生物化学第15章核酸的理化性质

1、第15章 核酸的理化性质核酸的理化性质一般物理性质DNADNA为白色纤维状固体，为白色纤维状固体，RNARNA为白色粉末状固体。为白色粉末状固体。都微溶于水，其钠盐在水中的溶解度较大。但不溶于都微溶于水，其钠盐在水中的溶解度较大。但不溶于乙醇、乙醚和氯仿等一般有机溶剂乙醇、乙醚和氯仿等一般有机溶剂。DNADNA和和RNARNA在细胞中常以核酸在细胞中常以核酸蛋白复合体（核蛋白）蛋白复合体（核蛋白）形式存在，两种核蛋白在盐溶液中的溶解度不同。形式存在，两种核蛋白在盐溶液中的溶解度不同。 DNADNA核蛋白核蛋白 RNARNA核蛋白核蛋白 0.14mol/LNaCl - +0.14mol/LNaC

2、l - + 1-2mol/LNaCl + - 1-2mol/LNaCl + -DNADNA溶液的粘度很大，而溶液的粘度很大，而RNARNA溶液的粘度小得多。核酸溶液的粘度小得多。核酸发生变性或降解后其粘度降低。发生变性或降解后其粘度降低。核酸受到强大离心力的作用时，可从溶液中沉降下来，核酸受到强大离心力的作用时，可从溶液中沉降下来，其沉降速度与核酸的大小和密度有关。其沉降速度与核酸的大小和密度有关。 与蛋白质相似，与蛋白质相似，RNARNA分子中既含有酸性基团分子中既含有酸性基团（磷酸基）也含有弱碱性碱基基团，因而（磷酸基）也含有弱碱性碱基基团，因而RNARNA也具有两性性质。也具有两性性质。

3、 由于由于RNARNA分子中的磷酸是一个中等强度的酸，分子中的磷酸是一个中等强度的酸，而碱基呈现弱碱性，所以而碱基呈现弱碱性，所以RNARNA的等电点比较低。的等电点比较低。（当核酸分子内的酸性解离和碱性解离相等，（当核酸分子内的酸性解离和碱性解离相等，本身所带的正电荷与负电荷相等时，此时核酸本身所带的正电荷与负电荷相等时，此时核酸溶液的溶液的pHpH值即为核酸的等电点值即为核酸的等电点pIpI）RNARNA在其等在其等电点时溶解度最小。电点时溶解度最小。 RNARNA的等电点比较低的原因，是的等电点比较低的原因，是RNARNA分子中核糖分子中核糖基基2-OH2-OH通过氢键促进了磷酸基上质子

4、的解离。通过氢键促进了磷酸基上质子的解离。核酸的理化性质核酸的两性性质一、核酸的理化性质核酸的水解1、酸水解 核苷酸的糖苷键和磷酸二酯键均可被酸水解，但糖苷核苷酸的糖苷键和磷酸二酯键均可被酸水解，但糖苷键比磷酸二酯键更易被酸水解。键比磷酸二酯键更易被酸水解。 水解水解核酸的理化性质核酸的水解2、碱水解 RNA的磷酸键易被碱水解，产生核苷酸，DNA的磷酸键则不易水解，因为RNA上2-OH基，在碱作用下易形成磷酸三酯而易水解。 水解核酸的理化性质核酸的水解2、碱水解 核酸的理化性质核酸的水解2、碱水解 核酸的理化性质核酸的水解2、碱水解 核酸的理化性质核酸的水解3、酶水解 非特异性水解多聚核苷酸链

5、中磷酸二酯键的酶称为非特异性水解多聚核苷酸链中磷酸二酯键的酶称为磷酸二酯磷酸二酯酶，酶，特异性水解核酸的磷酸二酯酶称为特异性水解核酸的磷酸二酯酶称为核酸酶核酸酶DNADNA水解酶水解酶（DNasesDNases）以）以DNADNA为底物，为底物，RNARNA水解酶水解酶（RNasesRNases）以）以RNARNA为底物。为底物。根据作用方式又分作两类：根据作用方式又分作两类：核酸外切酶核酸外切酶和和核酸内切酶核酸内切酶。核酸外切酶的作用方式是从多聚核苷酸链的一端（核酸外切酶的作用方式是从多聚核苷酸链的一端（3-3-端或端或5-5-端）开始，逐个水解切除核苷酸；核酸内切酶的作用方端）开始，逐个

