荧光定量PCR技术讲座

1、 CT LogX0与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，根据未知样品Ct值，就可以在标准曲线上计算出未知样品初始模板量。 该方法的前提条件是目的基因和内参基因的扩增效率相同且都为1，在试验开始前必须分别对目的基因和内参基因作标准曲线，看两者扩增效率的差别，假如两者扩增效率之间的差异小于0.1，就可以用该方法分析。而且在接下来的实验中，无需再做标准品。 该方法要求严格的重复，因为CT值的差异只要有很小的变化，测得的结果就会有很大的差别。 该方法特别适合于样品量不大，但是检测的基因种类很多的情况。 物一般都是引物TM值为60左右，探针的TM值为70左右。探针中GC含量的差异

2、对定量PCR反应效率的影响1 ATGAACTACG TTGGACAGTT AGCAGGGCAA GTGTTTGTAA CTGTGAAGGA GCTCTATAAG61 GGACTAAACC CAGCCACGCT GTCGGGATGT ATCGATATAA TTGTTGTACG TCAGCCAGAT121 GGGAATCTTC AGTGTTCTCC ATTCCATGTA CGCTTTGGGA AAATGGGAGT TCTGCGTTCC181 AGGGAGAAAG TGGTTGACAT AGAAATTAAT GGAGAGGCTG TAGATTTGCA CATGAAGCTA241 GGAGACAATG

3、 GAGAAGCCTT TTTCGTCCAG GAGATGGATA ACAATCAGGA GGTAATTCCT301 TATCATCTGT CTACGTCCCC CATCCTGTCT GAGGGAACTG CGTTAATGGA AGCTCAGCTG361 AAGAGAAACT CAATTGACAG GATAAGAAAC CTGGACAGCA GTGTATCTTC ACAAGTACCA421 CCCCAAGCTC ATGGATCCCA GCCTGGTACT GAAACATCTC CAGCCTGTAG CTCTGTGAAA481 AAGAGGAGGA AAAAGAGGAG GAAGTCTACC C

4、ACAAAATAG ACAGCTTAAA AAGAGAAGAC541 ATTGGAGATA CATCAGAAGA TGAAGACATG TTTCCTATAG AGATTAGCTC AGAGGAAGAA601 AAGGAACAAT TGGACAATTC AAGGATTCTT GTTCCAGATG TGTTTGTTGA TGAAGTATCT661 GATATAAAGG CTCCTGCTGT TTCTGCTTAT TCTCAGTCTT CATCTTACCC TCGTTCGGAT721 GGAGAATGGT CACCCATTCA AAGTAAGCCC ATAGATTACA CAGGGCAATC CTCTCTTCTC定量PCR反应体系普通PCR结果电泳图添加荧光基团后PCR结果电泳图优化后的Taqman探针体系实验结果，定量PCR实验方案定量PCR实验方案荧光染料法Taqman探针法双标准曲线法双标准曲线法定量PCR实验方案同一cDNA样品的三个重复通过定量PCR检测，测得该阴