基因克隆的载体

1、 基因克隆的载体基因克隆的载体 载体（载体（vectorvector）是由在细胞中能）是由在细胞中能够自主复制的分子构成的一种够自主复制的分子构成的一种遗传成分，通过实验手段可使其它的遗传成分，通过实验手段可使其它的片段连接在它的上面，而进行片段连接在它的上面，而进行复制，作为基因工程的载体，必须具复制，作为基因工程的载体，必须具备以下几个性能：备以下几个性能： 1 1、分子较小，可携带比较大的片段。、分子较小，可携带比较大的片段。 2 2、能独立于染色体而进行自主复制并且是高效的复制。、能独立于染色体而进行自主复制并且是高效的复制。 3 3、要有尽可能多种限制酶的切割位点，但每一种限制、要有

2、尽可能多种限制酶的切割位点，但每一种限制酶又要最少的切割位点（多克隆位点酶又要最少的切割位点（多克隆位点 multiple cloning sites ，MCSMCS） 。 4 4、有适合的标记，易于选择。、有适合的标记，易于选择。 5 5、有时还要求载体要能启动外源基因进行转录及表达，、有时还要求载体要能启动外源基因进行转录及表达，并且尽可能是高效的表达。并且尽可能是高效的表达。 6 6、从安全角度考虑，要求载体不能随便转移，仅限于、从安全角度考虑，要求载体不能随便转移，仅限于在某些实验室内特殊菌种内才可复制等等。在某些实验室内特殊菌种内才可复制等等。 载体载体功能功能克隆载体克隆载体: :

3、 克隆一个基因或克隆一个基因或DNADNA片断片断表达载体表达载体: : 用于一个基因的蛋白表达用于一个基因的蛋白表达整合载体整合载体: : 把一个基因插入到染色体组中把一个基因插入到染色体组中载载 体体来源：来源： 质粒载体质粒载体 噬菌体载体噬菌体载体 柯斯质粒载体柯斯质粒载体 真核细胞克隆载体真核细胞克隆载体质粒*受体细胞结构插入片断举例 E.coli环状 8*pUC18/19 , T-载体pGEM- 3z等 噬菌体E.coli线状9 - 24kbEMBL系列， gt系列丝状噬菌体及噬菌粒E.coli环状 10 kbM13mp系列粘粒载体E.coli环状35- 45kbpJB8,c2RB

4、, pcoslEMBL, pWE15/16, pCV BAC (Bacterial Artificial Chromosome)E.coli环状300 kbPel oBAC系列PAC (P1-derived Artificial chromosome)E.coli环状100 - 2000 kbPCYPAC1YAC (Yeast Artificial chromosome )酵母细胞线性染色体100 - 2000 kbMAC (Mammalian Artificial Chromosome)哺乳类细胞线性染色体 1000 kb病毒载体动物细胞环状SV40 载体，昆虫杆状病毒载体穿梭载体动物细胞和

5、细菌环状pSVK3质粒，PBV,Ti质粒载体的种类和特征载体的种类和特征第一节第一节 质粒（质粒（plasmidplasmid）载体）载体 质粒是一种独立于染色体外的小分子环状质粒是一种独立于染色体外的小分子环状DNADNA，一般大小约，一般大小约10106 610108 8D D，可自身复制和表，可自身复制和表达，有的质粒还带有可做为选择性标记的抗药达，有的质粒还带有可做为选择性标记的抗药性基因，所以质粒经过适当改选后便可成为良性基因，所以质粒经过适当改选后便可成为良好的载体。好的载体。 作为载体的质粒大多是由天然质粒经人工适作为载体的质粒大多是由天然质粒经人工适当改造而成的，目前已有多种经

6、改造的良好的当改造而成的，目前已有多种经改造的良好的质粒载体。质粒载体。质粒（质粒（plasmidplasmid） 是存在于细菌染色体外的小型环状双链是存在于细菌染色体外的小型环状双链DNADNA 分子。大小约为分子。大小约为 数千碱基对。常数千碱基对。常 有有1 31 3个抗药个抗药 性基因，以利于性基因，以利于 筛选。筛选。质粒载体质粒载体 克隆的质粒载体克隆的质粒载体 允许外源的允许外源的DNADNA插入，储存。主插入，储存。主要是要是DNADNA水平上的操作。水平上的操作。 基因表达的质粒载体基因表达的质粒载体 允许外源允许外源DNADNA的插入、储存和表的插入、储存和表达。达。一、一

7、、质粒的生物学特性： 1、质粒DNA的构型： SC型 共价闭合环形DNA（cccDNA） OC型 开环DNA（ocDNA） L 型 线性DNA（cDNA） 2、不同质粒的分子量大小差异相当显著： 106108D 3、作为载体的质粒都含有三种共同的组分： 复制基因（replicator）、选择性记号、克隆位点 LOCSC4、质粒DNA编码着一些重要的非染色体控制的遗传性状。 抗性特征、代谢特征、修饰寄主生活方式的因子都等抗性特征、代谢特征、修饰寄主生活方式的因子都等5、质粒DNA的类型： 接合型和非接合型；含大肠杆菌素Col质粒和含抗菌 素抗性基因的R质粒；F因子和F因子等。按接合转移功能分类主

8、要基因按抗性记号分类非接合型质粒自主复制基因，长生大肠杆菌素基因Col质粒自主复制基因，抗菌素抗性基因R质粒(R因子) 接合型质粒自主复制基因，转移基因，细菌染色体区段F质粒（ F因子）自主复制基因，转移基因，大肠杆菌素基因Col质粒自主复制基因，转移基因，抗菌素抗性基因R质粒(R因子)自主复制基因，转移基因，大肠杆菌素基因Ent质粒6 6、质粒、质粒DNADNA的复制类型：的复制类型： 低拷贝的质粒（低拷贝的质粒（1 13 3）：严紧型复制控制的质粒）：严紧型复制控制的质粒 （接合型）（接合型） 高拷贝的质粒（高拷贝的质粒（10601060）：松弛型复制控制的质粒）：松弛型复制控制的质粒（非

