第八章培养基灭菌

1、LOGO第八章第八章 培养基灭菌培养基灭菌 在深层、通风的发酵罐中进行绝对无杂菌的纯培养发酵，是在深层、通风的发酵罐中进行绝对无杂菌的纯培养发酵，是生化工程所特有的问题。从防止污染的工艺观点看，生化工程工生化工程所特有的问题。从防止污染的工艺观点看，生化工程工作者所作出的最重要的贡献可能就是在发酵罐及与之有关的管道作者所作出的最重要的贡献可能就是在发酵罐及与之有关的管道网的设计与操作中推行和发展了无菌技术。网的设计与操作中推行和发展了无菌技术。 本章首先概述培养基灭菌的意义与方法，然后对培养基湿热本章首先概述培养基灭菌的意义与方法，然后对培养基湿热灭菌的原理及工程计算加以阐述。灭菌的原理及工程

2、计算加以阐述。 重点：掌握培养基蒸汽加热灭菌的原理与计算，了解空气过重点：掌握培养基蒸汽加热灭菌的原理与计算，了解空气过滤除菌的机制和过滤器的设计计算。滤除菌的机制和过滤器的设计计算。第一节第一节 概概 述述v 微生物是无孔不入、无处不在的，但在自然界却很难找到微生物是无孔不入、无处不在的，但在自然界却很难找到纯培养状态下生长的微生物。自从发酵工业利用纯培养技纯培养状态下生长的微生物。自从发酵工业利用纯培养技术以来，许多发酵过程特别是抗生素、氨基酸等新型发酵术以来，许多发酵过程特别是抗生素、氨基酸等新型发酵工业都要求纯种培养，即在培养期间除大量繁殖生产菌外，工业都要求纯种培养，即在培养期间除大

3、量繁殖生产菌外，不允许其它任何微生物不允许其它任何微生物(统称为杂菌统称为杂菌)存在。存在。v 在培养过程中在培养过程中(特别是种子扩大培养阶段和发酵前期特别是种子扩大培养阶段和发酵前期)如有如有少数杂菌存在，它们便可在极短时间内迅速繁殖与生产菌少数杂菌存在，它们便可在极短时间内迅速繁殖与生产菌争夺养分，从而干扰生产菌正常发酵，甚至造成倒罐。争夺养分，从而干扰生产菌正常发酵，甚至造成倒罐。v 为了保证发酵过程不感染杂菌，除要求设备密封及严格无为了保证发酵过程不感染杂菌，除要求设备密封及严格无菌操作外，灭菌和消毒就成为生产或实验成败的关键问题。菌操作外，灭菌和消毒就成为生产或实验成败的关键问题。

4、在工作中所用的仪器、培养基、发酵罐、管路、空气等必在工作中所用的仪器、培养基、发酵罐、管路、空气等必须进行严格的灭菌，还要对生产环境进行消毒，以保证生须进行严格的灭菌，还要对生产环境进行消毒，以保证生产菌旺盛生长，防止杂菌和噬菌体的污染。产菌旺盛生长，防止杂菌和噬菌体的污染。 v 所谓灭菌所谓灭菌(Sterilization)指的是用物理或化学因子除去物品指的是用物理或化学因子除去物品上所有生活微生物的方法，而只消除病原微生物的措施则上所有生活微生物的方法，而只消除病原微生物的措施则是消毒，一般都笼统地称为杀菌或灭菌。培养基及设备灭是消毒，一般都笼统地称为杀菌或灭菌。培养基及设备灭菌的方法有许

5、多种，如加热灭菌、射线灭菌和化学药剂灭菌的方法有许多种，如加热灭菌、射线灭菌和化学药剂灭菌等。菌等。1、加热灭菌、加热灭菌v 微生物细胞由蛋白质组成，加热可导致蛋白质变性，从而微生物细胞由蛋白质组成，加热可导致蛋白质变性，从而达到消灭微生物的目的。微生物对高温的敏感性大于对低达到消灭微生物的目的。微生物对高温的敏感性大于对低温的敏感性，所以采用高温灭菌是一种有效的灭菌方法。温的敏感性，所以采用高温灭菌是一种有效的灭菌方法。v (1)火焰灭菌：利用火焰直接将微生物烧死，是一种比较彻火焰灭菌：利用火焰直接将微生物烧死，是一种比较彻底、迅速而简单的加热灭菌法。但它只限于接种针、玻璃底、迅速而简单的加

6、热灭菌法。但它只限于接种针、玻璃棒、试管口、三角瓶口及接种管口等的灭菌，只是在接种棒、试管口、三角瓶口及接种管口等的灭菌，只是在接种时使用。时使用。v (2)干热灭菌：利用电热或红外线在一定设备内加热到一定温干热灭菌：利用电热或红外线在一定设备内加热到一定温度把微生物杀死，一般用于不宜直接用火焰灭菌、要求杀菌度把微生物杀死，一般用于不宜直接用火焰灭菌、要求杀菌后保持干燥状态的物料的灭菌。干热灭菌必须采用高温，常后保持干燥状态的物料的灭菌。干热灭菌必须采用高温，常在在160170维持维持12h。v (3)湿热灭菌：按被灭菌物品的性质不同，选择各种不同温度湿热灭菌：按被灭菌物品的性质不同，选择各种

7、不同温度的蒸汽进行灭菌。由于细胞原生质在含水量高的情况下易变的蒸汽进行灭菌。由于细胞原生质在含水量高的情况下易变性凝固，而且蒸汽的穿透力强，所以在同样温度下，湿热灭性凝固，而且蒸汽的穿透力强，所以在同样温度下，湿热灭菌比干热灭菌效果要好，加之蒸汽来源容易，因而此法在工菌比干热灭菌效果要好，加之蒸汽来源容易，因而此法在工业生产上广泛使用。业生产上广泛使用。 2、射线灭菌、射线灭菌v 通常使用紫外线、高速电子流的阴极射线、通常使用紫外线、高速电子流的阴极射线、X射线和射线和射线等，以射线等，以紫外线最常用。紫外线的特点是对芽孢和营养细胞都能起作用，紫外线最常用。紫外线的特点是对芽孢和营养细胞都能起

