胰岛素提取分离工艺

1、1.2 胰岛素提取分离工艺 1.2.1 胰脏低温保藏1.2.2 组织捣碎及细胞破碎1.2.3 提取 一 液固萃取分离法 二 固液分离方法1.2.4 纯化与精制 一 沉淀法 二 柱层析法 三 浓缩 四 结晶 五 干燥胰脏冷冻胰脏刨碎成片提取碱化、酸化减压浓缩去脂、盐析精制一、胰脏冷冻 胰脏在冻结状态下粉碎，有利于细胞膜的破裂使之提取完全，并可避免蛋白水解酶对胰岛素的破坏。二、胰脏刨碎成片 刨碎成片有利于与酸醇提取剂充分接触，增大提取率。三、提取1）pH为2.53.0（胰岛素在酸性条件下稳定）2）乙醇含量为70%左右。（在此浓度下，胰岛素溶解度比较大，过高会使胰岛素变性）3）温度为1315（低温，

2、保持胰岛素活性）四、碱化、酸化 提取液在不断搅拌下加入浓氨水调pH值到8.08.4（温度1315 ）立即进行过滤，除去碱性杂蛋白质，滤液应澄清，并及时用硫酸酸化至pH值到3.63.8.降温至5 静置4小时以上，使酸性杂蛋白充分沉淀。操作注意事项 去除杂碱性蛋白后应立即调溶液的pH值至酸性（在碱性条件下，胰岛素会散失活性，综合考虑去除杂蛋白的因素，故应立即调至酸性）五、减压浓缩 吸上层清液至真空蒸发器内，下层用帆布过滤，沉淀物弃去，滤液并入上清液。清液在30以下减压蒸去乙醇，浓缩至浓缩液比重为1.041.06（约为原来体积的1/91/10）为止。 在这步操作中，主要是用来缩小溶液的体积，浓缩至一

3、定的浓度，以便于下步的盐析操作。六、去脂、盐析 浓缩液转入去脂锅，5分钟内加热至50，立即用冰盐水降温至5，静置3-4小时，分离出下层清液（脂层可回收胰岛素）。调pH值至2.32.5，于2025在搅拌下加入27%（W/V）固体氯化钠，保温静置数小时，析出之物即为胰岛素粗品。 脂肪加热溶解，密度小，浮在上层液，迅速冷却将其去除七、精制1）第一次结晶获得较纯的胰岛素，等电点结晶法，离心分离2）第二次结晶结晶、离心，同上3）干燥 生物大分子制备得到所需的产品后，为了防止变质易于保存和运输，常需要干燥处理，最常用的方法是真空干燥和冷冻干燥，某些无活性核酸、微生物酶制剂和酪蛋白等产品则较多应用喷雾干燥、

4、气流干燥等直接干燥法。 干燥可获得普通胰岛素，含有25%的杂质，包括胰岛素原、胰岛素二聚体、胰多肽等，层析时有A、B、C三个峰，C峰才是胰岛素。4）柱层析 将结晶胰岛素经过凝胶过滤层析，胰岛素纯度达97%以上，此时在色谱图上仅占一个峰，故称单峰胰岛素。 经过凝胶过滤层析可获得单峰纯胰岛素，若将单峰胰岛素再用离子交换层析法进一步纯化，去除胰岛素原等杂质，使其纯度提高到99%以上。目前国内不能生产，尚依赖进口。其特点是：纯度高，副作用极少，生物效价高。5）锌沉淀 在收集液中加入4mol氨水调pH值至6.26.4，加入3.6%（V/V）的醋酸锌溶液（此溶液浓度为20%），在用4mol氨水调pH值至6

5、.0，低温放置过夜，离心得到沉淀。6）第三次结晶第三次等电点结晶，离心收集纯度高的胰岛素锌盐。7）干燥获得白色粉状胰岛素8）制剂 胰岛素口服液能受胃肠消化酶分解而失效，因而必须制成注射液：有胰岛素注射液、蛋白锌胰岛素注射液、精蛋白锌胰岛素注射液等。1.2.1 胰脏低温保藏1）冷却：使组织温度尽快降到04范围，而又不呈冷结状态，这种方法储藏的组织叫冷却组织 2）冷冻：为了达到长期保藏的目的，将胰脏进行深度冷冻，使组织中大部分水分冻结冰结晶，阻碍了微生物的活动或生物反应，从而增加了胰脏的储藏时间。这种方法保藏的胰脏叫冷冻胰脏。1.2.2 组织捣碎及细胞破碎-1.2.21、组织捣碎 目前工业生产中常

6、用的组织捣碎是通过机械破碎方法而实现的。例如通过刨削机、组织破碎机等机械设备。2、细胞破碎 有许多生物活性物质位于细胞内部，在细胞培养（或发酵）过程中不能分泌到细胞外的培养液（或发酵液）中。如青霉素酰化酶、碱性磷脂酶等胞内酶，必须在固液分离之前先将细胞破碎，使细胞内产物释放到液相中，然后再进行固液分离。1.2.3 提取一 液固萃取分离法二 固液分离方法一 液固萃取分离法（浸取）-见1.2.3 胰岛素可溶于稀酸、稀碱和稀醇溶液，但在组织中与其共存的糜蛋白酶对胰岛素有极高的水解活性，因而采用6.8%乙醇溶液并用草酸调溶液的pH为2.53.0，进行提取，这样就从三个方面抑制了糜蛋白酶的水解活性：6.8%的乙醇可以使糜蛋白酶暂时失活；草酸可以除