9、接合型）（非接合型） 7 7、质粒的不亲合性、质粒的不亲合性 在同一个大肠杆菌细胞，一般不能同时含有两种不在同一个大肠杆菌细胞，一般不能同时含有两种不同的。也称为质粒的不相容性。同的。也称为质粒的不相容性。 是指在没有选择压力的情况下，两种亲源关系密切是指在没有选择压力的情况下，两种亲源关系密切的不同质粒，不能够在同一个寄主细胞系中稳定地共的不同质粒，不能够在同一个寄主细胞系中稳定地共存的现象。存的现象。 质粒的不亲合性分子基础，主要是由于它们在复制质粒的不亲合性分子基础，主要是由于它们在复制功能之间的相互干扰造成的。功能之间的相互干扰造成的。（二二 ） 、质粒质粒DNADNA的分离与纯化的分

10、离与纯化 1 1、氯化铯密度梯度离心法；、氯化铯密度梯度离心法； 2 2、碱变性法；、碱变性法； 3 3、微量碱变性法。、微量碱变性法。 1.氯化铯密度梯度离心法 1、质粒DNA占总DNA的1%2%； 2、在细胞裂解及DNA分离过程中，大分子量的细菌染色体易断裂成线性片断，而质粒DNA分子量小，结构紧密仍保持完整的状态； 3、染色剂溴化乙锭（EB）能掺入到DNA链的碱基中，导致链的解旋；而且形成的EB- DNA复合物中，EB含量越高，密度会越低。流程：流程： 首先加入溶菌酶或十二烷基硫酸钠首先加入溶菌酶或十二烷基硫酸钠（SDSSDS）来促进大肠杆菌的细胞裂解。）来促进大肠杆菌的细胞裂解。 将溴

11、化乙锭的氯化铯溶液加到清亮的将溴化乙锭的氯化铯溶液加到清亮的大肠杆菌裂解液中，大肠杆菌裂解液中，EBEB会嵌入到会嵌入到DNADNA链链的碱基中去。的碱基中去。 在在EBEB达到饱和时，进行氯化铯密度达到饱和时，进行氯化铯密度梯度离心。梯度离心。 2. 2.碱变性法：碱变性法： 根据共价闭合环状质粒根据共价闭合环状质粒DNADNA与线性染色体与线性染色体DNADNA片断之间，在拓扑学上的差异而发展出来片断之间，在拓扑学上的差异而发展出来的。的。 在在PHPH值值12.012.012.512.5范围内时，线性的范围内时，线性的DNADNA会被变性而共价闭合环状质粒会被变性而共价闭合环状质粒DNA

12、DNA却却不会被变不会被变性。性。 通过冷却或恢复中性通过冷却或恢复中性PHPH值使之复性，线性值使之复性，线性染色体形成网状结构，而染色体形成网状结构，而cccDNAcccDNA可以准确迅可以准确迅速复性，通过离心去除线性染色体，获得含有速复性，通过离心去除线性染色体，获得含有cccDNAcccDNA的上清液，最后用乙醇沉淀，获得质的上清液，最后用乙醇沉淀，获得质粒粒DNADNA3.3.碱变性法：碱变性法：1 1、取、取1.51.5毫升含质粒的大肠杆菌过夜培养物，加在毫升含质粒的大肠杆菌过夜培养物，加在微量离心管中，离心收集细胞沉淀；微量离心管中，离心收集细胞沉淀；2 2、加入、加入1001

13、00微升冰冷的微升冰冷的液，（液，（50mM50mM葡萄糖，葡萄糖， 25mM Tris-HCl PH=8.0, 10mM EDTA25mM Tris-HCl PH=8.0, 10mM EDTA，45mg45mg溶菌酶）静置溶菌酶）静置5 5分钟；分钟；3 3、加入、加入200200微升微冷的微升微冷的液（液（0.2NaOH0.2NaOH，1.0%SDS1.0%SDS）缓缓缓缓混匀置室温混匀置室温5 5分钟。分钟。 6565度水浴一段时间会加强染色体度水浴一段时间会加强染色体DNADNA的变性作用。的变性作用。4 4、加入、加入150150毫升冰冷的毫升冰冷的PH=4.8PH=4.8的的3M3

14、M醋酸钠，振荡醋酸钠，振荡后，冰浴后，冰浴5 5分钟。分钟。5 5、离心的上清液用苯酚抽提数次，用乙醇沉淀收、离心的上清液用苯酚抽提数次，用乙醇沉淀收集质粒集质粒DNADNA。4.影响质粒DNA产量的因素： 1 1、寄主菌株的遗传背景、寄主菌株的遗传背景 使用使用endAendA基因发生突变的菌株，编码核酸内基因发生突变的菌株，编码核酸内切酶切酶从野生型的菌株中提取质粒须采取的措施： 选择最适的培养条件，以限制在细胞选择最适的培养条件，以限制在细胞生长期间，体内核酸内切酶生长期间，体内核酸内切酶 的表达；的表达； 在纯化质粒在纯化质粒DNADNA的过程中，用加热法的过程中，用加热法核酸内切酶核

15、酸内切酶使失活；使失活； 采用最佳的实验流程，减少采用最佳的实验流程，减少核酸内切核酸内切酶酶的污染并在纯化了质粒的污染并在纯化了质粒DNADNA之后，迅速除之后，迅速除去污染的核酸酶。去污染的核酸酶。 2 2、质粒的、质粒的拷贝数拷贝数及分子的大小及分子的大小 插入分子量大的外源插入分子量大的外源DNADNA会引起质粒拷会引起质粒拷贝数的下降。贝数的下降。（三）、质粒载体的构建与类型（三）、质粒载体的构建与类型 1. 1. 天然质粒：天然质粒：没有经过以基因克隆为目标没有经过以基因克隆为目标 的体外修饰改造的质粒。的体外修饰改造的质粒。 在大肠杆菌中，常见的可用于基因克隆的在大肠杆菌中，常见

