分子生态学1分子标记

1、分子生态学参考书:1.Molecular Ecology (Second Edition) ( Freeland J. R., Kirk H. and Petersen S.), 2011, Wiley-Blackwell. 2. 分子生态学(Bee T.J.C., Rowe G.)(张军丽等译），中山大学出版社，2009。3.生物多样性译丛（三） 中国科学院生物多样性委员会。科学出版社，19974植物分子生态学 阮成江，何祯祥，周长芳。化学工业出版社，2005同工酶 1. 同功酶同功酶（Isozyme）: 是指同一种酶的多种分子形式，这些不同的分子形式具有相同或相似的底物，催化相同的反应。

2、2. 等位酶等位酶（Allozyme）：由同一基因位点上受不同等位基因来编码的同工酶，即造成同种酶多种分子形式的原因在于编码它们的是同一位点上不同的等位基因。这类特殊的同工酶叫做等位基因同工酶（allele isozyme），简称等位酶(allozyme)。利用同工酶变异作为基因组变异的指标. 材料的采集材料的采集研磨和酶的提取研磨和酶的提取酶的保存酶的保存淀粉凝胶制备淀粉凝胶制备电泳电泳凝胶切片凝胶切片酶的组织化学染色酶的组织化学染色酶谱的记录与分析酶谱的记录与分析数据分析数据分析同工酶与等位酶同工酶与等位酶等位酶分析的过程同工酶与等位酶同工酶与等位酶酶谱照片酶谱照片二倍体二倍体同工酶与等位

3、酶同工酶与等位酶酶谱照片酶谱照片多倍体多倍体同工酶的遗传学分析 1 酶蛋白的结构酶蛋白的结构 我们常选来作遗传分析的酶都是单体酶、二聚体酶或四聚体酶。因为它们的酶谱比较少，容易分析。对大多数酶的遗传学控制已了解得相当清楚，所以这就允许我们从凝胶上的带谱作出遗传学的推断。 过氧化物酶、脂酶、磷酸酶和肽酶等，其同工酶的数量、位置和四级结构往往是可变的，虽然它们也常常也被用来检查遗传变异性，但这些酶对种群遗传结构和系统发育的分析可能是无用的，因为它们的同源性往往不能肯定。二倍体的基因型与酶型的关系等位酶分析的应用1. 了解自然种群的遗传结构; 2. 探查种群的交配系统和交配类型;3. 探查种群间的分

4、化程度;4. 交系分析;5. 分子生态学其它应用.等位酶分析方法的优缺点优点： 1. 等位酶的遗传和表达遵循孟德尔定律,便于遗传学分析; 2. 量化, 可实验,可重复; 3. 不容易饰变; 4. 取材和样品制备简单易行; 5. 结果明解,可比性强.缺点: 1. 有限种类的酶分析会带来一定的偏差; 2. 所先酶的所有基因未必都能表达在酶谱上; 3.大量的新鲜的活体素构造表示活体取样可能遇到困难; 4.可能有非遗传性的或人为的带干扰酶谱解释; 5. 同一个体不同器官或不同发育时期酶的活性有时可能不一样。推荐读物 王中仁.1996.植物等位酶分析.北京：科学出版社同工酶与等位酶同工酶与等位酶 DNA

5、分子标记分子标记在遗传学研究中广泛应用的在遗传学研究中广泛应用的DNA分子标记已经分子标记已经发展了很多种：发展了很多种：（1）是以）是以Southern杂交技术为核心的分子标记，杂交技术为核心的分子标记，（如（如RFLP），这类分子标记被称为第一代分），这类分子标记被称为第一代分子标记。子标记。（2）是以）是以PCR技术为核心的分子标记，（如技术为核心的分子标记，（如STS、RAPD、AFLP、SSR）等，这类分子标）等，这类分子标记被称为第二代分子标记；单核苷酸多态性记被称为第二代分子标记；单核苷酸多态性（SNP）标记被称为第三代分子标记）标记被称为第三代分子标记 。它也是。它也是以以PC

