实验2-生物大分子的制备

1、 生物大分子物质的制备生物大分子物质的制备一一一般过程和原则一般过程和原则二二注意事项注意事项三纯化方案的设计和评价三纯化方案的设计和评价例：例：宇佐美曲霉宇佐美曲霉537酸性蛋白酶的纯化酸性蛋白酶的纯化确立有效成分的测定方法确立有效成分的测定方法材料的选择和预处理材料的选择和预处理细胞的破碎和细胞组分分离细胞的破碎和细胞组分分离有效成分的抽提有效成分的抽提有效成分的纯化和浓缩有效成分的纯化和浓缩l透析和超滤透析和超滤层析法层析法 电泳法电泳法 超离心法超离心法 盐析（盐析（硫酸铵盐析硫酸铵盐析）等点电沉淀等点电沉淀有机溶剂沉淀有机溶剂沉淀离心离心前处理前处理 粗分级粗分级 细分级细分级 材料

2、选择与处理材料选择与处理细胞破碎细胞破碎生物组织生物组织 提取液提取液 粗产品粗产品结晶结晶分子大小分子大小溶解度溶解度电荷性质电荷性质吸附性质吸附性质生物亲和力生物亲和力依据原理依据原理注意事项注意事项基本原则：防止生物分子变性、降解基本原则：防止生物分子变性、降解 1控制适当的控制适当的pH 2控制低温控制低温 3注意提取过程中的溶液环境注意提取过程中的溶液环境 4防止提纯过程中丟失一些辅助因子或亚基防止提纯过程中丟失一些辅助因子或亚基宇佐美曲霉宇佐美曲霉537酸性蛋白酶的纯化酸性蛋白酶的纯化 纯化步骤纯化步骤 总蛋白总蛋白 总活力总活力 比活力比活力 纯化倍数纯化倍数 回收率回收率 （m

3、g） （U） （U/mg蛋白）蛋白） （%）1、粗酶液、粗酶液 80 4320 54 1 1002、乙醇沉淀、乙醇沉淀 29 3585 123 2.27 833、醋酸钙沉淀、醋酸钙沉淀 21 2980 141 2.64 694、盐析、盐析 4 1771 464 8.52 415、丙酮沉淀、丙酮沉淀 1 1166 1104 20.29 276、结晶、结晶 0.12 130 1072 19.70 3一、一、层析技术层析技术二二 、透析透析和和超过滤超过滤1层析技术一般原理层析技术一般原理2层析技术分类层析技术分类3常用层析技术及应用常用层析技术及应用 层析技术是一种物理的分离方法。无论何种层析层析

4、技术是一种物理的分离方法。无论何种层析, ,都是由互不都是由互不相溶的两个相组成相溶的两个相组成: :一是固定相一是固定相( (固体或吸附在固体上的液体），固体或吸附在固体上的液体），一是流动相（液体或气体）。一是流动相（液体或气体）。 混合物在层析系统中的分离决定于该混合物的组分在两相中的混合物在层析系统中的分离决定于该混合物的组分在两相中的分配情况，一般用分配系数分配情况，一般用分配系数(distribution coefficient,K(distribution coefficient,Kd d）来）来描述。描述。 物质在层析系统中的行为并不直接决定于其物质在层析系统中的行为并不直接决

5、定于其K Kd d，而取决于它的，而取决于它的有效分配系数有效分配系数K Keffeff : :K Keffeff = =某一物质在某一物质在A A相中的总量相中的总量某一物质在某一物质在B B相中的总量相中的总量 纸层析纸层析 薄膜层析薄膜层析 柱层析柱层析洗脱液洗脱液样品样品填充物填充物分部收集分部收集玻璃柱玻璃柱各类层析的原理和载体各类层析的原理和载体类别类别 分离原理分离原理 基质或载体基质或载体吸附层析吸附层析 化学、物理吸附化学、物理吸附 硅胶、氧化铝硅胶、氧化铝 、羟基磷酸、羟基磷酸分配层析分配层析 两溶剂相中的溶解效应两溶剂相中的溶解效应 纤维素、硅藻土纤维素、硅藻土 、硅胶、

6、硅胶凝胶层析凝胶层析 分子筛效应的排阻效应分子筛效应的排阻效应 sepharose 、sephadex离子交换层析离子交换层析 离子基团的交换反应离子基团的交换反应 离子交换树脂离子交换树脂 、纤维素、纤维素、 葡聚糖葡聚糖亲和层析亲和层析 分离物与配体之间有分离物与配体之间有 带配基的带配基的sepharose 特殊亲和力特殊亲和力 或或sephadex聚焦层析聚焦层析 等电点和离子交换作用等电点和离子交换作用 多缓冲交换剂（与带有多种电多缓冲交换剂（与带有多种电 荷基团的配体相偶联的荷基团的配体相偶联的 sepharose 6B）吸附层析吸附层析分配层析分配层析凝胶过滤凝胶过滤（分子筛层析