16、的可用于基因克隆的天然质粒有天然质粒有EolE1、RSF2124和和pSC101等，等，但存在一定的局限性。但存在一定的局限性。 第一个用于基因克隆的天然质粒第一个用于基因克隆的天然质粒pSC101，它含有一个，它含有一个EcoR酶切位点，酶切位点，一个四环素抗性选择记号（一个四环素抗性选择记号（Tetr ），插），插入外源片断后不影响其复制功能，入外源片断后不影响其复制功能，但该但该质粒分子量较大，拷贝数低只具有抗菌质粒分子量较大，拷贝数低只具有抗菌素抗性基因，无法使用插入失活技术选素抗性基因，无法使用插入失活技术选择重组分子。择重组分子。 ColE1 ColE1质粒在其唯一的单切割位点质粒

17、在其唯一的单切割位点EcoRlEcoRl中克隆外源中克隆外源DNADNA片断后，可根据对片断后，可根据对大肠杆菌素大肠杆菌素E1E1的免疫性选择转化子，不的免疫性选择转化子，不能合成大肠杆菌素能合成大肠杆菌素E1E1的菌落是具有重组的菌落是具有重组质粒的转化子。质粒的转化子。但对大肠杆菌素但对大肠杆菌素E1E1的免的免疫筛选，在化学上是相当麻烦的。疫筛选，在化学上是相当麻烦的。2. 2.质粒载体必须具备的基本条件质粒载体必须具备的基本条件 (1) 、具有复制起点；、具有复制起点； 自我增值的基本条件，一般具自我增值的基本条件，一般具一个一个复制子。复制子。 (2) 、具有抗菌素抗性；、具有抗菌

18、素抗性； 理想的质粒载体具有理想的质粒载体具有两种两种抗菌素抗性基因。抗菌素抗性基因。 (3) 、具有若干限制酶切、具有若干限制酶切单一单一位点（位点（CMS）；）； (4) 、具有较小的分子量和较高的拷贝数。、具有较小的分子量和较高的拷贝数。 低分子量的质粒易于操作，克隆外源片断低分子量的质粒易于操作，克隆外源片断 后仍能有效的转化给受体细胞同时低分子量后仍能有效的转化给受体细胞同时低分子量的质粒对限制酶具有多重识别位点的几率也较低；的质粒对限制酶具有多重识别位点的几率也较低；较高的拷贝数可获得大量的克隆基因较高的拷贝数可获得大量的克隆基因以Ampr和Tetr为选择性标记，克隆位点在这两个选

19、择性标记的单酶切位点上。选择AmprTets或AmpsTetr的重组子。（4363bp） 3.质粒载体的选择记号质粒载体的选择记号 新陈代谢特性；新陈代谢特性； 对大肠杆菌素对大肠杆菌素E1的免疫性；的免疫性； 抗菌素抗性；抗菌素抗性； 四环素抗性、氨苄青霉素抗性、四环素抗性、氨苄青霉素抗性、 链霉素抗性、卡那霉素抗性链霉素抗性、卡那霉素抗性 大多数质粒本身带有抗菌素基因；大多数质粒本身带有抗菌素基因； 抗菌素抗性记号便于操作、易于选择。抗菌素抗性记号便于操作、易于选择。4. 4.不同类型的质粒载体不同类型的质粒载体高拷贝的质粒载体高拷贝的质粒载体克隆的目的是为分离大量的高纯度的克隆基因克隆的

20、目的是为分离大量的高纯度的克隆基因低拷贝的质粒载体低拷贝的质粒载体 有些克隆的编码基因，其产物含量过高会有些克隆的编码基因，其产物含量过高会严重的干扰寄主细胞的正常新陈代谢活动。严重的干扰寄主细胞的正常新陈代谢活动。 编码表面结构蛋白质的一些基因、调节细胞基编码表面结构蛋白质的一些基因、调节细胞基础代谢活动的蛋白质编码基因以及囊纤维化跨础代谢活动的蛋白质编码基因以及囊纤维化跨膜传导调节蛋白质编码基因等。膜传导调节蛋白质编码基因等。 (1)(1)失控的质粒载体失控的质粒载体 复制控制是温度敏感型的低拷贝的质粒。复制控制是温度敏感型的低拷贝的质粒。ExampleExample： pBEU1pBEU

21、1和和pBEU2pBEU2质粒，在质粒，在3030度下，每个寄度下，每个寄主细胞只含有适量的拷贝数，当培养温度超过主细胞只含有适量的拷贝数，当培养温度超过3535度时，质粒的复制将失去控制，每个细胞中度时，质粒的复制将失去控制，每个细胞中的拷贝数便持续上升。在这种高温环境下，细的拷贝数便持续上升。在这种高温环境下，细胞的生长和蛋白质的合成可按正常的速率持续胞的生长和蛋白质的合成可按正常的速率持续2323小时。最后得到超量的基因编码产物，细小时。最后得到超量的基因编码产物，细胞生长受抑制失去存活能力，积累的质粒胞生长受抑制失去存活能力，积累的质粒DNADNA占细胞总占细胞总DNADNA的的50%

22、50%。 (2)(2)插入失活型质粒载体插入失活型质粒载体 将外源将外源DNA片断插入在质粒上会导片断插入在质粒上会导致选择记号基因失活的位点，就有可能致选择记号基因失活的位点，就有可能通过抗菌素抗性的筛选，大幅度的提高通过抗菌素抗性的筛选，大幅度的提高获得阳性克隆的机会。获得阳性克隆的机会。ExampleExample： 在在pBR329质粒载体的质粒载体的EcoR1位点插入外位点插入外源片断，会使氯霉素抗性基因失活，在源片断，会使氯霉素抗性基因失活，在筛选的氯霉素敏感的转化子细胞群体中，筛选的氯霉素敏感的转化子细胞群体中，含有插入片断的重组体质粒的几率会显含有插入片断的重组体质粒的几率会显

