选修三 基因工程的基本操作程序

1、1.2 1.2 基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序阅读课本阅读课本P8-15P8-15，思考下列问题：，思考下列问题：3min3min1 1、基因工程基本操作的四个步骤？、基因工程基本操作的四个步骤？2 2、获取目的基因的常用方法有哪些、获取目的基因的常用方法有哪些? ?3 3、一个基因表达载体的组成有哪些物质？、一个基因表达载体的组成有哪些物质？ 分别有什么作用？分别有什么作用？4 4、将目的基因导入受体细胞时，受体细胞有哪些？、将目的基因导入受体细胞时，受体细胞有哪些？分别用什么方法导入细胞？分别用什么方法导入细胞？5 5、用什么方法检测转基因生物染色体的、用什么方法检测转基因生

2、物染色体的DNADNA上是否上是否插入了目的基因？插入了目的基因？什么方法检测目的基因是否转录出了什么方法检测目的基因是否转录出了mRNAmRNA？什么方法检测目的基因是否翻译成蛋白质？什么方法检测目的基因是否翻译成蛋白质？1 1、从基因文库中获取目的基因、从基因文库中获取目的基因（1 1）. .基因文库基因文库基因文库基因文库 基因组文库基因组文库部分基因文库部分基因文库（如（如:cDNA文库）文库）基因组文库的构建基因组文库的构建通过对受体菌通过对受体菌的培养而储存的培养而储存基因基因 cDNA文库的构建文库的构建-反转录法反转录法 目的基因的目的基因的mRNAmRNA单链单链DNADNA

3、反转录酶反转录酶DNADNA聚合酶聚合酶双链双链DNADNA( (目的基因目的基因) )怎样从基因文库怎样从基因文库中得到我们所需中得到我们所需的目的基因呢的目的基因呢? ?PCR技术扩增与技术扩增与DNA复制的比较复制的比较PCR技术技术DNA复制复制相相同同点点原理原理原料原料条件条件不不同同点点解旋解旋方式方式场所场所酶酶结果结果碱基互补配对碱基互补配对四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸模板、能量、酶模板、能量、酶DNA在高温下变性解旋在高温下变性解旋解旋酶催化解旋酶催化体外复制体外复制细胞核内细胞核内热稳定的热稳定的DNA聚合酶聚合酶细胞内的细胞内的DNA聚合酶聚合酶大量的大量的DNA片段片

4、段形成整个形成整个DNA分子分子 2 2、利用、利用PCRPCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因 概念概念：PCRPCR全称为全称为_，是一项，是一项 在生物在生物_复制复制_的核酸合成技术的核酸合成技术 条件：条件：_、 _、_ _ 、 _._.原理：原理：_方式：以方式：以_方式扩增，即方式扩增，即_（n n为扩增为扩增循循 环的次数）环的次数）结果：结果：聚合酶链式反应聚合酶链式反应体外体外特定特定DNADNA片段片段DNADNA复制复制（或（或碱基互补配碱基互补配对）对）目的基因目的基因DNADNA四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸 一对引物一对引物TaqTaq聚合酶聚合酶指数指数2 2n

5、n使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增过程：过程：a a、DNADNA变性变性（90-9590-95）：双链）：双链DNADNA模板模板 在热作用下，在热作用下，_断裂，形成断裂，形成_b b、退火、退火（复性复性55-6555-65）：系统温度降低，引）：系统温度降低，引 物与物与DNADNA模板结合，形成局部模板结合，形成局部_。 c c、延伸、延伸（70-7570-75）：在）：在TaqTaq酶的作用下，酶的作用下，合成与模板互补的合成与模板互补的_。 氢键氢键单链单链DNADNA双链双链DNADNA链链二、基因表达载体的构建二、基因表达载体的

6、构建基因工程的核心基因工程的核心1、目的：、目的：所需物质：所需物质：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。表达和发挥作用。三将目的基因导入受体细胞三将目的基因导入受体细胞（一）转化：（一）转化： 方法方法导入植物细胞导入植物细胞导入动物细胞导入动物细胞导入微生物细胞导入微生物细胞农杆菌转化法农杆菌转化法基因枪法基因枪法花粉管通道法花粉管通道法显微注射法显微注射法感受态细胞吸收感受态细胞吸收DNADNA分子分子目的基因进入目的基因进入_内，并且在内，并且在 受体受体细胞内维