6、水解切除核苷酸；核酸内切酶的作用方式刚好和外切酶相反，它从多聚核苷酸链中间开始，在某个式刚好和外切酶相反，它从多聚核苷酸链中间开始，在某个位点切断磷酸二酯键。位点切断磷酸二酯键。在分子生物学研究中最有应用价值的是在分子生物学研究中最有应用价值的是限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶。这种酶可以特异性的水解核酸中某些特定碱基顺序部位。这种酶可以特异性的水解核酸中某些特定碱基顺序部位。核酸的理化性质核酸的水解3、酶水解 蛇毒磷酸二酯酶和牛脾磷酸二酯酶是从不同末端降解多聚核苷酸的核酸外切酶3、酶水解 核酸的理化性质核酸的水解牛胰核糖核酸酶（RNase I）作用位点为嘧啶核苷-3-磷酸与其它核苷酸之间的连

7、键，产物为3-嘧啶核苷酸；或以3-嘧啶核苷酸结尾的寡核苷酸。核酸的理化性质核酸的水解3、酶水解 限制性内切酶是一类重要的作用于DNA的内切酶限制性内切酶识别部位一般都是由4-8个碱基对组成的一段序列，而且有一个二重对称轴，即5-3方向残基序列在DNA的两条链上是一样的，这样的序列称为回文结构。E. CoR I是一个重要的限制性内切酶，它识别由6个碱基对组成的特殊序列（每条链上是GAATTC）。大多数限制性内切酶都是将双链DNA切开，形成两个粘性末端（带有与另一末端互补的单链）限制性内切酶往往与一种甲基化酶同时成对的存在，它们具有相同的底物专一性，具有识别相同碱基序列的能力。核酸的理化性质核酸的

8、水解3、酶水解 5NNNNGAATTCNNNN33NNNNCTTAAGNNNN55NNNNG AATTCNNNN33NNNNCTTAA GNNNN5E. coR I核酸的理化性质核酸的水解3、酶水解 5NNNNG33NNNNCTTAA55AATTCNNNN3 3GNNNN55NNNNGAATTCNNNN33NNNNCTTAAGNNNN5二、核酸的理化性质核酸的紫外吸收1、紫外吸收 DNA和RNA的碱基有共轭双键，而使核酸在240290nm有光吸收，最大吸收在260nm附近。 可用紫外分光光度法进行核酸纯度鉴定。 纯DNA样品：A260/A2801.8 纯RNA样品：A260/A2802.0 对

9、纯样品：A=1.0相当于50ug/mL双链DNA或40ug/mL单链DNA或20ug/mL寡核苷酸。核酸的理化性质核酸的紫外吸收2、增色效应与减色效应核酸的理化性质核酸的紫外吸收2、增色效应与减色效应 有时核酸溶液的紫外吸收用摩尔磷吸光度表示，根据磷含量及紫外吸收值然后算出摩尔磷吸光系数。 (P)=A/cL =30.98A/WL 一般天然DNA的(P)为6600，RNA为77007800。由于单链核苷酸的(P)比双链的要高，所以核酸发生变性时， (P)升高，故称增色效应；复性时(P)降低，称为减色效应。三、核酸的理化性质核酸的变性、复性与杂交1 1、核酸的变性（、核酸的变性（denaturat

10、iondenaturation） 是指核酸的双螺旋区的氢键断裂，变成单链，并不涉及共价键的断裂。 变性因素：酸碱、热、尿素等； DNA热变性后一些理化性质改变： 260nm紫外区吸收值升高； 粘度降低； 浮力密度升高； 双折射现象消失； 核酸的理化性质核酸的变性、复性与杂交1 1、核酸的变性（、核酸的变性（denaturationdenaturation）核酸的理化性质核酸的变性、复性与杂交1 1、核酸的变性（、核酸的变性（denaturationdenaturation）用加热的方法使用加热的方法使DNADNA变性叫变性叫做做热变性热变性DNADNA的变性过程是爆发性的，的变性过程是爆发性的

11、，它在很窄的温度区间内完成。它在很窄的温度区间内完成。因此，因此，通常将通常将DNADNA的变性达的变性达到到50%50%时，即增色效应达到时，即增色效应达到一半时的温度称为一半时的温度称为DNADNA的解的解链温度（链温度（melting melting temperature,Tmtemperature,Tm）,Tm,Tm也称也称熔解温度或熔解温度或DNADNA的熔点。的熔点。一般一般DNADNA的的T Tm m值在值在70-8570-85 C C之间之间核酸的理化性质核酸的变性、复性与杂交1 1、核酸的变性（、核酸的变性（denaturationdenaturation）Tm与下列因素有