23、著上升。著上升。 (3)(3)正选择的质粒载体正选择的质粒载体正向选择：应用只有突变体或重组体才能正向选择：应用只有突变体或重组体才能 正常生长的培养条件进行选择。正常生长的培养条件进行选择。 这种质粒载体具有直接选择记号这种质粒载体具有直接选择记号 并可并可 赋予寄主细胞相应的表型。赋予寄主细胞相应的表型。ExampleExample： 质粒质粒pKN80pKN80有来自有来自MuMu噬菌体噬菌体DNADNA的的EcoR1-CEcoR1-C的片断，编码一种致的片断，编码一种致死功能的死功能的kilkil基因。基因。该质粒在该质粒在MuMu噬菌体的溶噬菌体的溶源菌株中正常复制；源菌株中正常复制

24、；在非溶源菌株中是致在非溶源菌株中是致死的。死的。在在HindHind 或或Hpa Hpa 位点位点插入外源插入外源DNADNA片断后，片断后，会产生具会产生具AmpAmpr表型的表型的MuMu噬菌体的非溶源的噬菌体的非溶源的转化子菌株。转化子菌株。正向选择质粒载体的条件限制：正向选择质粒载体的条件限制： 1、需要特殊的寄主菌株或选择培养基、需要特殊的寄主菌株或选择培养基 2、可使用的克隆位点少、可使用的克隆位点少 3、 假阳性水平高假阳性水平高 4、 不能够调节插入序列表达活性不能够调节插入序列表达活性 (4)表达型的质粒载体表达型的质粒载体表达载体：表达载体： 按特殊设计构建的，按特殊设计

25、构建的，能使克隆在其中特定位点的外源能使克隆在其中特定位点的外源真核基因的编码序列，在大肠杆真核基因的编码序列，在大肠杆菌细胞中正常转录并转译成相应菌细胞中正常转录并转译成相应蛋白质的克隆载体。蛋白质的克隆载体。 主要包括：大肠杆菌的启动子、及操主要包括：大肠杆菌的启动子、及操纵位点序列、多克隆位点、转录及转纵位点序列、多克隆位点、转录及转译信号、质粒载体的复制起点及抗菌译信号、质粒载体的复制起点及抗菌素抗性基因。素抗性基因。 待表达的真核基因编码序列被克隆待表达的真核基因编码序列被克隆在紧挨于启动子下游的多克隆位点上，在紧挨于启动子下游的多克隆位点上，而且必须是其编码的蛋白质氨基酸末而且必须

26、是其编码的蛋白质氨基酸末端这一头靠近启动子方向插入，才能端这一头靠近启动子方向插入，才能在启动子控制下进行有效的转录。在启动子控制下进行有效的转录。 四、重要的大肠杆菌质粒载体四、重要的大肠杆菌质粒载体 1 1、pSC101pSC101质粒载体；质粒载体； 2 2、ColE ColE 质粒载体；质粒载体； 3 3、pBR322pBR322质粒载体；质粒载体； 4 4、pUCpUC质粒载体；质粒载体； 5. 5. 其它的重要的质粒载体其它的重要的质粒载体1. 1.pSC101pSC101质粒载体质粒载体 一种严谨型复制控制的地拷贝数的大肠一种严谨型复制控制的地拷贝数的大肠杆菌质粒载体。平均每个寄

27、主细胞仅有杆菌质粒载体。平均每个寄主细胞仅有1212个拷贝；分子量个拷贝；分子量9.09kb9.09kb，编码有一个，编码有一个四环素抗性基因（四环素抗性基因（tettetr r ）。有）。有HindHind 、EcoREcoR、BamH BamH 、Sal Sal 、Xho Xho 、PvuPvu、 Sma Sma 7 7种核酸内切限制酶。其种核酸内切限制酶。其中在中在HindHind 、 BamH BamH 、 Sma Sma 3 3个位点个位点克隆外源克隆外源DNADNA，都会导致，都会导致tettetr r 基因失活。基因失活。 是第一个真核生物的克隆载体。是第一个真核生物的克隆载体。

28、（1）应用pSC101质粒作基因克隆载体 葡萄球菌质粒基因在大肠杆菌中的表达 金黄色葡萄球菌的质粒p1258,编码若干种能 在大肠杆菌检测的结构基因；能被核酸限制酶 EcoR 切割成4段。（2）应用pSC101质粒作基因克隆载体 在大肠杆菌中克隆非洲爪蟾DNA 用核酸内切酶EcoR 消化非洲爪蟾的核糖体DNA（ rDNA ），与EcoR 消化的pSC101质粒进行重组。 在挑取的55个转化子中，经 EcoR 酶切，电泳后13个转化子含有外源片断。转化率23.62. 2.ColE ColE 1 1质粒载体质粒载体 松弛型复制控制的多拷贝的质粒，能产生细菌素。细菌素对大肠杆菌的正常生命活动有抑制作

29、用（复制、转录、转译能量代谢等）。但含有对细菌素的免疫基因。 用 ColE 1质粒特征为基础建立的转化细胞系，存在一定的缺陷性： 1、应用大肠杆菌素免疫作为标记操作上不方便； 2、在细菌群体中，能够以相当高的频率自发的产生出抗菌素的突变体细胞。3.pBR322质粒载体 “P”表示是一种质粒； “BR”表示两位主要构建者姓氏的头一个字母“F.Bilivar和R.L.Rodriguez”;“322”表示实验编号。 四环素抗性基因氨苄青霉素 抗性基因O r i Pst Sal Pvu Ava Bam HHind Eco RpBR322(amp(ampr r) )(ter(terr r) )pBR32

30、2pBR322的构建：的构建： 为改进转化子筛选技术，并具有相对为改进转化子筛选技术，并具有相对小的分子量、高拷贝数、外源基因插入小的分子量、高拷贝数、外源基因插入不影响质粒的复制功能、多克隆位点不影响质粒的复制功能、多克隆位点（多种限制酶的单一切割位点）、质粒（多种限制酶的单一切割位点）、质粒的稳定性（克服质粒的结合转移能力）的稳定性（克服质粒的结合转移能力） pBR322pBR322的结构来源的结构来源pBR322pBR322质粒载体的优点：质粒载体的优点： 1 1、具有较小的分子量；、具有较小的分子量； 它的分子量为它的分子量为4363bp4363bp。克隆载体的分子量大小。克隆载体的分