8、作用，但细菌芽孢和霉菌孢子对其抵抗力较大，且紫外线穿透力极低，但细菌芽孢和霉菌孢子对其抵抗力较大，且紫外线穿透力极低，所以只能用于表面灭菌，对固体物质灭菌不彻底。一般无菌室、所以只能用于表面灭菌，对固体物质灭菌不彻底。一般无菌室、无菌箱和摇瓶间等可采用无菌箱和摇瓶间等可采用30W紫外线灯照射紫外线灯照射2030min，以波长以波长260nm左右灭菌效力最好。左右灭菌效力最好。3、化学药剂灭菌、化学药剂灭菌 消毒剂或防腐剂的种类很多，常用的有以下几种：消毒剂或防腐剂的种类很多，常用的有以下几种：v (1)0.10.25%KMnO4溶液：用于皮肤、水果、饮具的消毒。溶液：用于皮肤、水果、饮具的消毒

9、。v (2)0.51%漂白粉溶液：用于用具和车间环境灭菌。漂白粉溶液：用于用具和车间环境灭菌。v (3)75%酒精溶液：用于皮肤和玻璃器皿表面灭菌。酒精溶液：用于皮肤和玻璃器皿表面灭菌。v (4)0.25%新洁尔溶液：用于皮肤和小器皿表面消毒及环境消毒。新洁尔溶液：用于皮肤和小器皿表面消毒及环境消毒。 v (5)10%甲醛溶液：用于无菌室、摇瓶间、空罐和车间的熏蒸消甲醛溶液：用于无菌室、摇瓶间、空罐和车间的熏蒸消毒，一般每毒，一般每m3空间使用空间使用3740%甲醛甲醛10mL。v (6)苯酚溶液：苯酚溶液：25%的苯酚的苯酚(石碳酸石碳酸)溶液用于器械及车间环境溶液用于器械及车间环境的喷雾消

10、毒，的喷雾消毒，0.5%的溶液为防腐剂。的溶液为防腐剂。v (7)来苏尔：是甲醛与肥皂的混合液，常用来苏尔：是甲醛与肥皂的混合液，常用25%的溶液来消毒的溶液来消毒皮肤、桌面及用具等，对皮肤刺激性比石碳酸小。皮肤、桌面及用具等，对皮肤刺激性比石碳酸小。 1.1.化学试剂灭菌法化学试剂灭菌法 甲醛、乙醇或新洁尔灭、高锰酸钾等甲醛、乙醇或新洁尔灭、高锰酸钾等 适用范围：环境、皮肤及器械的表面消毒适用范围：环境、皮肤及器械的表面消毒2.2.射线灭菌射线灭菌法法3.3.干热灭菌法干热灭菌法 电磁波、紫外线或放射性物质电磁波、紫外线或放射性物质适用范围：无菌室、接种箱适用范围：无菌室、接种箱常用烘箱，灭

11、菌条件：常用烘箱，灭菌条件：160160下保温下保温1h 1h 适用范围：金属或玻璃器皿适用范围：金属或玻璃器皿4.4.湿热灭菌法湿热灭菌法 利用饱和蒸汽灭菌，条件：利用饱和蒸汽灭菌，条件：121121，30min 30min 适用范围：生产设备及培养基灭菌适用范围：生产设备及培养基灭菌5.5.过滤除菌法过滤除菌法 利用过滤方法阻留微生物利用过滤方法阻留微生物 适用范围：制备无菌空气适用范围：制备无菌空气 6.6.火焰灭菌法火焰灭菌法 火焰火焰 适用范围：接种针、玻璃棒、三角瓶口适用范围：接种针、玻璃棒、三角瓶口 v 谷氨酸棒状杆菌的培养液常采用的灭菌方法是（谷氨酸棒状杆菌的培养液常采用的灭菌

12、方法是（ ）A A高压蒸汽灭菌高压蒸汽灭菌B B高温灭菌高温灭菌C C加入抗生素灭菌加入抗生素灭菌D D酒精灭菌酒精灭菌消毒（消毒（disinfectiondisinfection）与灭菌（）与灭菌（sterilizationsterilization）的区别？）的区别？ 消毒是指用物理或化学方法杀死物料、容器、器具内外的病消毒是指用物理或化学方法杀死物料、容器、器具内外的病原微生物。原微生物。一般只能杀死营养细胞而不能杀死细菌芽孢一般只能杀死营养细胞而不能杀死细菌芽孢。例如，。例如，巴氏消毒法，是将物料加热至巴氏消毒法，是将物料加热至6060维持维持30min30min，以杀死不耐高温，以杀

13、死不耐高温的微生物营养细胞。的微生物营养细胞。 灭菌是用物理或化学方法杀死或除去环境中所有微生物，包灭菌是用物理或化学方法杀死或除去环境中所有微生物，包括营养细胞、细菌芽孢和孢子。括营养细胞、细菌芽孢和孢子。 消毒不一定能达到灭菌要求，而灭菌则可达到消毒的目的。消毒不一定能达到灭菌要求，而灭菌则可达到消毒的目的。 培养基的湿热灭菌培养基的湿热灭菌 湿热灭菌原理湿热灭菌原理 灭菌条件灭菌条件灭菌不利方面灭菌不利方面蒸汽具有很强的穿透能力，而且在冷凝蒸汽具有很强的穿透能力，而且在冷凝时会放出大量的冷凝热，很容易使蛋白时会放出大量的冷凝热，很容易使蛋白质凝固而杀死各种微生物。质凝固而杀死各种微生物。