7、（分子筛层析）离子交换层析离子交换层析亲和层析亲和层析 聚焦层析聚焦层析原理：原理：载体载体 ： 硅胶硅胶 氧化铝氧化铝 羟基磷石灰羟基磷石灰应用：分离纯化蛋白质、酶、氨基酸、核苷酸应用：分离纯化蛋白质、酶、氨基酸、核苷酸 等生化物质等生化物质以吸附剂作为固定相，选择适当的溶剂作流动相。以吸附剂作为固定相，选择适当的溶剂作流动相。由于各种物质的极性不同，被吸附剂吸附的程度和由于各种物质的极性不同，被吸附剂吸附的程度和在流动相中的溶解度不同。层析时，当流动相从固在流动相中的溶解度不同。层析时，当流动相从固定相上流过时，各组分也就不同程度地被溶解（解定相上流过时，各组分也就不同程度地被溶解（解吸）

8、，然后又再被吸附、再溶解再吸附，从而以不吸），然后又再被吸附、再溶解再吸附，从而以不同速度随流动相向前移动。同速度随流动相向前移动。原理：原理：载体载体 ：纤维素纤维素 硅藻土硅藻土 硅胶硅胶应用：应用：各种生化物质的分离鉴定各种生化物质的分离鉴定 分配层析实际上是一种连续抽提方式。如纸层析中分配层析实际上是一种连续抽提方式。如纸层析中滤纸的结合水为固定相，以水饱和的有机溶剂为流滤纸的结合水为固定相，以水饱和的有机溶剂为流动相（展开剂）。当流动相沿滤纸经过样品点时，动相（展开剂）。当流动相沿滤纸经过样品点时，样品点中的溶质在水和有机相中溶解度不同而不均样品点中的溶质在水和有机相中溶解度不同而不

9、均匀地分配在两相中，各种组分按其各自的匀地分配在两相中，各种组分按其各自的分配系数分配系数进行不断分配，从而使物质得到分离和纯化。进行不断分配，从而使物质得到分离和纯化。物质物质Y(Kd=1)的分配情况的分配情况溶剂溶剂 A物质物质Z(Kd=3)的分配情况的分配情况溶剂溶剂 B总量总量总量总量总量总量总量总量总量总量总量总量平衡后平衡后转移转移 1转移转移 2转移转移 3分溶管号分溶管号转移转移 4上相转移上相转移下相转移下相转移上相转移上相转移管管中中蛋蛋白白质质总总量量物质物质Y物质物质Z分溶曲线分溶曲线管号管号有效分配系数（有效分配系数（Keff） 某一物质在某一物质在A相中的总量相中的

10、总量某一物质在某一物质在B相中的总量相中的总量基质基质 葡聚糖凝胶（葡聚糖凝胶（sephadex） 琼脂糖凝胶（琼脂糖凝胶（sepharose）应用应用 测定分子量测定分子量 脱盐和浓缩脱盐和浓缩 分离提纯生物大分子分离提纯生物大分子 除去热原物质除去热原物质 原理原理：凝胶颗粒凝胶颗粒收收集集蛋蛋白白质质管管蛋白质混合物蛋白质混合物大分子大分子从柱上面加缓冲溶液从柱上面加缓冲溶液小分子小分子洗脱体积（洗脱体积（Ve）凝胶柱凝胶柱大分子大分子小分子小分子Ve1Ve2V0原理原理基质基质 疏水型离子交换剂；亲水型离子交换剂疏水型离子交换剂；亲水型离子交换剂应用应用 制备纯化生物物质制备纯化生物物

11、质 定量、定性测定混合物中各组分定量、定性测定混合物中各组分12345原始缓冲溶原始缓冲溶液的反离子液的反离子样品溶液样品溶液梯度浓度梯度浓度蛋蛋白白质质浓浓度度洗脱体积洗脱体积带正电荷带正电荷的蛋白质的蛋白质带负电荷的蛋白质带负电荷的蛋白质收集样品的管收集样品的管收集样品的管收集样品的管带负电荷带负电荷的蛋白质的蛋白质蛋白质混合物蛋白质混合物玻璃柱玻璃柱带正电荷带正电荷的蛋白质的蛋白质带负电荷带负电荷的蛋白质的蛋白质带正电荷带正电荷的蛋白质的蛋白质收集样品的管收集样品的管NaClNaCl梯度梯度离子交换剂离子交换剂 可电离基团可电离基团 可电离基团结构可电离基团结构CM-纤维素（弱酸型）纤维