7、持细胞内维持_和和_的过程的过程受体细胞受体细胞稳定稳定表达表达动物受精卵动物受精卵农杆菌转化法农杆菌转化法植物细胞植物细胞植物组织培养植物组织培养转基因植物转基因植物Ca2+处理处理微生物微生物发酵发酵目的基因的目的基因的表达产物表达产物显微注射显微注射胚胎移植胚胎移植转基因动物转基因动物原理：原理：TiTi质粒上的质粒上的T-DNAT-DNA可以转移到受体细可以转移到受体细胞，并整合到受体细胞染色体的胞，并整合到受体细胞染色体的DNADNA上。上。用用Ca2+处理细胞处理细胞 感受态感受态细胞细胞 表达载体与感表达载体与感受态细胞混合受态细胞混合 感受态感受态细胞吸收细胞吸收DNA分子分子

8、导入微生物细胞导入微生物细胞原核生物特点：繁殖快、单细胞、遗传物质少原核生物特点：繁殖快、单细胞、遗传物质少过程：过程： 四、目的基因的检测与鉴定四、目的基因的检测与鉴定检测：是否插入基因检测：是否插入基因 是否转录是否转录 是否翻译是否翻译-DAN-DAN分子杂交分子杂交-分子杂交分子杂交-抗原抗原- -抗体杂交抗体杂交归纳步骤归纳步骤个体生物学水平鉴定个体生物学水平鉴定归纳: 基因工程的基本操作程序1.1. 获取目的基因获取目的基因u 从基因文库从基因文库u 利用利用PCRPCRu 化学方法人工合成化学方法人工合成2.2. 构建基因表达载体构建基因表达载体u 目的基因、启动子、终止子、标记

9、基因、复制原目的基因、启动子、终止子、标记基因、复制原点点3.3. 将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞u 农杆菌转化法、显微注射法农杆菌转化法、显微注射法4.4. 目的基因的检测与鉴定目的基因的检测与鉴定DNA分子杂交、分子杂交、抗原分子杂交、分子杂交、抗原-抗体杂交抗体杂交 1970年，特明和巴尔的摩证实了年，特明和巴尔的摩证实了RNA病毒能病毒能依赖依赖RNA合成合成DNA的过程，并发现了催化此过程的过程，并发现了催化此过程的酶。下面为形成的酶。下面为形成cDNA的过程和的过程和PCR扩增过程示扩增过程示意图。请根据图解回答下列问题：意图。请根据图解回答下列问题：(1)催化催化过

10、程的酶是过程的酶是_；核酸酶；核酸酶H的作用是的作用是_。(2)过程也称为过程也称为DNA的变性，此过程在温度高达的变性，此过程在温度高达9095 时才能完成，说明时才能完成，说明DNA分子具有分子具有_性。性。逆转录酶逆转录酶分解分解RNA稳定稳定(3)由图中信息分析可知，催化由图中信息分析可知，催化过程的酶都是过程的酶都是_ _ _ _ _ _ _ _ ， 两 者 在 作 用 特 性 上 的 区 别 是， 两 者 在 作 用 特 性 上 的 区 别 是_。(4)如果如果RNA单链中有碱基单链中有碱基100个，其中个，其中A占占25%，U占占15%，则通过该过程合成的一个双链，则通过该过程合

11、成的一个双链DNA片片段中有胞嘧啶段中有胞嘧啶_个。个。DNA聚合酶聚合酶催化催化过程的酶耐高温过程的酶耐高温60 (2011年高考海南卷年高考海南卷)回答有关基因工程的问回答有关基因工程的问题：题：(1)构建基因工程表达载体时，用不同类型的限制构建基因工程表达载体时，用不同类型的限制酶切割酶切割DNA后，可能产生黏性末端，也可能产生后，可能产生黏性末端，也可能产生_末端。若要在限制酶切割目的基因和质末端。若要在限制酶切割目的基因和质粒后使其直接进行连接，则应选择能使二者产生粒后使其直接进行连接，则应选择能使二者产生_(相同、不同相同、不同)黏性末端的限制酶。黏性末端的限制酶。平平相同相同(2