14、 121，30min。 同时会破坏培养基中的营养成分，甚同时会破坏培养基中的营养成分，甚至产生不利于菌体生长的物质至产生不利于菌体生长的物质。将配制好的培将配制好的培养基养基同时放在同时放在发酵罐或其他发酵罐或其他装置中，通入装置中，通入蒸汽将培养基蒸汽将培养基和所用设备一和所用设备一起进行加热灭起进行加热灭菌的过程，也菌的过程，也称实罐灭菌。称实罐灭菌。（一）间歇灭菌（一）间歇灭菌 （常用）（常用）培养基间歇灭菌过程培养基间歇灭菌过程中的温度变化情况中的温度变化情况24016012080时间（min)050100150温度升温冷却保温过程包括：过程包括：升温、保温和冷却升温、保温和冷却三阶段

15、。三阶段。各阶段对灭菌的各阶段对灭菌的贡献：贡献： 20%20%、75%75%、5%5%。蒸汽蒸汽（二）连续灭菌（又称连消）（二）连续灭菌（又称连消） 将培养基在发酵罐外通过连续灭菌装置进行将培养基在发酵罐外通过连续灭菌装置进行加热、保温和冷却而进行灭菌。加热、保温和冷却而进行灭菌。 发酵罐发酵罐蒸汽蒸汽冷却水冷却水无菌培养基无菌培养基配料罐配料罐泵泵加热塔加热塔维持罐维持罐冷却管冷却管连续灭菌的基本设备有哪些连续灭菌的基本设备有哪些 ？问题问题连续灭菌的流程与设备连续灭菌的流程与设备（1）配料预热罐，）配料预热罐，将配制好的料液预热将配制好的料液预热到到60 70 ，以免连以免连续灭菌时由于

16、料液与续灭菌时由于料液与蒸汽温度相差过大而蒸汽温度相差过大而产生产生水汽撞击声水汽撞击声；（2）连消塔，）连消塔，用高用高温蒸汽使料液温蒸汽使料液温度很温度很快升高到灭菌快升高到灭菌(126 132 ）；（3 3）维持罐，）维持罐，使料液在灭菌温度下保持使料液在灭菌温度下保持5 5 7min7min。因为：因为：连消塔加热的时间很短，光靠这段时间连消塔加热的时间很短，光靠这段时间的灭菌是不够的的灭菌是不够的；（4 4）冷却管，）冷却管，使料液使料液冷却到冷却到4040 50 50 后（冷水后（冷水喷淋）喷淋） ，输送到预先灭菌过的罐内。，输送到预先灭菌过的罐内。 连续灭菌过程中温度的变化连续灭

17、菌过程中温度的变化( (虚线虚线) ) 优优 点点缺缺 点点连连续续灭灭菌菌1.1.高温短时灭菌，培养基高温短时灭菌，培养基 营养成分损失少。营养成分损失少。2.2.发酵罐占用时间缩短，发酵罐占用时间缩短， 利用率高。利用率高。 1.1.设备复杂，操作麻烦设备复杂，操作麻烦, , 染菌机会多。染菌机会多。2.2.不适合含大量固体物不适合含大量固体物 料的灭菌。料的灭菌。间间歇歇灭灭菌菌1.1.设备要求低，不需另外设备要求低，不需另外 加热、冷却装置。加热、冷却装置。2.2.操作要求低，适合小批操作要求低，适合小批 量生产规模量生产规模3.3.适合含大量固体物料的适合含大量固体物料的 灭菌灭菌1

18、.1.培养基的营养物质损培养基的营养物质损 失大，灭菌后培养基失大，灭菌后培养基 质量下降质量下降2.2.发酵罐的利用率较低发酵罐的利用率较低3.3.不适合大规模生产的不适合大规模生产的 灭菌灭菌（三）间歇灭菌与连续灭菌的比较（三）间歇灭菌与连续灭菌的比较第二节第二节 加热灭菌的基本原理加热灭菌的基本原理v 灭菌的方法虽然很多，但对发酵工业中大量培养基和生产灭菌的方法虽然很多，但对发酵工业中大量培养基和生产设备的处理，目前广泛采用蒸汽加热的方法进行灭菌。实设备的处理，目前广泛采用蒸汽加热的方法进行灭菌。实际生产上，蒸汽较易获得，蒸汽温度高，冷凝时能放出大际生产上，蒸汽较易获得，蒸汽温度高，冷凝

19、时能放出大量的潜热，加速嗜热菌芽孢的死亡，操作控制也较方便，量的潜热，加速嗜热菌芽孢的死亡，操作控制也较方便，因而湿热蒸汽灭菌是一种简单而又经济有效的灭菌方法。因而湿热蒸汽灭菌是一种简单而又经济有效的灭菌方法。v 用湿热法处理培养基时，在微生物被杀死的同时，培养基用湿热法处理培养基时，在微生物被杀死的同时，培养基成分也受到一定的破坏。对于灭菌的要求是既要达到杀菌成分也受到一定的破坏。对于灭菌的要求是既要达到杀菌的目的，又要使培养基成分破坏尽可能减少到最低程度。的目的，又要使培养基成分破坏尽可能减少到最低程度。因此，因此，灭菌程度灭菌程度和和营养成分的破坏营养成分的破坏成为灭菌工作中的主要成为灭

