菌落平均数，并按下列公式进行计算：上的菌落平均数，并按下列公式进行计算： C 某一稀释度下平板上生长的平均菌落数某一稀释度下平板上生长的平均菌落数 V 涂布平板时所用的稀释液的体积涂布平板时所用的稀释液的体积 (mL) M 稀释倍数。稀释倍数。 每克样品中的菌株数每克样品中的菌株数=( (CV) )M2 2尿酶的检测尿酶的检测 取两支含有酚红的尿素培养基斜面试管，取两支含有酚红的尿素培养基斜面试管，将分离出来的尿素分解细菌接种到斜面培将分离出来的尿素分解细菌接种到斜面培养基中，养基中，35温箱中培养温箱中培养2448h。观察培观察培养基颜色变化。尿素酶存在时为红色，无养基颜色变化。尿素酶存

41、在时为红色，无尿素酶时为黄色。尿素酶时为黄色。 五、结果分析与评价五、结果分析与评价1结合对照，分析培养物中是否有杂菌污染以及选择培结合对照，分析培养物中是否有杂菌污染以及选择培养基是否筛选出一些菌落。养基是否筛选出一些菌落。 对照的培养皿在培养过程中没有菌落生长，说明培养对照的培养皿在培养过程中没有菌落生长，说明培养基没有被杂菌污染。牛肉膏培养基的菌落数目明显大基没有被杂菌污染。牛肉膏培养基的菌落数目明显大于选择培养基的数目，说明选择培养基已筛选出一些于选择培养基的数目，说明选择培养基已筛选出一些菌落。菌落。2是否获得了某一稀释度下，菌落数目在是否获得了某一稀释度下，菌落数目在30300的平

42、的平板。在这一稀释度下，是否至少有两个平板的菌落数板。在这一稀释度下，是否至少有两个平板的菌落数相接近相接近? 如果得到了如果得到了2个或个或2个以上菌落数目在个以上菌落数目在30300的平板，的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数。则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数。3你统计的每克土壤中含有能分解尿素的细菌的菌落数你统计的每克土壤中含有能分解尿素的细菌的菌落数是多少是多少?与其他同学的结果接近吗与其他同学的结果接近吗? 如果差异很大，可如果差异很大，可能是什么原因引起的能是什么原因引起的? 如果学生选取的是同一种土样，统计的结果应该接近。如果学生选取的是同一种土样，统

43、计的结果应该接近。如果结果相差太远，引导学生一起分析产生差异的原如果结果相差太远，引导学生一起分析产生差异的原因。因。六、思考题六、思考题1.1.想一想，如何从平板上的菌落数推测出每克样品中的菌落想一想，如何从平板上的菌落数推测出每克样品中的菌落数？数？统计某一稀释度下平板上的菌落数，最好能统计统计某一稀释度下平板上的菌落数，最好能统计3 3个平个平板，计算出平板菌落数的平均值，然后按公式进行计板，计算出平板菌落数的平均值，然后按公式进行计算。算。2.为什么分离不同的微生物要采用不同的稀释度？测定土为什么分离不同的微生物要采用不同的稀释度？测定土壤中细菌的总量和测定土壤中能分解尿素的细菌的数壤

44、中细菌的总量和测定土壤中能分解尿素的细菌的数量，选用的稀释范围相同吗？量，选用的稀释范围相同吗？ 这是因为土壤中各类微生物的数量（单位：株这是因为土壤中各类微生物的数量（单位：株/kg）是不同的，例如在干旱土壤中的上层样本中：好氧是不同的，例如在干旱土壤中的上层样本中：好氧及兼性厌氧细菌数约为及兼性厌氧细菌数约为2 185万，放线菌数约为万，放线菌数约为477万，霉菌数约为万，霉菌数约为23.1万。因此，为获得不同类型的万。因此，为获得不同类型的微生物，就需要按不同的稀释度进行分离，同时还微生物，就需要按不同的稀释度进行分离，同时还应当有针对性地提供选择培养的条件。应当有针对性地提供选择培养的

45、条件。 课题课题3 3分解纤维素的微生物的分离 纤维素，一种由葡萄糖首尾相连而成的高分子化合纤维素，一种由葡萄糖首尾相连而成的高分子化合物，物， 是地球上含量最丰富的多糖类物质。是地球上含量最丰富的多糖类物质。植物的根、茎、叶等器官都含有大量的纤维素。地球植物的根、茎、叶等器官都含有大量的纤维素。地球上的植物每年产生的纤维素超过上的植物每年产生的纤维素超过70亿吨，其中亿吨，其中4060能被土壤中某些微生物分解利用。这是因为能被土壤中某些微生物分解利用。这是因为它们能够产生纤维素酶。它们能够产生纤维素酶。纤维素酶是一种复合酶，一般认为它至少包括三种组纤维素酶是一种复合酶，一般认为它至少包括三种