31、子量大小不要超过不要超过10kb10kb。 2 2、具有两种抗菌素抗性基因可供作转化子的具有两种抗菌素抗性基因可供作转化子的选择记号。选择记号。 pBR322 DNApBR322 DNA分子中总共有分子中总共有2424种核酸内切酶只具有种核酸内切酶只具有单一的酶切识别位点。其中单一的酶切识别位点。其中7 7种内切酶的识别位点种内切酶的识别位点在四环素抗性基因内部，在四环素抗性基因内部，2 2种识别位点在于这个基种识别位点在于这个基因的启动区内，所以因的启动区内，所以9 9个限制酶切位点插入外源片个限制酶切位点插入外源片断可以导致断可以导致tettetr r 基因的失活；另外有基因的失活；另外有

32、3 3种限制酶在种限制酶在氨苄青霉素抗性基因有单一的识别位点，氨苄青霉素抗性基因有单一的识别位点，Example:a. 在pBR322质粒的BamH或Sal位点插入外源DNA片断，切断了tettetr r基因编码序列的连续性，使之失去活性，产生出Ampr rTets s表型的重组pBR322质粒，转化入Amps sTets s的大肠杆菌细胞。先涂布在含氨苄青霉素的选择培养基上，筛选出具Ampr r菌落，再将它们涂布于含四环素的选择性培养基上。插入外源片断的重组质粒不能在这种培养基上生长。B X BBBXAmproriAmpsTetroriAmprTetroripBR322BABBTetsX b

33、.在Pst或Sca识别位点插入外源片断会导致Ampr r基因的失活，产生Amps sTetr r表型的质粒。转化大肠杆菌之后，获得的重组子可以比较快的检测出来。其依据是Ampr r表型的细胞可以合成 内酰胺酶，它能使青霉素转变成青霉酮酸，而这种青霉酮酸能与碘结合。在含有可溶性淀粉和四环素的富裕培养基上选择转化子，经37度培养过夜后，在此平板上加入少量的碘指示剂溶液产生青霉素 内酰胺酶Ampr r的菌落，其周围的碘指示剂溶液变得明亮，而Amps s菌落无此反应。 3、具有较高的拷贝数，而且经过氯霉素扩增之后每个细胞中可积累10003000个拷贝。 pBR322pBR322质粒载体的改良质粒载体的

34、改良 为了更加实用，人们对为了更加实用，人们对pBR322pBR322质粒进质粒进行了改良，得到许多行了改良，得到许多pBR322pBR322质粒衍生质质粒衍生质粒，它们各自具有不同的特点。粒，它们各自具有不同的特点。应用应用pBR322pBR322质粒作为基因克隆载体质粒作为基因克隆载体 水稻叶绿体光诱导基因水稻叶绿体光诱导基因psbApsbA的结构分析的结构分析 基因基因psbApsbA编码的蛋白质，与光合作用系编码的蛋白质，与光合作用系统统相关，并且它能与除草剂阿特拉津结合，相关，并且它能与除草剂阿特拉津结合，它的第它的第264264位氨基酸发生取代反应，由丝氨酸位氨基酸发生取代反应，由

35、丝氨酸变为甘氨酸，可导致其失去与变为甘氨酸，可导致其失去与除草剂阿特拉津除草剂阿特拉津结合的能力结合的能力，推测是三维结构发生了改变，推测是三维结构发生了改变 ；在；在原生生物衣藻、蓝色细菌中，此蛋白质在同一原生生物衣藻、蓝色细菌中，此蛋白质在同一位置由丝氨酸变为丙氨酸的取代反应，会使他位置由丝氨酸变为丙氨酸的取代反应，会使他们获得对除草剂的抗性功能。们获得对除草剂的抗性功能。 而且，非竞争条件下，对除草剂阿特拉而且，非竞争条件下，对除草剂阿特拉津抗性的千里光属和苋属，干物质产量比敏感津抗性的千里光属和苋属，干物质产量比敏感植物下降了植物下降了25%25%和和40%40%。 通过对基因通过对基

36、因psbApsbA的体外操作，有可能创造的体外操作，有可能创造出抗除草剂的或高光效的转基因植株。用出抗除草剂的或高光效的转基因植株。用pBR322pBR322质粒作为载体，成功的克隆了水稻的质粒作为载体，成功的克隆了水稻的psbApsbA基因。基因。 首先将水稻叶绿体首先将水稻叶绿体DNADNA，用，用EcoREcoR内切酶消内切酶消化，经含有溴化乙锭的熔点琼脂糖电泳，回收化，经含有溴化乙锭的熔点琼脂糖电泳，回收分子大小为分子大小为1.81.82.5kb2.5kb之间的之间的DNADNA片断。片断。 再与经过再与经过EcoREcoR内切酶切割并用碱性磷酸酶内切酶切割并用碱性磷酸酶作了脱磷酸处理

37、的作了脱磷酸处理的pBR322pBR322质粒质粒DNADNA连接。连接。 然后转化给大肠杆菌，在氨苄青霉素的选择然后转化给大肠杆菌，在氨苄青霉素的选择培养基上，形成培养基上，形成AmpAmpr r转化子菌落群体。转化子菌落群体。 用经用经32p32p标记的玉米标记的玉米psdADNApsdADNA探针作菌落杂探针作菌落杂交，从交，从10001000多个菌落中筛选出多个菌落中筛选出8 8个阳性克隆。个阳性克隆。 对这8个阳性克隆进行进一步的Southern分析，表明6个片断带有长度为2.2kb的编码水稻叶绿体psdA基因。实际上其中1.2kb的片断编码着水稻psdA基因的全部序列。通过dna序

