二、 蛋白质的三维结构

1、l第一节第一节 蛋白质概述蛋白质概述l第二节第二节 蛋白质的构成单位蛋白质的构成单位- -氨基酸氨基酸l第三节第三节 肽肽l第四节第四节 蛋白质的结构蛋白质的结构l第五节第五节 蛋白质的性质蛋白质的性质l第六节第六节 蛋白质的分离与纯化蛋白质的分离与纯化蛋白质存在于所有的生物细胞中，是蛋白质存在于所有的生物细胞中，是构成生物体最基本的结构物质构成生物体最基本的结构物质蛋白质是生命活动的物质基础，它参蛋白质是生命活动的物质基础，它参与了几乎所有的生命活动过程与了几乎所有的生命活动过程, ,是生是生命活动最基本的功能物质命活动最基本的功能物质第一节第一节 概概 述述二、蛋白质的功能二、蛋白质的功能

2、催化功能催化功能激素功能激素功能运动功能运动功能运输功能运输功能 免疫功能免疫功能一、蛋白质的定义一、蛋白质的定义由氨基酸以肽键相连而成的生物大分子化合物由氨基酸以肽键相连而成的生物大分子化合物三、三、 蛋白质的分类蛋白质的分类1 1、球状蛋白质、球状蛋白质2 2、纤维状蛋白质、纤维状蛋白质：又分为：又分为可溶性纤维状可溶性纤维状蛋白质和不溶性纤维状蛋白质蛋白质和不溶性纤维状蛋白质。（一）（一） 据蛋白质的外形分类据蛋白质的外形分类1 1、简单蛋白、简单蛋白：只含由：只含由 - -氨基酸组成的肽链。氨基酸组成的肽链。l清蛋白和球蛋白清蛋白和球蛋白：广泛存在于动物组织广泛存在于动物组织中。中。l

3、谷蛋白和醇溶谷蛋白：植物蛋白。谷蛋白和醇溶谷蛋白：植物蛋白。l精蛋白和组蛋白：碱性蛋白质，存在与精蛋白和组蛋白：碱性蛋白质，存在与细胞核中。细胞核中。l硬蛋白：分角蛋白、胶原蛋白、弹性蛋硬蛋白：分角蛋白、胶原蛋白、弹性蛋白和丝蛋白。白和丝蛋白。 色蛋白：如血红蛋白、叶绿蛋白和细胞色色蛋白：如血红蛋白、叶绿蛋白和细胞色素等。素等。 糖蛋白：如细胞膜中的糖蛋白等。糖蛋白：如细胞膜中的糖蛋白等。 脂蛋白：如血清脂蛋白：如血清 - -， - -脂蛋白等。脂蛋白等。 核蛋白：如细胞核中的核糖核蛋白等。核蛋白：如细胞核中的核糖核蛋白等。2 2、结合蛋白：由简单蛋白与其它非蛋白成、结合蛋白：由简单蛋白与其它

4、非蛋白成分结合而成。分结合而成。1 1、蛋白质化学组成、蛋白质化学组成 碳碳 5050l 氢氢 7 7l 氧氧 2323l 氮氮 16%16%l 硫硫 0303l 其他其他 微微 量量蛋白质含量（蛋白质含量（% %）= =每克生物样品中含氮每克生物样品中含氮 的克数的克数 6.25 6.25一、氨基酸的结构一、氨基酸的结构1、 -氨基酸定义氨基酸定义氨基酸分子中与羧基相邻的位碳上连着一个氨基氨基酸分子中与羧基相邻的位碳上连着一个氨基氨基酸的简写符号氨基酸的简写符号2、 -氨基酸通式氨基酸通式l按按R基团的极性分：基团的极性分：据据pH=7时，时，R基团的带电性基团的带电性 二、氨基酸的分类二、