12、)利用大肠杆菌生产人胰岛素时，构建的表达载体含利用大肠杆菌生产人胰岛素时，构建的表达载体含有人胰岛素基因及其启动子等，其中启动子的作用是有人胰岛素基因及其启动子等，其中启动子的作用是_。在表达载体转化大肠杆菌时，常用在表达载体转化大肠杆菌时，常用_处理大肠处理大肠杆菌，以利于表达载体进入；为了检测胰岛素基因是杆菌，以利于表达载体进入；为了检测胰岛素基因是否转录出了否转录出了mRNA，可用标记的胰岛素基因片段作探，可用标记的胰岛素基因片段作探针与针与mRNA杂交，该杂交技术称为杂交，该杂交技术称为_。为了检测胰岛素基因转录的为了检测胰岛素基因转录的mRNA是否翻译成是否翻译成_，常用抗原，常用抗

13、原抗体杂交技术。抗体杂交技术。RNA聚合酶识别和结合的位点，有了它才能驱动聚合酶识别和结合的位点，有了它才能驱动基因转录出基因转录出mRNA，最终获得所需要的蛋白质，最终获得所需要的蛋白质Ca2分子杂交技术分子杂交技术人胰岛素人胰岛素(3)如果要将某目的基因通过农杆菌转化法导入植物如果要将某目的基因通过农杆菌转化法导入植物细胞，先要将目的基因插入农杆菌细胞，先要将目的基因插入农杆菌Ti质粒的质粒的_中中,然后用该农杆菌感染植物细胞然后用该农杆菌感染植物细胞,通过通过DNA重组将目的基因插入植物重组将目的基因插入植物细胞的细胞的_ _上。上。TDNA染色体的染色体的DNA1下图为下图为DNA分子

14、的某一片段，其中分子的某一片段，其中分别表示分别表示某种酶的作用部位，则相应的酶依次是某种酶的作用部位，则相应的酶依次是()ADNA连接酶、限制性内切酶、解旋酶连接酶、限制性内切酶、解旋酶B限制性内切酶、解旋酶、限制性内切酶、解旋酶、DNA连接酶连接酶C解旋酶、限制性内切酶、解旋酶、限制性内切酶、DNA连接酶连接酶D限制性内切酶、限制性内切酶、DNA连接酶、解旋酶连接酶、解旋酶解析：解析：能使能使DNA分子中氢键断裂的是解旋酶；限制性核酸内切酶能分子中氢键断裂的是解旋酶；限制性核酸内切酶能把相邻两个脱氧核苷酸的磷酸二酯键断裂；把相邻两个脱氧核苷酸的磷酸二酯键断裂；DNA连接酶能把两个连接酶能把

15、两个DNA片段连接起来，作用于两条脱氧核苷酸链上，形成磷酸二酯键。片段连接起来，作用于两条脱氧核苷酸链上，形成磷酸二酯键。答案：答案：C变式迁移变式迁移1(多选)下图表示限制酶切割某DNA的过程，从图中可知，该限制酶能识别的碱基序列及切点是( )ACTTAAG BGAATTC C切点在G和A之间 D切点在C和T之间解析：由图不难看出该限制酶识别的碱基序列是GAATTC，切点是G与A之间。答案：BC自主检测自主检测1.下列有关下列有关DNA连接酶的叙述正确的是连接酶的叙述正确的是( )催化具有相同的黏性末端的催化具有相同的黏性末端的DNA片段之间连接片段之间连接催化具有不同的黏性末端的催化具有不

16、同的黏性末端的DNA片段之间连接片段之间连接催化两个黏性末端互补碱基间氢键的形成催化两个黏性末端互补碱基间氢键的形成催化脱氧核糖与磷酸之间的磷酸二酯键的形成催化脱氧核糖与磷酸之间的磷酸二酯键的形成A. B.C. D.C2.关于磷酸二酯键说法正确的是关于磷酸二酯键说法正确的是( )A只有目的基因中存在只有目的基因中存在B. 只有质粒中存在只有质粒中存在CDNA单链或双链分子中都存在单链或双链分子中都存在D只存在于双链只存在于双链DNA分子中分子中C3如下图所示，两个核酸片段在适宜条件下，经X酶的催化作用，发生下述变化，则X酶是()ADNA连接酶BRNA聚合酶CDNA聚合酶 D限制酶A4下列不属于