20、菌工作中的主要矛盾，恰当掌握加热温度和受热时间是灭菌工作的关键。矛盾，恰当掌握加热温度和受热时间是灭菌工作的关键。 一、微生物的热阻一、微生物的热阻v 每一种微生物都有一定的生长温度范围。当微生物处在最每一种微生物都有一定的生长温度范围。当微生物处在最低限温度以下时，代谢作用几乎停止而处于休眠状态。相低限温度以下时，代谢作用几乎停止而处于休眠状态。相反，温度超过最高限度时，细胞中的原生质胶体和酶蛋白反，温度超过最高限度时，细胞中的原生质胶体和酶蛋白就发生不可逆的凝固变性，使微生物在一定时间内死亡。就发生不可逆的凝固变性，使微生物在一定时间内死亡。加热灭菌就是根据微生物的这个特点进行的。加热灭菌

21、就是根据微生物的这个特点进行的。v 杀死微生物的极限温度称为杀死微生物的极限温度称为致死温度致死温度。在致死温度下，杀。在致死温度下，杀死全部微生物所需要的时间称为死全部微生物所需要的时间称为致死时间致死时间。在致死温度以。在致死温度以上，温度愈高，致死时间愈短。营养细胞和细菌芽孢对热上，温度愈高，致死时间愈短。营养细胞和细菌芽孢对热的抵抗力不同。的抵抗力不同。微生物对热的抵抗力，常用微生物对热的抵抗力，常用“热阻热阻”表示。表示。热阻是指微生物在某一特定条件下的致死时间。热阻是指微生物在某一特定条件下的致死时间。二、微生物的热死原理二、微生物的热死原理对数残留定律对数残留定律v 在一定温度下

22、，微生物的受热死亡符合单分子反应动力学。在一定温度下，微生物的受热死亡符合单分子反应动力学。在灭菌过程中，活菌数逐渐减少，其减少量随残存活菌数在灭菌过程中，活菌数逐渐减少，其减少量随残存活菌数的减少而递减，即微生物热死亡速率与任一瞬间残存活菌的减少而递减，即微生物热死亡速率与任一瞬间残存活菌数成正比，这就是对数残留定律：数成正比，这就是对数残留定律： -dN/dt=KN 式中：式中： N残存活菌数残存活菌数；t灭菌时间灭菌时间(min)；K杀菌速率常数杀菌速率常数(min-1)，也称为反应速度常数，其大小与微生物的种类和也称为反应速度常数，其大小与微生物的种类和加热温度有关；加热温度有关；dN

23、/dt菌的瞬时变化率，即死亡速率。菌的瞬时变化率，即死亡速率。 v 将存活率将存活率 与灭菌时间与灭菌时间t t在半对数坐标纸上标绘可在半对数坐标纸上标绘可以得到直线。以得到直线。 NoN直线的斜率为直线的斜率为K K，K K值越大表示微生物越值越大表示微生物越容易死亡容易死亡。KtNoN 嗜热脂肪芽孢杆菌嗜热脂肪芽孢杆菌孢子的热死速率孢子的热死速率KtNoN K K（比热死亡速率常数）比热死亡速率常数）由两个因素决定由两个因素决定1 1、微生物的种类和存在方式、微生物的种类和存在方式2 2、灭菌温度、灭菌温度 在一定温度下，比热死亡速率常数在一定温度下，比热死亡速率常数K K随微生物种随微生

24、物种类不同而不同。例如，在类不同而不同。例如，在121121， 枯草芽胞杆菌枯草芽胞杆菌FS5230FS5230的的K K：0.0470.0470.063s0.063s-1-1； 梭状芽胞杆菌梭状芽胞杆菌PA3679PA3679的的K K：0.03 s0.03 s-1-1； 嗜热脂肪杆菌嗜热脂肪杆菌FS1518FS1518的的K K：0.013 s0.013 s-1-1。 v 在恒定温度下，将方程移项积分：在恒定温度下，将方程移项积分：v N0开始灭菌开始灭菌(t=0)时原有活菌数时原有活菌数(污染度污染度)；Ns经时间经时间t后后残存活菌数残存活菌数(灭菌度，一般要求灭菌度，一般要求Ns=1

25、0-3)；v 反应速度常数反应速度常数K是判断微生物受热死亡难易程度的基本依是判断微生物受热死亡难易程度的基本依据。各种微生物在同样温度下的据。各种微生物在同样温度下的K值不同，并受菌的生理值不同，并受菌的生理状态、生长条件及杀菌方法等多种因素的影响。状态、生长条件及杀菌方法等多种因素的影响。K值愈小，值愈小，则此微生物愈耐热则此微生物愈耐热。有时习惯上也有采用。有时习惯上也有采用1/10衰减时间衰减时间D(decimal reaction time)来表示的，来表示的，D值是活的微生物在受值是活的微生物在受热过程中减少到原来数目的热过程中减少到原来数目的1/10(N/N0=1/10)所需要的

26、时间。所需要的时间。D与与K成反比关系：成反比关系： 0012.303lnlgssNNtKNKN2.3032.303lg10DKKv 就各种微生物的热阻来说，细菌芽孢是较耐热的，孢子的就各种微生物的热阻来说，细菌芽孢是较耐热的，孢子的热阻要比生长期细胞大得多，即细菌芽孢的热阻要比生长期细胞大得多，即细菌芽孢的K K值比生长期值比生长期细胞和霉菌孢子小得多。故灭菌程度要以杀死细菌的芽孢细胞和霉菌孢子小得多。故灭菌程度要以杀死细菌的芽孢为准。但对细菌芽孢来说，并不始终符合对数残留定律，为准。但对细菌芽孢来说，并不始终符合对数残留定律，特别是在受热后很短的时间内。特别是在受热后很短的时间内。 三、温