5、氨基酸的分类1、非极性氨基酸、非极性氨基酸:丙缬异亮脯苯色蛋丙缬异亮脯苯色蛋2、极性不带电荷氨基酸：、极性不带电荷氨基酸：甘丝苏半酪天谷甘丝苏半酪天谷3、极性带负电荷氨基酸、极性带负电荷氨基酸(酸性氨基酸酸性氨基酸)：天谷天谷4、极性带正电荷氨基酸、极性带正电荷氨基酸(碱性氨基酸碱性氨基酸)：赖精组赖精组1、非极性氨基酸、非极性氨基酸:丙缬异亮脯苯色蛋丙缬异亮脯苯色蛋2、极性不带电荷氨基酸：、极性不带电荷氨基酸：甘丝苏半酪天谷甘丝苏半酪天谷3、带负电荷氨基酸：、带负电荷氨基酸：天谷天谷4、带正电荷氨基酸：、带正电荷氨基酸：赖精组赖精组 除甘氨酸外，氨基酸均含有一个手性除甘氨酸外，氨基酸均含有一

6、个手性 - -碳原子，因此都具有旋光性碳原子，因此都具有旋光性。 判断判断D、L构型的方法构型的方法构成蛋白质的构成蛋白质的2020种氨基酸在近紫外区种氨基酸在近紫外区(220-300nm) (220-300nm) 只有酪氨酸（只有酪氨酸（275nm)275nm)、苯、苯丙氨酸丙氨酸(257nm)(257nm)和色氨酸和色氨酸(280nm)(280nm)有吸光有吸光能力。能力。 氨基酸在结晶形态或在水溶液中，离解成两性离子。氨基酸在结晶形态或在水溶液中，离解成两性离子。不同的不同的pHpH下，两性离子的状态下，两性离子的状态: :COO-CHH3N+R-pK1+H+H+COOHC HH3N+R

7、H+H+pK2-COO-CHH2NR pH = 1 7 10净电荷净电荷 +1 0 -1 正离子正离子 两性离子等电点两性离子等电点PI 负离子负离子 pH 小小 大大l 氨基酸的等电点（氨基酸的等电点（pIpI）：）： 当溶液浓当溶液浓度为某一度为某一pHpH值时，氨基酸分子中所含值时，氨基酸分子中所含的的-NH-NH3 3+ +和和-COO-COO- -数目正好相等，净电数目正好相等，净电荷为荷为0 0时的时的pHpH值。值。 2) 酸性氨基酸：酸性氨基酸：pI = (pK1 + pKR-COO- )/2 (Glu)中性氨基酸中性氨基酸:pI = (pK1 + pK2 )/23) 碱性氨基

8、酸：碱性氨基酸：pI = (pK2 + pKR-NH2 )/2His一、概念一、概念一个氨基酸的氨基与另一个氨基酸的羧基之间失一个氨基酸的氨基与另一个氨基酸的羧基之间失水形成的酰胺键称肽键，所形成的化合物称肽水形成的酰胺键称肽键，所形成的化合物称肽。CCNCCNCCNCCNCCH2CHCH2CH2CH2COO-OHCO2HCH2CONH2OHCH3H3N+OOOOHHHHHHHHHSerValTyrAspGlnCH3N-端C-端肽键SVYDQ二、肽的命名二、肽的命名二肽：由两个氨基酸组成的肽二肽：由两个氨基酸组成的肽三肽三肽寡多肽：寡多肽：多肽：由多肽：由10个以上氨基酸组成的肽。组个以上氨基

9、酸组成的肽。组成多肽的氨基酸单元称为氨基酸残基。成多肽的氨基酸单元称为氨基酸残基。 1 1、参与肽键形成的、参与肽键形成的2 2个原子和另外个原子和另外4 4个取代成员：个取代成员：羰基碳原子、酰胺氢原子以及羰基碳原子、酰胺氢原子以及2 2个相邻的个相邻的 碳原子碳原子构成一个肽单位，肽单位的构成一个肽单位，肽单位的6 6个原子处于同一平个原子处于同一平面。面。 2 2、肽键中的、肽键中的C-NC-N键具有部分双键性质，不键具有部分双键性质，不能自由旋转。能自由旋转。（一）定义：蛋白质的一级结构就是其共价（一）定义：蛋白质的一级结构就是其共价主链的氨基酸顺序主链的氨基酸顺序1 1、 多肽链的拆