6、R技术为基础的分子标记技术。技术为基础的分子标记技术。几种主要的几种主要的DNA分子标记分子标记（二）（二）RFLP标记：称为限制性片段长度标记：称为限制性片段长度多态性，是指用某一种限制性内切酶来多态性，是指用某一种限制性内切酶来切割来自不同个体的切割来自不同个体的DNA分子上，内切分子上，内切酶的识别序列有差异，即是由限制性酶酶的识别序列有差异，即是由限制性酶切位点上碱基的插入、缺失、重排或点切位点上碱基的插入、缺失、重排或点突变所引起的。这种差异反映在酶切片突变所引起的。这种差异反映在酶切片段的长度和数目上。段的长度和数目上。RFLP标记是发展最早的标记是发展最早的DNA标记技术。标记技

7、术。RFLP技术主要包括以下基本步骤：技术主要包括以下基本步骤：DNA提取用限制性内切酶酶切提取用限制性内切酶酶切DNA 、 用凝胶电泳分开用凝胶电泳分开DNA片段把片段把DNA片段片段转移到滤膜上利用放射性标记的探针杂交转移到滤膜上利用放射性标记的探针杂交显示特定的显示特定的DNA片段（片段（Southern杂交）和结果杂交）和结果分析。分析。 特点特点A 无表型效应，无表型效应，RFLP标记的检测不受环标记的检测不受环境条件和发育阶段的影响。境条件和发育阶段的影响。B RFLP标记在等位基因之间是共显性的，标记在等位基因之间是共显性的，因此在配制杂交组合时不受杂交方式的因此在配制杂交组合时

8、不受杂交方式的影响。影响。C 在非等位的在非等位的RFLP标记之间不存在上位标记之间不存在上位效应，因而互不干扰效应，因而互不干扰D RFLP标记起源于基因组标记起源于基因组DNA的自身变的自身变异，在数量上几乎不受限制异，在数量上几乎不受限制E DNA需要量大，检测技术繁杂，难以需要量大，检测技术繁杂，难以用于大规模的育种实践中。在植物分子用于大规模的育种实践中。在植物分子标记辅助育种中需要将标记辅助育种中需要将RFLP转换成以转换成以PCR为基础的标记。为基础的标记。RAPD（三）（三）RAPD标记标记 RAPD标记的基本原理是利用合成的随机引物标记的基本原理是利用合成的随机引物（一般为（

9、一般为10个碱基）对基困组个碱基）对基困组DNA进行进行PCR扩扩增增 ，然后电泳检测，然后电泳检测PCR产物的多态性。产物的多态性。RAPD标记的主要特点有：标记的主要特点有：（1）不需）不需DNA探针，设计引物也无须知道探针，设计引物也无须知道序列信息；序列信息；（2）显性遗传（极少数共显性），不能鉴）显性遗传（极少数共显性），不能鉴别杂合子和纯合子；别杂合子和纯合子；（3）技术简便，不涉及分子杂交和放射性）技术简便，不涉及分子杂交和放射性自显影等技术；自显影等技术；（4）DNA样品需要量少，引物价格便宜，样品需要量少，引物价格便宜，成本较低；成本较低；（5）实验重复性较差，结果可靠性较低

10、。）实验重复性较差，结果可靠性较低。 （二）（二）AFLP标记标记 Amplified Fragment Length Polymorphism(AFLP) AFLP标记是扩增片段长度多态性的简称标记是扩增片段长度多态性的简称 是是RFLP与与PCR两项技术相结合的产物，两项技术相结合的产物，AFLP技技术的主要步骤：术的主要步骤：DNA提取有两种限制性内切酶酶切提取有两种限制性内切酶酶切DNA寡聚核苷酸接头的连接对限制性酶切片段的寡聚核苷酸接头的连接对限制性酶切片段的选择性扩增扩增产物的电泳分析。选择性扩增扩增产物的电泳分析。由于不同由于不同材料材料DNA酶切片段存在差异，因而便产生发扩增产

