大肠菌群的检验

1、实验八实验八大肠菌群的检验大肠菌群的检验实验目的实验目的掌握鉴别大肠菌群的方法。掌握鉴别大肠菌群的方法。掌握以最大概率数法测定大肠菌群数掌握以最大概率数法测定大肠菌群数量的方法。量的方法。实验原理实验原理 大肠菌群指一群能大肠菌群指一群能发酵乳糖发酵乳糖、产酸产气产酸产气、需氧和兼性厌氧需氧和兼性厌氧的的革兰氏阴性无芽孢杆菌革兰氏阴性无芽孢杆菌。该菌主要来源于人畜粪便，以此作为粪便污该菌主要来源于人畜粪便，以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量，推断食品有染指标来评价食品的卫生质量，推断食品有否被肠道致病菌污染。否被肠道致病菌污染。 食品中大肠菌群以食品中大肠菌群以100ml 检样内大肠菌检

2、样内大肠菌群最可能数（群最可能数（MPN）表示。表示。实验设备实验设备v恒温培养箱恒温培养箱：（：（361）v显微镜显微镜v培养皿培养皿 v试管、移液管、三角烧瓶、小倒管试管、移液管、三角烧瓶、小倒管v天平天平v载玻片载玻片实验试剂实验试剂乳糖胆盐发酵管：乳糖胆盐发酵管： 20g蛋白胨、蛋白胨、5g 猪胆盐及猪胆盐及10g乳糖乳糖溶于溶于1L水中，水中，校正校正pH为为7 .4，加，加25ml溴溴甲酚紫指示液甲酚紫指示液(0.4 g/L)，分装每管分装每管20 ml, , 并放入一个并放入一个小倒管小倒管，115高压灭高压灭菌菌20 min。伊红美蓝琼脂平板：伊红美蓝琼脂平板： 10g蛋白胨、

3、蛋白胨、2gK2HPO4及及17g琼脂溶解于琼脂溶解于1L水水中，校正中，校正pH至至7.1，分装于锥形瓶内，分装于锥形瓶内，121高压灭高压灭菌菌15min。临用时加人。临用时加人10g乳糖乳糖并加热溶化琼脂，冷并加热溶化琼脂，冷至至5055。加人。加人20mL伊红伊红溶液（溶液（20g/L)和和10ML美蓝美蓝溶液（溶液（6.5g/L）摇匀，倾注平板。摇匀，倾注平板。乳糖发酵管：乳糖发酵管： 将将20 g蛋白胨和蛋白胨和10g乳糖乳糖溶于溶于1L水中，校水中，校正正pH至至7.4，加入，加入25mL溴甲酚紫指示液溴甲酚紫指示液(0.4g/L)，按检验要求分装，并放人一个小倒按检验要求分装，

4、并放人一个小倒管，加热至管，加热至115高压灭菌高压灭菌15 min灭菌生理盐水灭菌生理盐水：0.9革兰氏染色液：革兰氏染色液： 结晶紫染色液结晶紫染色液： 1g结晶紫溶于结晶紫溶于20mL95%乙醇乙醇，与与80mL草酸铵溶液（草酸铵溶液（10g/ L)混合，摇匀。混合，摇匀。 革兰氏碘液革兰氏碘液： 1g碘与碘与2g碘化钾混合后，用少量水溶解，碘化钾混合后，用少量水溶解，稀释至稀释至300 mL。 沙黄复染液沙黄复染液： 0.25g沙黄溶于沙黄溶于10ml95%乙醇中，然后用乙醇中，然后用90ml水稀释，混匀。水稀释，混匀。实验内容与步骤实验内容与步骤1）检样稀释）检样稀释（无菌操作）无菌

5、操作）将将25mL（或或g）检样置于含检样置于含225mL灭菌生理盐水灭菌生理盐水的灭菌玻璃瓶，充分振摇（固体检样用匀浆器，的灭菌玻璃瓶，充分振摇（固体检样用匀浆器，用用800010000r/min的速度处理的速度处理1 min）制成制成1：10的均匀稀释液。的均匀稀释液。用用1mL灭菌吸管吸取灭菌吸管吸取1：10稀释液稀释液1mL，注入含有注入含有9mL灭菌生理盐水的试管内，混匀，制成灭菌生理盐水的试管内，混匀，制成1 ：100的稀释液。的稀释液。另取另取1mL灭菌吸管，按操作依次做灭菌吸管，按操作依次做10倍递增稀倍递增稀释液，每稀释一次，换用一支释液，每稀释一次，换用一支1 mL灭菌吸管

6、。灭菌吸管。 2）乳糖发酵实验）乳糖发酵实验 接种接种2mL待检样品于乳糖胆盐发酵管内。待检样品于乳糖胆盐发酵管内。接种接种3个稀释度，每一稀释度接种个稀释度，每一稀释度接种3管，置管，置（36土土1)温箱内培养（温箱内培养（24士士2) h。如所有如所有乳糖胆盐发酵管都不产气，则可报告为大肠乳糖胆盐发酵管都不产气，则可报告为大肠杆菌群阴性，如有产气者，则按下列程序进杆菌群阴性，如有产气者，则按下列程序进行。行。3）分离培养分离培养 将产气的发酵管分别转接在伊红美蓝将产气的发酵管分别转接在伊红美蓝琼脂平板上，置（琼脂平板上，置（36士士1)恒温箱内培养恒温箱内培养18一一24 h。取出，观察菌