10、分多肽链的拆分2、确定多肽链的数目确定多肽链的数目 通过测定末端氨基酸残基的摩尔数与蛋白通过测定末端氨基酸残基的摩尔数与蛋白质分子量之间的关系来确定质分子量之间的关系来确定3 3、二硫键的断裂、二硫键的断裂4 4、测定每条多肽链的氨基酸组成，并计、测定每条多肽链的氨基酸组成，并计算出氨基酸成分的分子比算出氨基酸成分的分子比5 5、分析多肽链的、分析多肽链的N-N-末端和末端和C-C-末端末端末端氨基酸测定方法末端氨基酸测定方法(1)(1)二硝基氟苯（二硝基氟苯（FDNBFDNB）法（）法（SangerSanger法）法） FDNB:Sanger试剂试剂黄色黄色(2)(2)丹磺酰氯丹磺酰氯(DN

11、S)(DNS)法法: :更敏感更敏感(3)(3)苯异硫氰酸酯苯异硫氰酸酯(PITC)(PITC)法法: :可用于测序可用于测序(4)(4)氨肽酶法氨肽酶法: :不太稳定不太稳定(5)(5)羧肽酶法羧肽酶法: :可用于短序列测序可用于短序列测序6 6、多肽链断裂成多个肽段，并将其分离开、多肽链断裂成多个肽段，并将其分离开（1 1） 化学法化学法 溴化氰水解法，它能选择性地切割由溴化氰水解法，它能选择性地切割由甲硫氨酸甲硫氨酸的的羧基所形成的肽键羧基所形成的肽键NHCHCOR4NHCHCOR3NHCHCOR2NHCHCOR1水解位点水解位点1 1）胰蛋白酶）胰蛋白酶R R1 1= =赖氨酸（赖氨酸

12、（LysLys）、精氨酸（）、精氨酸（ArgArg）侧链）侧链（2 2）酶法）酶法NHCHCOR4NHCHCOR3NHCHCOR2NHCHCOR1水解位点水解位点2) 糜蛋白酶糜蛋白酶( (胰凝乳蛋白酶胰凝乳蛋白酶) )R R1 1= =苯丙氨酸（苯丙氨酸（PhePhe）、色氨酸（）、色氨酸（TrpTrp）、酪氨酸（）、酪氨酸（TyrTyr）NHCHCOR4NHCHCOR3NHCHCOR2NHCHCOR1水解位点水解位点3) 胃蛋白酶胃蛋白酶R R2 2R R1 1= =苯丙氨酸（苯丙氨酸（PhePhe）、色氨酸（）、色氨酸（TrpTrp）、）、酪氨酸（酪氨酸（TyrTyr）NCSNHCHCO

13、R2NCHCOR1HHNHS:CCHCOR1HNNHCHCOR2NCOCHNHSCR17 7、测定每个肽段的氨基酸顺序、测定每个肽段的氨基酸顺序EdmanEdman（苯异硫氰酸酯法，（苯异硫氰酸酯法，PITCPITC）分析法）分析法SNHCNHOCR1CHNH2CHCOR2+偶联反应偶联反应环化断裂反应环化断裂反应转化反应转化反应PTC-PTC-肽肽ATZATZPTH-PTH-氨基酸氨基酸268 nm268 nm8 8、确定肽段在多肽链中的次序、确定肽段在多肽链中的次序例例1 1、 利用下面给出的信息确定多肽的序列利用下面给出的信息确定多肽的序列酸水解得酸水解得Ala,Arg,Leu,Met,