11、物的酶切片段存在差异，因而便产生发扩增产物的多态性。多态性。 AFLP的实验过程AFLPKeygene N. V. Wageningen, the Netherlands Zabeau, M., and P. Vos. 1993. Selective restriction fragment amplification: a general method for DNA fingerpringting. European Patent Application, Publ. No.: EP0534858, no. 92402629.7. Vos, P. et al. 1995. AFLP: a

12、new technique for DNA fingerprinting. Nucleic Acids Research, 23:4407-4414.AFLPAFLP的重复性问题Jones et al.（1997）同一实验在欧洲的8个实验室重复，172条带只有1条在一次实验中没有，重复率99.4%，与SSR的水平相当。（Jones, C. J. et al. 1997. Reproducibility testing of RAPD, AFLP and SSR markers in plants by a network of European laboratories. Mol. Breed

13、. 3:381-390)AFLP AFLP标记的主要特点有：标记的主要特点有：（1）由于）由于AFLP分析可以采用的限制性内切酶及选择性分析可以采用的限制性内切酶及选择性碱基种类、数目很多，所以该技术所产生的标记数目碱基种类、数目很多，所以该技术所产生的标记数目是无限多的；是无限多的；（2）典型的）典型的AFLP分析，每次反应产物的谱带在分析，每次反应产物的谱带在50-100条之间，所以一次分析可以同时检测到多个座位，且条之间，所以一次分析可以同时检测到多个座位，且多态性极高；多态性极高；（3）分辩率高，结果可靠；）分辩率高，结果可靠；（4）目前该技术受专利保护，用于分析的试剂盒昂贵，）目前该

14、技术受专利保护，用于分析的试剂盒昂贵，实验条件要求较高。但也存在假阳性带出现频繁、技实验条件要求较高。但也存在假阳性带出现频繁、技术复杂、成本高等缺点。术复杂、成本高等缺点。 （四）（四）SSR标记标记又叫微卫星又叫微卫星DNA标记，它是指基因组中存标记，它是指基因组中存在的由在的由2-5个核苷酸为重复单位组成的长个核苷酸为重复单位组成的长达几十个核苷酸的串联重复序列，广泛达几十个核苷酸的串联重复序列，广泛分布于真核生物基因组中。分布于真核生物基因组中。 SSR标记具有共显性、高多态性和易于标记具有共显性、高多态性和易于检测等优点，是一种理想的分子标记，检测等优点，是一种理想的分子标记， SS

15、R标记的主要特点有：标记的主要特点有：（1）数量丰富，广泛分布于整个基因）数量丰富，广泛分布于整个基因（2）具有较多的等位性变异；）具有较多的等位性变异；（3）共显性标记，可鉴别出杂合子和纯合子；）共显性标记，可鉴别出杂合子和纯合子；（4）实验重复性好，结果可靠；）实验重复性好，结果可靠；（5）由于创建新的标记时需知道重复序列两端）由于创建新的标记时需知道重复序列两端的序列信息，因此其开发有一定困难，费用也的序列信息，因此其开发有一定困难，费用也较高。较高。 SSR位位点标记的优点点标记的优点 约50%呈多态性 共显性 数目多且在基因组中均匀分布 多数位点呈选择中性，符合群体遗传学了理论 技术

16、上适合用PCR分析半自动化，结果可靠 部分降解的DNA样品也可用 适合于等位酶变异小的居群水平的研究 SSRSSRSSR位点标记的缺点位点标记的缺点 可用的位点数目少 设计引物的费用高，耗时长 物种专一性 在说明群体分化和物种分化时可能产生错误SSRSSR标记的应用领域 遗传图谱的构建 连锁分析特殊的基因（如感病基因） 姻亲分析样品鉴定（如父本分析、血缘分析、等号样品分析、杂种分析） 物种和居群的遗传多样性 群体遗传学分析（如有效群体大小、群体遗传结构、群体分化、迁移与基因流动） 传粉生物学与散布生物学（如花粉和种子的散布、交配系统） 保护生物学SSRISSR标记（五）（五）SNP标记标记 也