46、组分，即分，即C1酶、酶、Cx酶和葡萄糖苷酶，前两种酶使纤维酶和葡萄糖苷酶，前两种酶使纤维素分解成纤维二糖，第三种酶将纤维二糖分解成葡萄素分解成纤维二糖，第三种酶将纤维二糖分解成葡萄糖。正是在这三种酶的协同作用下，纤维素最终被水糖。正是在这三种酶的协同作用下，纤维素最终被水解成葡萄糖，为微生物的生长提供营养，解成葡萄糖，为微生物的生长提供营养，一、目的要求1. 掌握从土壤中分离纯化分解纤维素的微生物掌握从土壤中分离纯化分解纤维素的微生物的基本操作技术。的基本操作技术。2. 学习鉴别纤维素分解菌的基本原理和方法。学习鉴别纤维素分解菌的基本原理和方法。 采用采用以纤维素为唯一碳源以纤维素为唯一碳源

47、的选择性培养基，通过摇瓶的选择性培养基，通过摇瓶液体培养增加纤维素分解菌的浓度，再通过液体培养增加纤维素分解菌的浓度，再通过鉴别纤维鉴别纤维素分解菌的固体培养基素分解菌的固体培养基，采用，采用刚果红染色法刚果红染色法即可将土即可将土壤中能分解纤维素的微生物分离出来。壤中能分解纤维素的微生物分离出来。 刚果红刚果红(CongoRed，简称简称CR)是一种染料，它可以与像纤维素是一种染料，它可以与像纤维素这样的多糖物质形成红色复合物，但并不和水解后的这样的多糖物质形成红色复合物，但并不和水解后的纤维二糖和葡萄糖发生这种反应。当我们在含有纤维纤维二糖和葡萄糖发生这种反应。当我们在含有纤维素的培养基中

48、加入刚果红时，刚果红能与培养基中的素的培养基中加入刚果红时，刚果红能与培养基中的纤维素形成红色复合物。当纤维素被纤维素酶分解后，纤维素形成红色复合物。当纤维素被纤维素酶分解后，刚果红一纤维素的复合物就无法形成，培养基中会出刚果红一纤维素的复合物就无法形成，培养基中会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈。因此可根据培养现以纤维素分解菌为中心的透明圈。因此可根据培养基中是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。基中是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。 二、基本原理 1. 菌种菌种 取自纤维素丰富的取自纤维素丰富的腐殖土及枯枝败叶等。腐殖土及枯枝败叶等。 2. 培养基培养基 纤维素分解菌的选择培养基纤维素分解菌的

49、选择培养基 鉴别纤维素分解菌的培养基鉴别纤维素分解菌的培养基 3. 溶液或试剂溶液或试剂 刚果红染色液，纤维素粉等刚果红染色液，纤维素粉等 4. 仪器或其他用具仪器或其他用具 无菌玻璃涂棒，无菌吸管，接种环，无菌玻璃涂棒，无菌吸管，接种环，无菌培养皿等无菌培养皿等三、实验仪器纤维素分解菌的选择培养基纤维素分解菌的选择培养基纤维素粉纤维素粉 5gNaNO3 1 gNa2HPO47H20 1.2gKH2PO4 0.9gMgSO47H20 0.5 gKCl 0.5 g酵母膏酵母膏 0.5g水解酪素水解酪素 0.5g水水 1 000mL鉴别纤维素分解菌的培养基鉴别纤维素分解菌的培养基 CMC-Na 510g酵母膏酵母膏 1gKH2PO4 0.25 g琼脂琼脂 15g土豆汁土豆汁 100mL将上述物质溶解后，用蒸馏水将上述物质溶解后，用蒸馏水定容到定容到1 000mL。四、操作步骤1.制备纤维素分解菌的选择培养基和鉴别纤维素分解菌的制备纤维素分解菌的选择培养基和鉴别纤维素分解菌的培养基。培养基。2.将选择培养基分装到锥形瓶中。将选择培养基分装到锥形瓶中。 3.将选择培养基和鉴别培养基灭菌，鉴别培养基灭菌后倒将选择培养基和鉴别培养基灭菌，鉴别培养基灭菌后倒平板。平板。4.将土样加入装有将土样加入装有30