14、Phe,Thr,2ValAla,Arg,Leu,Met,Phe,Thr,2Val。SangerSanger试剂处理得试剂处理得 DNP-AlaDNP-Ala。胰蛋白酶处理得胰蛋白酶处理得Ala ,Arg, ThrAla ,Arg, Thr和和Leu,Met,Phe, Leu,Met,Phe, 2Val2Val；当以；当以SangerSanger试剂处理时分别得到试剂处理时分别得到DNP-Ala DNP-Ala 和和DNP-ValDNP-Val。1)1) 溴化氰处理得溴化氰处理得Ala Ala 、ArgArg、高丝氨酸内酯、高丝氨酸内酯、ThrThr、2Val2Val和和LeuLeu、 PheP

15、he；当用；当用SangerSanger试剂处理时，分别试剂处理时，分别得和得和DNP-Ala DNP-Ala 和和DNP-LeuDNP-Leu。指肽链主链在空间的排列指肽链主链在空间的排列, ,或规则的几何走或规则的几何走向、旋转及折叠。只涉及肽链主链的构象向、旋转及折叠。只涉及肽链主链的构象及链内或链间形成的氢键。及链内或链间形成的氢键。主要有主要有 - -螺旋、螺旋、 - -折叠、折叠、 - -转角。转角。-螺旋中每个残基的成螺旋中每个残基的成对二面角各取同一数值，对二面角各取同一数值，形成具有周期性规则的构形成具有周期性规则的构象。每圈螺旋占象。每圈螺旋占3.63.6个氨个氨基酸残基，

16、每个残基绕轴基酸残基，每个残基绕轴旋转旋转100100. -. -螺旋氨基螺旋氨基酸残基的侧链伸向外侧，酸残基的侧链伸向外侧，相邻螺圈之间形成链内氢相邻螺圈之间形成链内氢键，其取向几乎与中心轴键，其取向几乎与中心轴平行。平行。 l由两条或多条几乎完全伸展的肽链平行排列，通由两条或多条几乎完全伸展的肽链平行排列，通过链间的氢键交联而形成的。肽链的主链呈锯齿过链间的氢键交联而形成的。肽链的主链呈锯齿状折叠构象状折叠构象 平行式平行式反平行反平行式。式。l弯曲处的第一个氨弯曲处的第一个氨基酸残基的基酸残基的 -C=O -C=O 和第四个残基的和第四个残基的 N-H N-H 之间形成氢键，之间形成氢键

17、，形成一个不很稳定形成一个不很稳定的环状结构。的环状结构。l - -角蛋白的伸缩性能很好，当角蛋白的伸缩性能很好，当 - -角蛋白被角蛋白被过度拉伸时，则氢键被破坏而不能复原。过度拉伸时，则氢键被破坏而不能复原。此时此时 - -角蛋白转变成角蛋白转变成 - -折叠结构，称为折叠结构，称为 - -角蛋白。角蛋白。l 角蛋白在湿热条件下可以伸展转变为角蛋白在湿热条件下可以伸展转变为 构象，但在冷却干燥时又可自发地形成构象，但在冷却干燥时又可自发地形成 螺旋。螺旋。 l 丝心蛋白具有抗张强度高，质地柔软的丝心蛋白具有抗张强度高，质地柔软的特性，但不能拉伸。丝蛋白是由伸展的肽链特性，但不能拉伸。丝蛋白

18、是由伸展的肽链沿纤维轴平行排列成反向沿纤维轴平行排列成反向 - -折叠结构。折叠结构。分子中不含分子中不含 - -螺旋。丝蛋白的肽链通常是由多个螺旋。丝蛋白的肽链通常是由多个六肽单元重复而成。这六肽的氨基酸顺序为：六肽单元重复而成。这六肽的氨基酸顺序为：- -（Gly-Ser-Gly-Ala-Gly-AlaGly-Ser-Gly-Ala-Gly-Ala）n n- -基元基元(motif):(motif):在蛋白质中由若干相邻的二在蛋白质中由若干相邻的二级结构组合在一起，彼此相互作用，形成级结构组合在一起，彼此相互作用，形成有规则、在空间上能辨认的二级结构组合有规则、在空间上能辨认的二级结构组合