17、是以也是以PCR技术为基础的分子标记技术。它是指不同生物个体基技术为基础的分子标记技术。它是指不同生物个体基因组因组DNA序列之间单个核苷酸的差异，这种差异可以通过设计特序列之间单个核苷酸的差异，这种差异可以通过设计特异异PCR引物扩增和电泳检测显示出来。引物扩增和电泳检测显示出来。 SNP标记是根据基因组测序结果发展起来的，因而它的数量非常标记是根据基因组测序结果发展起来的，因而它的数量非常丰富。检测丰富。检测SNP的最佳方法是新近发展起来的的最佳方法是新近发展起来的DNA芯片技术。芯片技术。 目前目前SNP作为一种的分子标记技术，已有作为一种的分子标记技术，已有2000多个多个SNP标记定

18、位在标记定位在人类染钯体上，在稻和大豆等植人类染钯体上，在稻和大豆等植 物上也发展了一些物上也发展了一些SNP标记。标记。 Genetic Variations The genetic variations in DNA sequences (e.g., insertions, deletions, and mutations) have a major impact on genetic diseases and phenotypic differences. All humans share 99% the same DNA sequence. The genetic variations

19、 in the coding region may change the codon of an amino acid and alters the amino acid sequence. Single Nucleotide Polymorphism A Single Nucleotide Polymorphisms (SNP), pronounced “snip,” is a genetic variation when a single nucleotide (i.e., A, T, C, or G) is altered and kept through heredity. SNP:

20、Single DNA base variation found 1% Mutation: Single DNA base variation found 3)commentsreferenceITS1TCCGTAGGTGAACCTGCGG White et al, 1990ITS2GCTGCGTTCTTCATCGATGC (is similar to 5.8S below)White et al, 1990ITS3GCATCGATGAAGAACGCAGC (is similar to 5.8SR below)White et al, 1990ITS4TCCTCCGCTTATTGATATGC W

21、hite et al, 1990ITS5GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG (is similar to SR6R)White et al, 1990ITS1-FCTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA Gardes & Bruns, 1993ITS4-BCAGGAGACTTGTACACGGTCCAG Gardes & Bruns, 19935.8SCGCTGCGTTCTTCATCG Vilgalys lab5.8SRTCGATGAAGAACGCAGCG Vilgalys labSR6RAAGWAAAAGTCGTAACAAGG Vilgalys labback to the to

22、p of this page 基因组信息资源基因组信息资源l GenBank (/)l DDBJ (http:/www.ddbj.nig.ac.jp/)l EMBL (http:/www.embl-heidelberg.de/)NCBI ( National Center for Biotechnology Information) / 全球最大的生物信息资源中心 DNA 序列、蛋白质序列、出版物、数据挖掘工具等NCBI主页主页密密苏苏里里植植物物园园主主页页EMBL (Germany)EB

23、I, Hinxton (Cambridge), UK 2004年2月22日摄密密苏苏里里植植物物园园主主页页EMBL-EBI (UK)EMBnet密密苏苏里里植植物物园园主主页页DDBJNCBI、EBI和和DDBJ之间的区别与联系之间的区别与联系密密苏苏里里植植物物园园主主页页GenBank序列投送指南序列投送指南密密苏苏里里植植物物园园主主页页GenBank序列投送软件平台序列投送软件平台 GenBank用纯文本文件 注释、作者 、版本等信息 例: 可视化 怎样检索分子数据库?l 分类学分类学 (Taxonomy ) 检索检索l 序列相似性序列相似性 (Similarity) 检索检索数据库查询 只查询某一种生物 布尔查询 (AND/OR/NOT) 时间限制查询 密密苏苏里里植植物物园园主主页页SRS SRS (2004)密密苏苏里里植植物物园园主主页页GenBank 的分类学检索的分类学检索 (以睡莲科以睡莲科Nymphaeaceae为例为例)密密苏苏里里植植物物园园主主页页挑选白睡莲挑选白睡莲 (Nymphaea alba) 的的 nrDNA ITS 区序列区序列 (收录号收录号AF136283)密密苏苏里里植植物物园园主主页页白睡莲白睡莲 (Nymphaea alba) 的的 nrD