27、度对杀菌速率常数三、温度对杀菌速率常数K的影响的影响v 微生物受热蛋白质变性而死亡，这种反应属于单分子反应微生物受热蛋白质变性而死亡，这种反应属于单分子反应型，所以温度对杀菌速率常数的影响可以用型，所以温度对杀菌速率常数的影响可以用阿累尼乌斯阿累尼乌斯(Arrhenius)方程方程表示：表示：v K=Ae-E/RT或或lnK=lnA-E/R1/T v K杀菌速率常数杀菌速率常数(min-1)；A频率因子频率因子(min-1)，因菌种不因菌种不同而异；同而异；E活化能活化能(J/mol)，其值愈大，微生物越易受热其值愈大，微生物越易受热死亡；死亡；T绝对温度绝对温度(K)，T(K)=t()+27

28、3.15；R气体常气体常数，等于数，等于8.36J/molK(或或1.98cal/molK)； 211211ln()KEKR TT四、影响培养基灭菌的因素四、影响培养基灭菌的因素1、营养成分的保持、营养成分的保持v 在培养液加热杀菌时，不仅杀死杂菌，培养基成分也受热在培养液加热杀菌时，不仅杀死杂菌，培养基成分也受热变化，尤其是维生素、氨基酸、葡萄糖等营养成分也会受变化，尤其是维生素、氨基酸、葡萄糖等营养成分也会受热破坏。所以在灭菌过程中，既要达到灭菌效果，又要考热破坏。所以在灭菌过程中，既要达到灭菌效果，又要考虑尽量减少营养成分的破坏。虑尽量减少营养成分的破坏。 v 培养基成分受热分解的反应也

29、是属于一级反应，符合对数培养基成分受热分解的反应也是属于一级反应，符合对数残留定律和阿氏方程：残留定律和阿氏方程： -dC/dt=KC K=Ae-E/RTv 式中：式中：K营养物破坏的反应速度常数营养物破坏的反应速度常数(min-1)；C营养营养物浓度物浓度(mol/L)；E营养物分解反应的活化能营养物分解反应的活化能(J/mol)v 在活化能大的反应中，反应在活化能大的反应中，反应速率随温度变化也大；反之，速率随温度变化也大；反之，如果某一反应的活化能非常如果某一反应的活化能非常小，那么该反应的速度随温小，那么该反应的速度随温度的变化也很小。所以当温度的变化也很小。所以当温度升高时，杂菌死亡

30、速度要度升高时，杂菌死亡速度要比营养成分破坏速度快得多。比营养成分破坏速度快得多。根据这一道理，培养基灭菌根据这一道理，培养基灭菌采用高温短时的方法，可以采用高温短时的方法，可以减少营养成分的破坏。养分减少营养成分的破坏。养分虽因温度增高破坏也增加，虽因温度增高破坏也增加，但因灭菌时间大为缩短，总但因灭菌时间大为缩短，总破坏量因之减少。破坏量因之减少。 灭菌温度灭菌温度()()灭菌时间灭菌时间( (min)min)VBVB1 1损失损失(%)(%)10010084384399.9999.9911011075758989115115151550501201207.67.627271301300.

31、8510.85110101401400.1070.1073 31501500.0150.0151 2、微生物的耐热性、微生物的耐热性v 无芽孢的细菌在无芽孢的细菌在60加热加热60min或或70加热加热5min即可杀死，即可杀死，霉菌孢子在霉菌孢子在8688加热加热3min也可杀死。但是有些细菌芽也可杀死。但是有些细菌芽孢的热阻较大，孢的热阻较大，100处理处理30min仍未杀死。仍未杀死。v 培养基中含有各种各样的微生物，不可能逐一地加以考虑。培养基中含有各种各样的微生物，不可能逐一地加以考虑。在灭菌计算中，如将全部微生物作为耐热的细菌芽孢来计在灭菌计算中，如将全部微生物作为耐热的细菌芽孢来

32、计算灭菌温度和时间，这样就势必加长加热时间和提高加热算灭菌温度和时间，这样就势必加长加热时间和提高加热温度。温度。v 灭菌所需要的时间取决于把活的细菌芽孢减少到所规定数灭菌所需要的时间取决于把活的细菌芽孢减少到所规定数目的时间。同时，由于一个细菌只能形成一个芽孢，故把目的时间。同时，由于一个细菌只能形成一个芽孢，故把培养基中原有芽孢细菌和细菌芽孢数之和作为计算依据较培养基中原有芽孢细菌和细菌芽孢数之和作为计算依据较为合理。为合理。 3 3、pHpH值值v pHpH值对微生物的耐热性影响很大，值对微生物的耐热性影响很大，pH=6.0pH=6.08.08.0时，微生物最时，微生物最不易死亡，不易死

33、亡，pHpH6.06.0时，时，H H+ +很易渗入微生物的细胞，从而改变很易渗入微生物的细胞，从而改变细胞的生理反应，促使其死亡。所以，培养基的细胞的生理反应，促使其死亡。所以，培养基的pHpH值愈低，值愈低，所需的灭菌时间也愈短。但一般情况下，微生物对培养基的所需的灭菌时间也愈短。但一般情况下，微生物对培养基的pHpH值都有一定的要求，在不允许调节值都有一定的要求，在不允许调节pHpH值的情况下，就要适值的情况下，就要适当考虑延长维持时间或提高灭菌温度。当考虑延长维持时间或提高灭菌温度。温度()孢子数(个/mL)灭菌时间(min)pH=6.15.35.04.74.512010,000875

34、3311510,000252512131311010,0007065353024100 10,4 4、培养基成分、培养基成分v 油脂、糖类及一定浓度的蛋白质会增加生物的耐热性。高浓油脂、糖类及一定浓度的蛋白质会增加生物的耐热性。高浓度的有机物会包于细胞周围，形成一层薄膜影响热的传入，度的有机物会包于细胞周围，形成一层薄膜影响热的传入，所以灭菌温度应较高。而高浓度的盐类所以灭菌温度应较高。而高浓度的盐类(8(810%10%以上以上) )、色素、色素则削弱其耐热性，故较易灭菌。例如，大肠杆菌在水中加热则削弱其耐热性，故较易灭菌。例如，大肠杆菌在水中加热至至60606565便死亡，在便死亡，在10%