19、体。体。 主要有三种主要有三种: :、 、l三级结构的单位三级结构的单位- -结构域结构域 在三级结构内分立的、独立折叠的球在三级结构内分立的、独立折叠的球状单位称为结构域，它是由几个基元状单位称为结构域，它是由几个基元组成的，这些基元通常在一级结构中组成的，这些基元通常在一级结构中是相邻的。典型的结构构域都具有特是相邻的。典型的结构构域都具有特殊的功能。殊的功能。l在二级结构基础上，肽链的不同区段的在二级结构基础上，肽链的不同区段的侧链基团相互作用在空间进一步盘绕、侧链基团相互作用在空间进一步盘绕、折叠形成的包括主链和侧链构象在内的折叠形成的包括主链和侧链构象在内的特征三维结构。特征三维结构

20、。 l维系这种特定结构的力主要：有氢键、维系这种特定结构的力主要：有氢键、疏水键、离子键和范德华力等。疏水键、离子键和范德华力等。例子例子: :肌红蛋白肌红蛋白 由多条各自具有三级结构的肽链通过非共价由多条各自具有三级结构的肽链通过非共价键连接起来的结构形式键连接起来的结构形式.四级结构研究的是各个亚基在这些蛋白质中的四级结构研究的是各个亚基在这些蛋白质中的空间排列方式及亚基之间的相互作用关系）空间排列方式及亚基之间的相互作用关系）亚基亚基:在蛋白质分子中，最小的单位通常称在蛋白质分子中，最小的单位通常称为亚基或亚单位，它一般由一条肽链构成，为亚基或亚单位，它一般由一条肽链构成，无生理活性；维

21、持亚基之间的化学键主要无生理活性；维持亚基之间的化学键主要是疏水力。是疏水力。l 血红蛋白含有四条肽链，每一条肽链血红蛋白含有四条肽链，每一条肽链各与一个血红素相连接。血红素同肽链各与一个血红素相连接。血红素同肽链的连接是血红素的的连接是血红素的FeFe原子以配价键与肽原子以配价键与肽链分子中的组氨酸咪唑基的氮原子相连。链分子中的组氨酸咪唑基的氮原子相连。 l在在pH大于等电点的溶液中，蛋白质粒子带负大于等电点的溶液中，蛋白质粒子带负电荷，在电场中向正极移动；在电荷，在电场中向正极移动；在pH小于等电小于等电点的溶液中，蛋白质粒子带正电荷，在电场中点的溶液中，蛋白质粒子带正电荷，在电场中向负极

22、移动。向负极移动。l在外加电场下，不处于等电点的蛋白质分子向在外加电场下，不处于等电点的蛋白质分子向与其电性相反的电极移动，这种现象称为蛋白与其电性相反的电极移动，这种现象称为蛋白质电泳。质电泳。l蛋白质在等电点蛋白质在等电点pH条件下，不发生电泳现象条件下，不发生电泳现象蛋白质的分子量很大，在水中能够形成胶蛋白质的分子量很大，在水中能够形成胶体溶液。蛋白质溶液具有丁达尔现象、布体溶液。蛋白质溶液具有丁达尔现象、布郎运动等胶体溶液的性质。郎运动等胶体溶液的性质。在沉淀过程中，结构和性质都没有发生变在沉淀过程中，结构和性质都没有发生变化，在适当的条件下，可以重新溶解形成化，在适当的条件下，可以重