17、基因工程载体的是( )A质粒 B细菌的拟核DNAC噬菌体 D动植物病毒B5下列有关基因工程的说法正确的是( )A限制酶只能从原核生物中分离纯化而来B限制酶识别并切割特定双链DNA后可产生黏性末端或平末端CT4DNA连接酶来自T4噬菌体，只可将双链DNA片段互补的黏性末端之间连接起来D天然质粒均可用于基因工程作为载体，且均不用经人工改造B跟踪训练跟踪训练(2011年江苏无锡高二检测年江苏无锡高二检测)如图为基因表达如图为基因表达载体的模式图，下列有关基因工程中载体的说法错误载体的模式图，下列有关基因工程中载体的说法错误的是的是()A基因工程的核心步骤是基因表达载体构建基因工程的核心步骤是基因表达

18、载体构建B任何基因表达载体的构建都是一样的，没有差别任何基因表达载体的构建都是一样的，没有差别C图中启动子位于基因的首端，是图中启动子位于基因的首端，是RNA聚合酶识别聚合酶识别和结合的部位和结合的部位D抗生素抗性基因的作用是作为标记基因，用于鉴别抗生素抗性基因的作用是作为标记基因，用于鉴别受体细胞中是否导入了目的基因受体细胞中是否导入了目的基因答案：答案：B练习练习1：为扩大可耕地面积，增加粮食产量，：为扩大可耕地面积，增加粮食产量，黄河三角洲等盐碱地的开发利用备受关注。我黄河三角洲等盐碱地的开发利用备受关注。我国科学家应用耐盐基因培育出了耐盐水稻新品国科学家应用耐盐基因培育出了耐盐水稻新品

19、系。系。（1）获得耐盐基因后，构建重组）获得耐盐基因后，构建重组DNA分子所分子所用的限制性内切酶作用于图中的用的限制性内切酶作用于图中的 处，处，DNA连接酶作用于连接酶作用于 处。（填处。（填“a”或或“b”） a a练习练习1：(2008理综山东卷理综山东卷)为扩大可耕地面积，增加粮食为扩大可耕地面积，增加粮食产量，黄河三角洲等盐碱地的开发利用备受关注。我国科产量，黄河三角洲等盐碱地的开发利用备受关注。我国科学家应用耐盐基因培育出了耐盐水稻新品系。学家应用耐盐基因培育出了耐盐水稻新品系。（2）将重组）将重组DNA分子导入水稻受体细胞的常用方法有农分子导入水稻受体细胞的常用方法有农杆菌转化

20、法和杆菌转化法和 法。法。（3）由导入目的基因的水稻细胞培养成植株需要利）由导入目的基因的水稻细胞培养成植株需要利用用 技术，该技术的核心是技术，该技术的核心是 和和 。（4）为了确定耐盐转基因水稻是否培育成功，既要用放）为了确定耐盐转基因水稻是否培育成功，既要用放射性同位素标记的射性同位素标记的 作探针进行分作探针进行分子杂交检测，又要用子杂交检测，又要用 方法从个体方法从个体水平鉴定水稻植株的耐盐性。水平鉴定水稻植株的耐盐性。基因枪法（花粉管通道法）基因枪法（花粉管通道法）植物组织培养植物组织培养脱分化脱分化 再分化再分化耐盐基因（目的基因）耐盐基因（目的基因）一定浓度盐水浇灌一定浓度盐水浇灌1）以下说法正确的是）以下说法正确的是 （ ） A、所有的限制酶只能识别一种特定的核苷、所有的限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列酸序列 B、质粒是基因工程中唯一的运载体、质粒是基因工程中唯一的运载体 C、运载体必须具备的条件之一是：具有多、运载体必须具备的条件之一是：具有多个限制酶切点，以便与外源基因连接个