35、10%糖液中需糖液中需7070加热加热4 46 6minmin才死亡，才死亡，在在30%30%糖液中需要糖液中需要3030minmin才死亡。才死亡。 5 5、泡沫、泡沫v 培养基中发生的泡沫对灭菌极为不利，因为泡沫中的空气形培养基中发生的泡沫对灭菌极为不利，因为泡沫中的空气形成隔热层，使热量难以渗透进去，杀死其中潜伏的微生物。成隔热层，使热量难以渗透进去，杀死其中潜伏的微生物。在分批灭菌中，对极易起泡的培养基必须予以很好的控制。在分批灭菌中，对极易起泡的培养基必须予以很好的控制。若产生泡沫要采取措施加以破坏，如可加入少量消泡剂。对若产生泡沫要采取措施加以破坏，如可加入少量消泡剂。对极易产生泡

36、沫的培养基，如采用连续灭菌的方法更应注意。极易产生泡沫的培养基，如采用连续灭菌的方法更应注意。6、颗粒、颗粒v 培养基中含的颗粒小，容易灭菌，颗粒大时，则难灭菌，培养基中含的颗粒小，容易灭菌，颗粒大时，则难灭菌，对于含有对于含有1mm颗粒的培养基，一般采用根据计算所定的颗粒的培养基，一般采用根据计算所定的灭菌温度和时间，而不必提高；对于含有少量较大颗粒及灭菌温度和时间，而不必提高；对于含有少量较大颗粒及粗纤维的培养基，可用粗滤方法粗纤维的培养基，可用粗滤方法(不应影响培养基质量不应影响培养基质量)予予以除去。培养基结块会造成灭菌的不彻底，必须注意。以除去。培养基结块会造成灭菌的不彻底，必须注意

37、。第三节第三节 分批灭菌的计算分批灭菌的计算一、基础条件的确定一、基础条件的确定v 1、污染度、污染度N0:灭菌开始时，污染的培养基中的杂菌个数灭菌开始时，污染的培养基中的杂菌个数(个个/mL)，也称也称为原始污染度。前已指出，不能对培养基中的各种微生物逐一考虑，为原始污染度。前已指出，不能对培养基中的各种微生物逐一考虑，N0应取原有芽孢细菌数和细菌芽孢数之和。一般假定应取原有芽孢细菌数和细菌芽孢数之和。一般假定N0为为104106个个/mL。v 2、灭菌度灭菌度Ns：经过灭菌时间经过灭菌时间t后，培养基中残存的活菌个数后，培养基中残存的活菌个数(个个/mL)，也称为杀菌程度。若要求灭菌后绝对

38、无菌，即也称为杀菌程度。若要求灭菌后绝对无菌，即Ns=0，则从对数残留方则从对数残留方程式可以看出，灭菌时间程式可以看出，灭菌时间t将等于无穷大将等于无穷大()，这是不可能的，也是不，这是不可能的，也是不必要的。因此，要设计一台杀菌设备，必须确定在给定的发酵中所允必要的。因此，要设计一台杀菌设备，必须确定在给定的发酵中所允许的残余污染度。也就是说，培养液灭菌后，以在培养液中还残留一许的残余污染度。也就是说，培养液灭菌后，以在培养液中还残留一定的活菌数来进行计算。工程上，通常可设定的活菌数来进行计算。工程上，通常可设Ns=10-3个个/罐，即微生物罐，即微生物污染降低到被处理的污染降低到被处理的

39、1000罐中只残留一个活微生物的程度，此数已满罐中只残留一个活微生物的程度，此数已满足生产的要求。故实际计算时，只要求出足生产的要求。故实际计算时，只要求出Ns=10-3时的杀菌时间即可。时的杀菌时间即可。0012.303lnlgssNNtKNKNv 3、污染菌的热死特性：一般在设计时需要了解残留活菌数、污染菌的热死特性：一般在设计时需要了解残留活菌数N与杀菌温与杀菌温度度T和时间和时间t的关系。某种最耐热的细菌芽孢，在的关系。某种最耐热的细菌芽孢，在121时的时的K值只有值只有0.4min-1。v 如用这个数值计算灭菌温度和时间，将使温度和时间增高很多。由于如用这个数值计算灭菌温度和时间，将

40、使温度和时间增高很多。由于这种最耐热的芽孢一般很少发现，所以在灭菌计算时不是把所有细菌这种最耐热的芽孢一般很少发现，所以在灭菌计算时不是把所有细菌当作最耐热的芽孢来考虑，而是用一般耐热的细菌芽孢的当作最耐热的芽孢来考虑，而是用一般耐热的细菌芽孢的K值来计算值来计算这个过程。如果培养基中含有较多量的这种耐热细菌芽孢，那么常规这个过程。如果培养基中含有较多量的这种耐热细菌芽孢，那么常规的的121灭菌温度是不够的，要将其提高到接近灭菌温度是不够的，要将其提高到接近140方可。方可。 v 通常设计时可设在通常设计时可设在115.5的芽孢，的芽孢，K孢子孢子=11min-1，在在115.5的细胞，的细胞

41、，K细胞细胞=10min-1。一种枯草芽孢杆菌一种枯草芽孢杆菌FS5230的芽孢在较高温度下，其的芽孢在较高温度下，其K值与温度值与温度T之间具有如下关系：之间具有如下关系：v K=Ae-E/RT=7.941038e-68700/1.98T 211211ln()KEKR TTv 4 4、培养罐中温度与时间的关系：、培养罐中温度与时间的关系：v 少量培养液的杀菌，其升温到杀菌温度的时间以及维持规少量培养液的杀菌，其升温到杀菌温度的时间以及维持规定的杀菌时间后的降温时间可以忽略。但在大量培养液的定的杀菌时间后的降温时间可以忽略。但在大量培养液的分批灭菌时，加热和冷却所需的时间相当长，发酵罐容积分批