23、新溶解形成溶液，所以又称为非变性沉淀。溶液，所以又称为非变性沉淀。由于沉淀过程发生了蛋白质的结构和性质的由于沉淀过程发生了蛋白质的结构和性质的变化，所以又称为变性沉淀。如加热沉淀、变化，所以又称为变性沉淀。如加热沉淀、强酸碱沉淀、重金属盐沉淀和生物碱沉淀等强酸碱沉淀、重金属盐沉淀和生物碱沉淀等蛋白质的变性蛋白质的变性：某些物理或化学因素，能够破：某些物理或化学因素，能够破坏蛋白质的结构状态，引起蛋白质理化性质改坏蛋白质的结构状态，引起蛋白质理化性质改变并导致其生理活性丧失。变并导致其生理活性丧失。引起变性的主要因素是热、紫外光、激烈的搅引起变性的主要因素是热、紫外光、激烈的搅拌以及强酸和强碱等

24、。拌以及强酸和强碱等。大多数蛋白质在大多数蛋白质在280nm 280nm 附近显示强的吸收。附近显示强的吸收。1 1、生物组织的破碎。常用的方法有研、生物组织的破碎。常用的方法有研磨法、超声波法、冻融法和酶解法等。磨法、超声波法、冻融法和酶解法等。2 2、选择不同的溶剂进行抽提。、选择不同的溶剂进行抽提。3 3、粗提、粗提: : 可通过沉淀法、超滤法、萃取法可通过沉淀法、超滤法、萃取法等处理，得到蛋白质粗制品。等处理，得到蛋白质粗制品。4 4、精制：用层析法、电泳法等进行精制。、精制：用层析法、电泳法等进行精制。5 5、成品加工：测定蛋白质的性质并干燥成、成品加工：测定蛋白质的性质并干燥成成品

25、。成品。（一）沉淀法（一）沉淀法可通过可逆沉淀法将蛋白质分离出来。可通过可逆沉淀法将蛋白质分离出来。蛋白质在高浓度的中性盐溶液中，由于水蛋白质在高浓度的中性盐溶液中，由于水化层被破坏和表面电荷被中和，容易发生化层被破坏和表面电荷被中和，容易发生沉淀。常用的盐为硫酸铵。沉淀。常用的盐为硫酸铵。 在蛋白质溶液中，加入一定量的与水互溶在蛋白质溶液中，加入一定量的与水互溶的有机溶剂，由于这些溶剂与水的亲和力强，的有机溶剂，由于这些溶剂与水的亲和力强，能够破坏蛋白质的水化层，使蛋白质的溶解度能够破坏蛋白质的水化层，使蛋白质的溶解度降低而沉淀。降低而沉淀。蛋白质分子在等电点时，净电荷为零，分蛋白质分子在等

26、电点时，净电荷为零，分子之间的静电排斥力最小，容易聚集形成子之间的静电排斥力最小，容易聚集形成沉淀。该法适用于在等电点沉淀。该法适用于在等电点pHpH稳定的蛋白稳定的蛋白质。质。1、离子交换层析法离子交换层析法（二）层析法（二）层析法利用离子交换树脂作为柱层析支持物，将利用离子交换树脂作为柱层析支持物，将带有不同电荷的蛋白质进行分离的方法。带有不同电荷的蛋白质进行分离的方法。根据可交换的离子可分为：阳离子交换树脂和阴离子交根据可交换的离子可分为：阳离子交换树脂和阴离子交换树脂换树脂对于阳离子交换树脂对于阳离子交换树脂,带正电荷多的蛋白质与树脂结合较带正电荷多的蛋白质与树脂结合较强，而带正电荷少的蛋白质与树脂结合则较弱。用不同浓强，而带正电荷少的蛋白质与树脂结合则较弱。用不同浓度的阳离子洗脱液，如度的阳离子洗脱液，如NaCl溶液进行梯度洗脱，通过溶液进行梯度洗脱，通过Na+的离子交换作用，可以将带有不同正电荷的蛋白质进行分的离子交换作用，可以将带有不同正电荷的蛋白质进行分离。离。2、凝胶过滤层析凝胶过滤层析分子筛层析）分子筛层析）凝胶过滤所用的介质是由交