12、关：1）DNA的均一性： 均质DNA的熔解过程发生在一个较小的温度范围内；异质DNA的熔解过程发生在一个较宽的温度范围内。2）G-C的含量：含量越高，Tm越高； 经验公式：G-C%=（Tm-69.3）*2.443）离子强度：I越高，Tm越大，DNA宜保存在高浓度盐中。核酸的理化性质核酸的变性、复性与杂交1 1、核酸的变性（、核酸的变性（denaturationdenaturation）核酸的理化性质核酸的变性、复性与杂交2、核酸的复性（Renaturation）变性变性DNADNA在适当的条件下在适当的条件下，两条彼此分开的单链可以，两条彼此分开的单链可以重新缔合成为双螺旋结构，这一过程称为重

13、新缔合成为双螺旋结构，这一过程称为复性复性。DNADNA复复性后，一系列物理、化学性质将得到恢复。性后，一系列物理、化学性质将得到恢复。DNADNA复性的复性的程度、速率与复性过程的条件有关。程度、速率与复性过程的条件有关。将热变性的将热变性的DNADNA骤然冷却至低温时，骤然冷却至低温时，DNADNA不可能复性。不可能复性。但是将变性的但是将变性的DNADNA缓慢冷却时，可以复性，这一过程也缓慢冷却时，可以复性，这一过程也叫退火（叫退火（annealing)annealing)。分子量越大复性越难。浓度越分子量越大复性越难。浓度越大，复性越容易。此外，大，复性越容易。此外，DNADNA的复性

14、也与它本身的组成的复性也与它本身的组成和结构有关。和结构有关。复性反应的速度用复性反应的速度用CotCot1/21/2衡量。衡量。CoCo为变性为变性DNADNA复性时复性时的浓度，的浓度，t t为时间，以秒表示。为时间，以秒表示。 CotCot1/21/2衡量表示复性一衡量表示复性一半时的半时的CotCot值。值。2、核酸的复性核酸的理化性质核酸的变性、复性与杂交核酸的理化性质核酸的变性、复性与杂交2、核酸的复性核酸的理化性质核酸的变性、复性与杂交3 3、核酸的分子杂交（、核酸的分子杂交（ hybridizationhybridization） 将不同来源的DNA放在试管里，经热变性后，慢慢

15、冷却，让其复性。若这些异源DNA在某些区断内有相同的序列，则复性时，会形成杂交DNA分子，且DNA与互补的RNA之间也可发生杂交。核酸的理化性质核酸的变性、复性与杂交3 3、核酸的分子杂交、核酸的分子杂交3 3、核酸的分子杂交、核酸的分子杂交核酸的理化性质核酸的变性、复性与杂交SouthernSouthern印迹杂交（印迹杂交（Southern blotSouthern blot）。是研究DNA图谱的基本技术，在遗传病诊断、DNA图谱分析及PCR产物分析等方面有重要价值。Southern印迹杂交的基本方法是将DNA标本用限制性内切酶消化后，经琼脂糖凝胶电泳分离各酶解片段，然后经碱变性，Tris

16、缓冲液中和和高盐下通过毛细作用将DNA从凝胶中转印至硝酸纤维素膜上、烘干固定后即可用于杂交。凝胶中DNA片段的相对位置在DNA片段转移到滤膜的过程中继续保持着，附着在滤膜上的DNA与32P标记的探针杂交，利用放射自显影术确立探针互补的每一条DNA带的位置，从而可以确定在众多消化产物中含某一特定序列的DNA片段的位置和大小。核酸的理化性质核酸的变性、复性与杂交3 3、核酸的分子杂交、核酸的分子杂交核酸的理化性质核酸的变性、复性与杂交3 3、核酸的分子杂交、核酸的分子杂交NorthernNorthern印迹杂交（印迹杂交（Northern blotNorthern blot）。）。这是一种将RNA从琼脂糖凝胶中转印到硝酸纤维素膜上的方法。因RNA印迹技术正好与DNA相对应，故被称为Northern印迹杂交。Northern印迹杂交的RNA吸印与Southern印迹杂交的DNA吸印方法类似，只是在进样前用乙二醛或甲醛使RNA变性，而不用NaOH，因为它会水解RNA的2-羟基基团。基因芯片（gene chip）是指将现代探针固相原位合成技术、照相平板印刷技术、高分子合成技术等微电子技术与分子生物学技术