42、灭菌时，加热和冷却所需的时间相当长，发酵罐容积越大，时间越长。这两段时间实际上也起灭菌作用，不可越大，时间越长。这两段时间实际上也起灭菌作用，不可忽视，以防止因过度杀菌而引起培养液中有效成分的过度忽视，以防止因过度杀菌而引起培养液中有效成分的过度损失。所以，总的灭菌时间损失。所以，总的灭菌时间t t应等于加热时间应等于加热时间( (升温升温) )时间时间t t1 1、维持维持( (保温保温) )时间时间t t2 2和冷却和冷却( (降温降温) )时间时间t t3 3的总和。的总和。V总总=V加加+V保保+V冷冷V：灭菌准数或杀菌值，表示灭菌效果：灭菌准数或杀菌值，表示灭菌效果第四节第四节 连续

43、灭菌及其计算连续灭菌及其计算v 将培养基在罐外连续进行加热、维持和冷却，然后进入发将培养基在罐外连续进行加热、维持和冷却，然后进入发酵罐的杀菌方法就是连续灭菌法。连续灭菌优点很多，例酵罐的杀菌方法就是连续灭菌法。连续灭菌优点很多，例如可以采用高温短时，使培养基养分破坏减少到最低限度，如可以采用高温短时，使培养基养分破坏减少到最低限度，从而增加了生产率；蒸汽负荷均匀，便于自动控制；由于从而增加了生产率；蒸汽负荷均匀，便于自动控制；由于总的灭菌时间较分批灭菌短，缩短了发酵周期；降低了劳总的灭菌时间较分批灭菌短，缩短了发酵周期；降低了劳动强度等等。因此，培养基的连续灭菌已日益受到重视。动强度等等。因

44、此，培养基的连续灭菌已日益受到重视。v 对于粘度过高或固体成分较多的培养基，要实现连续灭菌对于粘度过高或固体成分较多的培养基，要实现连续灭菌困难较多，主要是灭菌的均匀度与管道堵塞问题。设计这困难较多，主要是灭菌的均匀度与管道堵塞问题。设计这类物料的连续灭菌设备必须避免管道过长，或尽可能将淀类物料的连续灭菌设备必须避免管道过长，或尽可能将淀粉质培养基先行液化。粉质培养基先行液化。一、连续灭菌流程一、连续灭菌流程v 连续灭菌因加热和冷却设备的不同，可有各种流程形式。一般在连续灭菌时，连续灭菌因加热和冷却设备的不同，可有各种流程形式。一般在连续灭菌时，应尽量采用新型的热交换设备，以缩短升温和杀菌后的

45、冷却时间。应尽量采用新型的热交换设备，以缩短升温和杀菌后的冷却时间。 v 1 1、连消塔、连消塔喷淋冷却流程喷淋冷却流程v 这是国内味精厂曾普遍采用的连续灭菌流程。培养基用泵打入连消塔与蒸气直这是国内味精厂曾普遍采用的连续灭菌流程。培养基用泵打入连消塔与蒸气直接混合，达到灭菌温度后进入维持罐，维持一定时间后经喷淋冷却器冷却至一接混合，达到灭菌温度后进入维持罐，维持一定时间后经喷淋冷却器冷却至一定温度后进入发酵罐。该流程是比较陈旧的设计，设备较庞大；维持罐直径较定温度后进入发酵罐。该流程是比较陈旧的设计，设备较庞大；维持罐直径较大，不能保证物料先进先出，易发生局部过热或灭菌不足的现象；喷淋冷却管

46、大，不能保证物料先进先出，易发生局部过热或灭菌不足的现象；喷淋冷却管道很长，对于粘度较高、固形物含量较多的培养基极易堵塞。为了提高热量利道很长，对于粘度较高、固形物含量较多的培养基极易堵塞。为了提高热量利用和节约冷却水，可采用一台套管式换热器或板式换热器置于维持罐及冷却器用和节约冷却水，可采用一台套管式换热器或板式换热器置于维持罐及冷却器中间，使生培养基与热培养基先进行一次热交换，得到预热后再进入连消塔。中间，使生培养基与热培养基先进行一次热交换，得到预热后再进入连消塔。 2.2.喷射加热喷射加热- -真空冷却流程真空冷却流程 生培养液先用泵打入喷射加热器，以较高速度自喷咀喷出，借高速流体的抽

47、生培养液先用泵打入喷射加热器，以较高速度自喷咀喷出，借高速流体的抽吸作用与蒸汽混合后进入管道维持器，经一定时间后通过一膨胀阀进入真空吸作用与蒸汽混合后进入管道维持器，经一定时间后通过一膨胀阀进入真空闪急蒸发室，因真空作用使水分急剧蒸发而冷却，再进入发酵罐冷却到接种闪急蒸发室，因真空作用使水分急剧蒸发而冷却，再进入发酵罐冷却到接种温度。优点：加热和冷却在瞬间完成，营养成份破坏少。温度。优点：加热和冷却在瞬间完成，营养成份破坏少。2.2.薄板换热器连续灭菌流程薄板换热器连续灭菌流程 被广泛应用于食品、发酵、制药、化工部门作为加热、冷却或灭菌之用。如：被广泛应用于食品、发酵、制药、化工部门作为加热、