38、列分析表明与高等植物的同原性在92%，与蓝色细菌同源性75%4. 4. pUCpUC质粒载体质粒载体 人们应用多克隆位点技术，人们应用多克隆位点技术，在在pBR322pBR322的基础上，组入了一的基础上，组入了一个在其个在其5-5-端带有一段多克隆位端带有一段多克隆位点的点的lacZlacZ基因，而发展的具有基因，而发展的具有双功能检测特性的新型质粒载体双功能检测特性的新型质粒载体系列。系列。 一种典型的一种典型的pUCpUC系列的质粒载体，包括以下系列的质粒载体，包括以下四个部分：四个部分： 1 1、来自、来自pBR322pBR322质粒的复制起点（质粒的复制起点（oriori）；）； 2

39、 2、氨苄青霉素抗性基因（、氨苄青霉素抗性基因（ampampr r ）, ,但它的但它的DNADNA核苷酸序列已经发生了变化，不在含有原核苷酸序列已经发生了变化，不在含有原来的核酸内切限制酶的但识别位点。来的核酸内切限制酶的但识别位点。 3 3、大肠杆菌、大肠杆菌-半乳糖基因（半乳糖基因（lacZlacZ）的启动子）的启动子及编码及编码-肽链的肽链的DNADNA序列，此结构称之为序列，此结构称之为lacZlacZ基因；基因； 4 4、位于、位于lacZlacZ基因中的靠近基因中的靠近5-5-端的一段多端的一段多克隆位点（克隆位点（MCSMCS）区段。但它并不破坏该基因）区段。但它并不破坏该基因

40、的功能。的功能。AmproripUC18(3 kb)MCS (Multiple cloning sites,多科隆位点）Lac promoterlacZpUCpUC质粒载体的形体图质粒载体的形体图pUC质粒载体的优点第一， 具有较小的分子量和更高的拷贝数; 仅保留了pBR322的氨苄青霉素抗性基因和复制起点；在操作过程中复制起点内部发生了自发突变造成了基因rop的缺失，它是控制质粒的特殊因子，从而使拷贝数增加，平均每个细胞500700个拷贝。第二，适用于组织化学检测重组体； 具有来自大肠杆菌lac操纵子的lacZ基因，所编码的-肽链可参与- 互补作用，用Xgal显色对重组子进行鉴定，而pBR3

41、22质粒的重组子要进行两步的选择。 第三，具有多克隆位点MCS区段 方便具有不同粘性末端的外源片断的插入。5. 5.其它的重要的质粒载体其它的重要的质粒载体丧失迁移功能的质粒载体能在体外转录克隆基因的质粒载体穿梭质粒载体（1 1）丧失迁移功能的质粒载体）丧失迁移功能的质粒载体第一：拥有较高水平的拷贝数第一：拥有较高水平的拷贝数, ,平平均每个大肠杆菌寄主细胞可达均每个大肠杆菌寄主细胞可达30453045份份; ; 第二第二: :失去了失去了bombom位点，即便在共位点，即便在共存的存的F F质粒提供转移装置的条件下，质粒提供转移装置的条件下，也不可能发生迁移作用。也不可能发生迁移作用。（2）

42、能在体外转录克隆基因的质粒载体 pGEM-3Z是一种与pUC系列十分类似的小分子的质粒载体，总长度2743bp，编码有一个氨苄青霉素抗性基因和一个lacZ基因。 pGEM-3Z与pUC质粒之间的主要区别是，它具有两个来自噬菌体的启动子，即T7启动子和SP6启动子，它们为RNA聚合酶的附着作用提供了特异的识别位点。pGEM-11 现在以发展出了一大批在多克隆位现在以发展出了一大批在多克隆位点区附近参入噬菌体点区附近参入噬菌体RNARNA聚合酶启动子聚合酶启动子的简单的质粒载体，它们都是由的简单的质粒载体，它们都是由pUCpUC系系列载体派生而来的。列载体派生而来的。 噬菌体的噬菌体的RNARNA

43、聚合酶，所合成的聚合酶，所合成的RNARNA转录本除了可作为杂交探针之外，转录本除了可作为杂交探针之外，在兔网织红细胞裂解物转译体系或在麦在兔网织红细胞裂解物转译体系或在麦胚无细胞转移体系中进行体外蛋白质的胚无细胞转移体系中进行体外蛋白质的合成。在反应混合物中加入合成。在反应混合物中加入m7GpppGm7GpppG，能形成能形成55的帽子结构，进行有效的蛋白的帽子结构，进行有效的蛋白质合成。质合成。 （3）穿梭质粒载体（ shuttle plasmid vector ） 是指一类由人工构建的具有两种不同复制起点和选择记号，因而可在两种不同的寄主细胞存活和复制的质粒载体。早期发现的大肠杆菌早期发

44、现的大肠杆菌- -枯草杆菌穿梭枯草杆菌穿梭质粒载体质粒载体大肠杆菌大肠杆菌- -酿酒酵母穿梭质粒载体酿酒酵母穿梭质粒载体大肠杆菌大肠杆菌- -牛乳头瘤病毒牛乳头瘤病毒迄今还没有发展出适用的大肠杆菌迄今还没有发展出适用的大肠杆菌- -植物细胞穿梭载体。植物细胞穿梭载体。五、质粒载体的稳定性问题1、质粒载体不稳定性的类型 结构的不稳定性：主要指由转位和重组作用所引起的质粒DNA的重排与缺失。 分离的不稳定性：在细胞分裂过程中，有一个子细胞没有获得质粒DNA拷贝，并最终增值成为无质粒的优势群体。结构的不稳定性结构的不稳定性 DNADNA的缺失、插入和重排是造成质的缺失、插入和重排是造成质粒载体结构不