12、素（弱酸型） 羧甲基羧甲基P-纤维素（中强弱酸型）纤维素（中强弱酸型） 磷酸基磷酸基SE-纤维素（强弱酸型）纤维素（强弱酸型） 磺乙基磺乙基SP-纤维素（强弱酸型）纤维素（强弱酸型） 磺丙基磺丙基AE-纤维素（弱减型）纤维素（弱减型） 氨基乙基氨基乙基离子交换剂离子交换剂 可电离基团可电离基团 可电离基团结构可电离基团结构PAB-纤维素（弱减型）纤维素（弱减型） 对氨基苯甲酸对氨基苯甲酸DEAE-纤维素纤维素 二乙基氨基乙基二乙基氨基乙基DEAE -Sephadex 二乙基氨基乙基二乙基氨基乙基DEAE -纤维素（强减型）纤维素（强减型） 二乙基氨基乙基二乙基氨基乙基QAE-纤维素（强减型）纤

13、维素（强减型）二乙基（二乙基（2-羟丙羟丙基）基） -氨基乙基氨基乙基（中弱减型）（中弱减型）（中弱减型）（中弱减型）应用应用 分离纯化酶、分离纯化酶、 抗原、抗体抗原、抗体 分离纯化核酸分离纯化核酸 研究酶的结构与功能研究酶的结构与功能+待纯化分子待纯化分子配体配体a. 理论依据理论依据：待纯化分子和配体间具有亲和性：待纯化分子和配体间具有亲和性+基质基质b. 活性基质与配体结合产生亲和吸附剂活性基质与配体结合产生亲和吸附剂+杂质杂质c. 待纯化分子与亲和吸附剂结合，与杂质分离待纯化分子与亲和吸附剂结合，与杂质分离+d. 偶联复合物经解离后，得到纯的待纯化分子偶联复合物经解离后，得到纯的待纯

14、化分子原理原理：基质基质 纤维素、聚丙烯酰胺凝胶、纤维素、聚丙烯酰胺凝胶、 sepharose、sephadex 该法是在等电点聚焦方法基础上发展起来的，其分离纯化蛋白质的依据该法是在等电点聚焦方法基础上发展起来的，其分离纯化蛋白质的依据是等电点的差异和离子交换行为。蛋白质按其等电点在是等电点的差异和离子交换行为。蛋白质按其等电点在pH梯度环境中进行排梯度环境中进行排列的过程叫做聚焦效应。列的过程叫做聚焦效应。 pH梯度的形成梯度的形成(由多缓冲剂和多缓冲交换剂形成由多缓冲剂和多缓冲交换剂形成)是是聚焦效应的先决条件，如果一种蛋白质加到已形成聚焦效应的先决条件，如果一种蛋白质加到已形成pH梯度

15、的层析柱上时梯度的层析柱上时,由于由于洗脱液的连续流动，蛋白质将迅速地洗脱液的连续流动，蛋白质将迅速地 迁移到与它等电点相同的迁移到与它等电点相同的pH处。从此位处。从此位置开始，该蛋白质将以缓慢的速度进行吸附、解吸附，直到在等电点置开始，该蛋白质将以缓慢的速度进行吸附、解吸附，直到在等电点pH时被时被洗出。在聚焦层析过程中洗出。在聚焦层析过程中,一种样品分次加入时，只要先加入者尚未洗出一种样品分次加入时，只要先加入者尚未洗出,并且并且有一定的时间进行聚焦有一定的时间进行聚焦,剩余样品还可以加到柱上剩余样品还可以加到柱上,其聚焦过程都能顺利完成。其聚焦过程都能顺利完成。pH梯度溶液的形成示意图

16、梯度溶液的形成示意图蛋白质蛋白质1（pI=7）蛋白质蛋白质2（pI=8）流速流速移动速率移动速率层析时的聚焦效应示意图层析时的聚焦效应示意图半透膜袋半透膜袋蛋白质溶液蛋白质溶液透析液透析液磁棒磁棒 磁力搅拌器磁力搅拌器 透析是利用蛋白质等大分子不透析是利用蛋白质等大分子不能通过半透膜的性质，使蛋白质能通过半透膜的性质，使蛋白质和其它小分子物质如无机盐单糖和其它小分子物质如无机盐单糖等分开。常用的半透膜：等分开。常用的半透膜： 玻璃纸（赛璐玢纸，玻璃纸（赛璐玢纸，cellophane paper） 火绵纸（赛璐玎纸火绵纸（赛璐玎纸, celloidin paper） 其他改型纤维素材料其他改型纤维素材料 利用压力、抽滤（利用压力、抽滤（A）或离）或离心力（心力（B）等多种形式，强行使）等多种形式，强行使水和其它小分子溶质通过半透水和其它小分子溶质通过半透膜，而蛋白质被截留在膜上，膜，而蛋白质被截留在膜上，以达到浓缩和脱盐目的。滤膜以达到浓缩和脱盐目的。滤膜有多种规格，