48、冷却或灭菌之用。如：啤酒厂用于麦芽汁冷却，果酒厂用做葡萄酒灭菌和冷却。优点：设备紧凑、啤酒厂用于麦芽汁冷却，果酒厂用做葡萄酒灭菌和冷却。优点：设备紧凑、占地面积小、拆洗方便、传热面积和传热系数高、不使热敏性物料产生局部占地面积小、拆洗方便、传热面积和传热系数高、不使热敏性物料产生局部过热现象等。过热现象等。 生培养基进入板式换热器的加热段与熟培养液进行一次热交换达到预热，然生培养基进入板式换热器的加热段与熟培养液进行一次热交换达到预热，然后进入加热段加热到灭菌温度后引入维持器保温。同时可再次用于预热，并后进入加热段加热到灭菌温度后引入维持器保温。同时可再次用于预热，并自身冷却。自身冷却。二、连

49、续灭菌计算二、连续灭菌计算v 连续灭菌过程中，加热和冷却所需时间极短，为简化计算，连续灭菌过程中，加热和冷却所需时间极短，为简化计算，可以把加热和冷却阶段的灭菌效果略去不计。可以把加热和冷却阶段的灭菌效果略去不计。v 直接蒸汽连续灭菌设备的温度与时间的关系，取决于所涉直接蒸汽连续灭菌设备的温度与时间的关系，取决于所涉及的实际灭菌问题，由于受热时间短，温度可升高至及的实际灭菌问题，由于受热时间短，温度可升高至140140而不致严重破坏培养基。采用连消塔时可在而不致严重破坏培养基。采用连消塔时可在20203030S S达到预定灭菌温度，由维持罐来保持必要的杀菌时间；达到预定灭菌温度，由维持罐来保持

50、必要的杀菌时间；v 灭菌温度和时间应根据培养基的性质和污染程度来决定。灭菌温度和时间应根据培养基的性质和污染程度来决定。例如，谷氨酸发酵培养基粘度低、营养丰富，故灭菌温度例如，谷氨酸发酵培养基粘度低、营养丰富，故灭菌温度可低些，目前生产上一般多采用可低些，目前生产上一般多采用110110115115保温保温8 81010minmin。灭菌时间主要是维持段灭菌时间主要是维持段( (维持罐或维持管维持罐或维持管) )中停留的时间中停留的时间 。v 如果已知原始污染度如果已知原始污染度N N0 0以及在灭菌温度下微生物死亡反应以及在灭菌温度下微生物死亡反应的速度常数的速度常数K K，略去加热和冷却阶

51、段的灭菌效果，则根据略去加热和冷却阶段的灭菌效果，则根据式式 就可以求出连续灭菌过程所需的维持时间就可以求出连续灭菌过程所需的维持时间t t2 2，根据流量和根据流量和维持时间维持时间t t2 2可定出维持罐的装料容积。可定出维持罐的装料容积。0012.303lnlgssNNtKNKNv 例题一台连续灭菌设备流量例题一台连续灭菌设备流量Q=6m3/h，发酵罐装料容积发酵罐装料容积40m3，原始污原始污染度染度105个个/mL，要求灭菌程度要求灭菌程度Ns=10-3，灭菌温度灭菌温度T=125，此时的此时的K=11min-1。试求维持时间试求维持时间t2及维持罐的装料容积及维持罐的装料容积V约需

52、多少约需多少?v 解解 N0=(40106)105=41012v 每分钟灭菌物料体积（维持容积）每分钟灭菌物料体积（维持容积） V=（Q/60）t2=(6/60)3.26=0.326m3v 罐式维持器不能保证物料先进先出，所以如果采取以上计算所得的维持罐式维持器不能保证物料先进先出，所以如果采取以上计算所得的维持时间和容积，则可能有一部分物料未达到所要求的灭菌程度而过早流出，时间和容积，则可能有一部分物料未达到所要求的灭菌程度而过早流出，为了安全起见并根据实践经验采用维持时间为了安全起见并根据实践经验采用维持时间t2=5min，则：则：v V=(6/60)5=0.5m3 123202.3032

53、.303lg()lg(4 1010 )3.26min11StNNK2 2、维持管、维持管v 管道维持器的设计，不但要保证所要求的维持时间，而且管道维持器的设计，不但要保证所要求的维持时间，而且要使物料在管道中的流动形式尽量接近活塞流，即管道截要使物料在管道中的流动形式尽量接近活塞流，即管道截面各点的流动速度相等。在这种情况下，液体在维持段平面各点的流动速度相等。在这种情况下，液体在维持段平均停留时间恰好等于所有培养基的受热时间，故能避免因均停留时间恰好等于所有培养基的受热时间，故能避免因局部过热而造成营养成分破坏或灭菌不足的现象。局部过热而造成营养成分破坏或灭菌不足的现象。 第五节第五节 灭菌

54、问题的讨论灭菌问题的讨论一、培养基的灭菌条件一、培养基的灭菌条件v 是采用分批灭菌，还是采用连续灭菌，这与培养基的性质是采用分批灭菌，还是采用连续灭菌，这与培养基的性质有很大关系。有很大关系。v 在氨基酸发酵中，大容积的培养基采用连续法消毒比间歇在氨基酸发酵中，大容积的培养基采用连续法消毒比间歇法消毒更为优越。法消毒更为优越。v 在抗生素发酵中，间歇法也许是可行的，因为要使用不溶在抗生素发酵中，间歇法也许是可行的，因为要使用不溶性的培养基成分，如黄豆饼粉或碳酸钙等。而氨基酸发酵性的培养基成分，如黄豆饼粉或碳酸钙等。而氨基酸发酵则采用可溶性成分，例如朊、甜菜糖蜜、淀粉水解液或黄则采用可溶性成分，例如朊、甜菜糖蜜、淀粉水解液或黄豆饼粉水解液，因此，可以有效地使用连消装置。豆饼粉水解液，因此，可以有效地使用连消装置。v 采用连消法的优点是节能，消毒效果好，易控制，有利于采用连消法的优点是节能，消毒效果好，