45、稳定性的原因。粒载体结构不稳定性的原因。 1 1、质粒的自发缺失：同向重复短序列之、质粒的自发缺失：同向重复短序列之间的同源重组。间的同源重组。 2 2、寄主染色体及质粒载体上的、寄主染色体及质粒载体上的IS IS因子或因子或转位因子也会引起结构的不稳定性。转位因子也会引起结构的不稳定性。分离的不稳定性分离的不稳定性 细胞分裂过程中发生的质粒细胞分裂过程中发生的质粒不平均不平均的分配的分配，也是导致质粒不稳定性的重要，也是导致质粒不稳定性的重要原因，将这种起因于质粒的缺陷性分配原因，将这种起因于质粒的缺陷性分配所造成的质粒的丢失现象，叫作质粒分所造成的质粒的丢失现象，叫作质粒分离的不稳定性。离

46、的不稳定性。 要使质粒能够稳定的遗传，必须保证要使质粒能够稳定的遗传，必须保证平均每个世代质粒最少复制一次；并且，平均每个世代质粒最少复制一次；并且，细胞分裂过程中，质粒复制的拷贝必须分细胞分裂过程中，质粒复制的拷贝必须分配配 到两个子细胞中去。到两个子细胞中去。主动分配：主动分配：a. a.平均分配机理：使每个子细胞刚好获得一平均分配机理：使每个子细胞刚好获得一半数目的质粒拷贝半数目的质粒拷贝b.b.配对位点分配机理：只有一半数目的质粒配对位点分配机理：只有一半数目的质粒呈主动分配，其余是随机分配的。呈主动分配，其余是随机分配的。随机分配：细胞分裂过程中质粒拷贝数在两随机分配：细胞分裂过程中

47、质粒拷贝数在两个子细胞之间是随机分配的。个子细胞之间是随机分配的。影响质粒载体稳定性的主要因素：影响质粒载体稳定性的主要因素： 1 1、新陈代谢负荷对质粒载体稳定性的效应。、新陈代谢负荷对质粒载体稳定性的效应。 质粒载体会加重寄主细胞的代谢负荷；质粒载体会加重寄主细胞的代谢负荷； 外源克隆基因的产物对寄主细胞的毒害作用。外源克隆基因的产物对寄主细胞的毒害作用。 2 2、拷贝数差度对质粒载体稳定性的影响。、拷贝数差度对质粒载体稳定性的影响。 差度：不同细胞个体之间的质粒载体的拷贝数的差差度：不同细胞个体之间的质粒载体的拷贝数的差 异程度，可影响质粒载体丢失的速率。异程度，可影响质粒载体丢失的速率

48、。 差度越大稳定性越差；差度越小稳定性越高。差度越大稳定性越差；差度越小稳定性越高。3 3、寄主重组体系对质粒载体稳定性的效应、寄主重组体系对质粒载体稳定性的效应 在野生型的大肠杆菌细胞中，质粒重组的在野生型的大肠杆菌细胞中，质粒重组的重要结果是形成质粒寡聚体，它也是造成质粒重要结果是形成质粒寡聚体，它也是造成质粒载体不稳定的原因之一。载体不稳定的原因之一。 质粒质粒DNADNA分子之间的重组频率；分子之间的重组频率； 含质粒寡聚体细胞的生长速率。含质粒寡聚体细胞的生长速率。 影响质粒重组的突变也会影响质粒的稳定性。影响质粒重组的突变也会影响质粒的稳定性。第二节第二节 噬菌体载体噬菌体载体（B

49、acteriophageBacteriophage，简称，简称phagephage） 一、 噬菌体的一般生物特性 可脱离寄主细胞生存，但不能进行复制。 除了对寄主的依赖性，还具备其它的功能： 1、保护自己的核苷酸分子（DNA、RNA）免遭环境化学物质的破坏； 2、将其核苷酸分子注入到被感染的细菌细胞； 3、将被感染的细菌细胞转变成制造噬菌体的体系，从而长生出大量的子代噬菌体颗粒； 4、使感染的细菌细胞释放出子代的噬菌体颗粒1. 1. 噬菌体的结构和其核酸类型噬菌体的结构和其核酸类型： 结构：结构：无尾部结构的二十面体型、无尾部结构的二十面体型、 具尾部结构的二十面体型、具尾部结构的二十面体型、

50、 线状体型线状体型 核酸类型：最常见的是双链线性核酸类型：最常见的是双链线性DNADNA、 双链环形双链环形DNADNA、 单链环形单链环形DNADNA、 单链线形单链线形DNADNA、 单链单链RNARNA。 不同的噬菌体之间的核酸分子量的差异也是比较大的。大分子量的噬菌体生命周期比较复杂；对寄主的依赖性较低。 有些噬菌体的DNA碱基不是由标准的A/T/C/G组成的。 Example： T4噬菌体DNA没有C碱基，取代的是5-羟甲基胞嘧啶（HMC）;SP01噬菌体DNA中没有T碱基，取代的是5-羟甲基尿嘧啶（HMU）。 2. 2.噬菌体的溶菌生命周期噬菌体的生命周期分为溶菌周期和溶源周期只具

51、有溶菌生长周期的噬菌体颗粒叫烈性噬菌体。烈性噬菌体溶菌生长的基本过程：1、吸附 吸附到位于感染细胞表面的特殊接受器上2、注入 噬菌体DNA穿过细胞壁注入寄主细胞3、转变 被感染的细胞成为制造噬菌体颗粒的场所4、合成 大量合成噬菌体特有的核酸和蛋白质5、组装 包装了DNA头部和尾部组装成噬菌体的颗粒6、释放 合成的子代噬菌体颗粒从寄主细胞内释放出来 3.噬菌体的溶源生命周期溶源生长周期： 是指在感染过程中没有产生出子代 噬菌体颗粒，噬菌体的DNA是整 合到寄主细胞染色体DNA上，成 为它的一个组成部分。 现知道只有双链DNA的噬菌体才具有溶源周期温和噬菌体：既能进入溶菌生命周期又能进入溶 源生命