7、落形态，并做革兰取出，观察菌落形态，并做革兰氏染色和证实试验。氏染色和证实试验。4）证实试验证实试验 在上述平板上，挑取可疑大肠菌群菌落在上述平板上，挑取可疑大肠菌群菌落1一一2个进行革兰氏染色，同时接种乳糖发酵个进行革兰氏染色，同时接种乳糖发酵管，置（管，置（36士士1)恒温箱内培养（恒温箱内培养（24士士2) h，观察产气情况。凡乳糖产酸产气、革兰氏观察产气情况。凡乳糖产酸产气、革兰氏染色为阴性的无芽袍杆菌，即可报告为大染色为阴性的无芽袍杆菌，即可报告为大肠菌群阳性。肠菌群阳性。实验报告实验报告 根据证实为大肠菌群阳性的管数，查根据证实为大肠菌群阳性的管数，查MPN检索表，报告每检索表，报

8、告每100mL（或或g）大肠菌大肠菌群的群的MPN。注：注：本表采用本表采用3 3个稀释度：个稀释度：1 1ML(g)ML(g)，0.1mL(g0.1mL(g）和和0.01 0.01 mL (g)mL (g)。每稀释度每稀释度3 3管。管。 表内所列检样量如改用表内所列检样量如改用1010mL(g)mL(g)，1mL(g1mL(g）和和0.1mL(g0.1mL(g）时，表内数字应相应降低时，表内数字应相应降低1010倍；如改倍；如改用用0.10.1ML(g), 0.01ML(gML(g), 0.01ML(g）和和0.0010.001mL(gmL(g）时，则时，则表内数字应相应增加表内数字应相应

9、增加1010倍，其余可类推。倍，其余可类推。1.斜线法斜线法 2.曲线法曲线法 3.方格法方格法 4.放射法放射法 5.四格法四格法附附1：平板划线接种方法：平板划线接种方法附附2：革兰氏染色法操作步骤：革兰氏染色法操作步骤1、涂片涂片：取大肠杆菌制成涂片，干燥，固定。：取大肠杆菌制成涂片，干燥，固定。2、染色染色：用草酸铵结晶紫染色：用草酸铵结晶紫染色1min , ,用水冲洗。用水冲洗。3、媒染媒染：滴加革兰氏碘液冲去残水，并用碘液覆：滴加革兰氏碘液冲去残水，并用碘液覆盖盖1min，用水冲去碘液。用水冲去碘液。4、乙醇脱色乙醇脱色：斜置载玻片于一烧杯上，滴加：斜置载玻片于一烧杯上，滴加95%

10、乙醇，并轻轻摇动载片，至乙醇液不呈现紫色时乙醇，并轻轻摇动载片，至乙醇液不呈现紫色时停止（约停止（约0.5min）。）。立即用水冲净乙醇并用滤纸立即用水冲净乙醇并用滤纸轻轻吸干。脱色是革兰氏染色的关键，必须严格轻轻吸干。脱色是革兰氏染色的关键，必须严格掌握乙醇的脱色程度。若脱色过度则阳性菌被误掌握乙醇的脱色程度。若脱色过度则阳性菌被误染为阴性菌；而脱色不够时阴性菌被误染为阳性染为阴性菌；而脱色不够时阴性菌被误染为阳性菌。菌。5、复染复染：蕃红染液复染：蕃红染液复染1min ,水洗。水洗。6、吸干并镜检吸干并镜检：若研究工作中要确证未知菌：若研究工作中要确证未知菌的革兰氏反应时，则需同时用已知菌

11、进行染的革兰氏反应时，则需同时用已知菌进行染色作对照。色作对照。步骤：结果: 阳性菌阳性菌紫色紫色 阴性菌阴性菌红色红色结晶紫初染碘液媒染乙醇脱色蕃红复染涂片固定革兰氏染色法（革兰氏染色法（Gram Stain） 细菌经细菌经结晶紫结晶紫初染染成初染染成紫色紫色。 革兰氏染色阳性菌革兰氏染色阳性菌（G+）细胞壁肽聚糖层数多，细胞壁肽聚糖层数多，为空间网状结构，再经乙醇脱水，网状结构更为致为空间网状结构，再经乙醇脱水，网状结构更为致密，染料复合物不易从细胞内漏出，仍为密，染料复合物不易从细胞内漏出，仍为紫色紫色。 革兰氏染色阴性菌革兰氏染色阴性菌（G-）细胞壁脂类含量多，细胞壁脂类含量多，肽聚糖层数少，为平面片层结构，易被乙醇溶解，肽聚糖层数少，为平面片层结构，易被乙醇溶解，使细胞壁通透性增高，结合的染料复合物容易泄漏，使细胞壁通透性增高，结合的染料复合物容易泄漏，细菌被脱色为无色，再经蕃红复染成细菌被脱色为无色，再经蕃红复染成红色红色