52、周期。溶源性细菌：具有一种完整的噬菌体基因组的细菌溶源化： 用温和噬菌体感染细菌培养物使之形成溶 源性细菌的过程整合： 噬菌体的DNA是被包容在寄主细胞染色体 DNA中原噬菌体：在溶源细菌内存在的整合的或非整合的 噬菌体超感染免疫性：溶源性细菌不能够被头一次感染并 使之溶源化的同种噬菌体再感染。溶源周期的主要特征： 噬菌体和P1噬菌体噬菌体的特征： 1、噬菌体的DNA分子注入细菌细胞 2、经过短暂的转录之后，需要合成一种整合酶，于是转录活性便被一种阻遏物所关闭 3、噬菌体的DNA分子插入到细菌染色体基因组DNA上，变成原噬菌体 4、细菌继续生长、增值，噬菌体的基因作为细菌染色体的一部分进行复制

53、。 噬菌体P1基本特征： 不存在噬菌体DNA分子的整合作用体系，而是变成了一种进行独立复制的环形的质粒DNA分子。溶源噬菌体的诱发： 依赖于阻遏基因与操纵基因的相互作用。阻遏物被一种蛋白酶切割，失活，使噬菌体转录。 需要删除酶将噬菌体的DNA从大肠杆菌染色体上删除下来，使之形成环形的DNA分子，恢复溶源周期开始时的状态。二、二、噬菌体载体噬菌体载体 phage48.5 kb in lengthLinear or circular genome (cos ends) 溶菌阶段溶菌阶段 ( (复制和释放复制和释放) ) 溶源阶段溶源阶段 ( (整合到寄主染色体上整合到寄主染色体上) )A W B

54、C D E F Z U V G H M L K I J b2 cI cro cII O P Q S R att int xis gam red cIII NCOS COS 头部基因头部基因 尾部基因尾部基因 功能不明区功能不明区 溶源化溶源化 重组重组 早期控制早期控制 阻遏阻遏 DNADNA合成合成 溶菌溶菌生长非必须区段生长非必须区段cI cI基因：溶源过程控制基因。基因：溶源过程控制基因。噬菌体的基因组结构噬菌体的基因组结构DNAProtein coatcoscosNonessential regionLong (left)armshort (right)armExogenous DNA

55、(20-23 kb) phage12bp5-CGGGGCGGCGACCTCG-33-GCCCCGCCGCTGGAGC-5 Cleavage Ligation(during packaging) (after infection) GGGCGGGCGACCTCG-35-CG + GC-53-GCCCCGCCGCTGGAThe phage cos endsCircular form Linear form Viruses that can infect bacteria. 48.5 kb in lengthLinear or circular genome (cos ends) phageLyti

56、c phase (Replicate and release)Lysogenic phase (integrate into host genome)噬菌体载体的主要类型噬菌体载体的主要类型 1. 插入式载体插入式载体 一种只具有一个可供外源一种只具有一个可供外源DNADNA插入的克隆位点的插入的克隆位点的 派生载体。派生载体。 2. 2. 替换型载体（取代型载体）替换型载体（取代型载体） 具有成对的克隆位点，在这具有成对的克隆位点，在这 两个位点之间的两个位点之间的DNA区段可以被外源插入的区段可以被外源插入的DNA片段所取代。片段所取代。 3. 3. 凯伦噬菌体载体凯伦噬菌体载体插入式载体

57、：插入式载体： 噬菌体载体相对于质粒载体来说，克隆片段较大，所以噬菌体载体相对于质粒载体来说，克隆片段较大，所以一般用于一般用于cDNAcDNA文库或基因组文库的构建。文库或基因组文库的构建。cI cI基因插入失活：如基因插入失活：如 gt10 gt10、NM1149NM1149等载体，在等载体，在cI cI基基因上有因上有EcoR IEcoR I及及Hind IIIHind III的酶切位点。外源基因插入后将的酶切位点。外源基因插入后将导致导致cI cI基因的失活。基因的失活。cI cI基因失活后将导致噬菌体不能溶原基因失活后将导致噬菌体不能溶原化，产生清晰的噬菌斑。相反，产生混浊的噬菌斑。

58、化，产生清晰的噬菌斑。相反，产生混浊的噬菌斑。 Lac ZLac Z基因插入失活：如基因插入失活：如charon16Acharon16A载体，在非必须区段载体，在非必须区段引入引入lac Zlac Z基因，在基因，在lac Zlac Z基因上有基因上有EcoR IEcoR I位点，插入失活后位点，插入失活后利用利用X-galX-gal法筛选（兰白筛选）。法筛选（兰白筛选）。 cIEcoR I LA 32.7RA10.6 gt 10 lac ZLA 19.9RA21.9EcoR I Charon 16A 替换型载体（取代型载体） 外源外源DNADNA取代噬菌体染色体中对于噬菌体取代噬菌体染色体中

59、对于噬菌体的感染和复制非必要的片段的感染和复制非必要的片段 ( 20 kb)( 20 kb) 高感染效率高感染效率 (10(109 9 转化株转化株/ug /ug 载体载体 DNA, DNA, 比质比质粒高粒高100-100-倍倍) )e.g. EMBL3, DASH替换式载体替换式载体 野生型噬菌体染色体的中段对于噬菌体的感染和复制是非必要的，外源DNA可以取代这一片段，例如Charon 4A、 EMBL 3/ 4、Charon40等载体，这些载体是用Lac 5（乳糖操纵子的大部分系列，包括完整的Lac Z）替换入噬菌体的中间区段，同时将Lac 5作为选择标记，使用时用EcoRI水解，去掉中

60、间的片段，再与欲克隆片段在体外进行重组、包装。而后，感染E.coli使之在E.coli内繁殖，并裂解E.coli，形成空斑。换型噬菌体是使用最广泛的载体。 Lac 5 EcoR I EcoR IEcoR I BanH I Sal I Sal I BamH I EcoR I MCS MCS Charon 4AEMBL3/4Charon 40替换型载体克隆外源替换型载体克隆外源DNADNA的步骤的步骤1. 应用适当的核酸内切酶消化载体， 除去可取代的DNA片段； 2. 将上述所得的 DNA载体臂同外源 DNA片段的连接； 3. 对重组体的DNA分子进行包装和增 殖，以得到有感染性的重组噬菌体 取代