生物化学知识点

1、一名词解释吸光度 是指光线通过溶液或某一物质前的入射光强度 与该光线通过溶液或物质后的透射光强度比值的对数，影响它的因素有溶剂、浓度、温度等等。吸光度用A表示。Aabc，其中a为吸光系数，单位L/(g·cm),b为液层厚度（通常为比色皿的厚度），单位cm ， c为溶液浓度，单位g/L盐析 当盐浓度升高到一定程度后，蛋白质的溶解度随着盐浓度的升高而降低，结果使蛋白质沉淀析出，这种现象称为盐析作用。调整保留时间：气相色谱中,扣除死时间后的保留时间。t'RtRt0tR：进样开始至出某组分峰所需时间，称保留时间t0：进样开始至出空气峰所需时间，称死时间外标法 就是用标准品的峰面积或峰

2、高与其对应的浓度做一条标准曲线,测出样品的峰面积或峰高,在标准曲线上查出其对应的浓度,这是最常用的一种定量方法泳动度 指带电颗粒在单位电场强度中泳动的速度。也称迁移率。单克隆抗体 免疫动物的脾细胞能产生相应的特异抗体，从中能选出单个细胞，经扩大培养，即可得到对应于一个抗原决定簇的单一抗体分子，即单克隆抗体。序列标签位点 是在染色体上定位明确，且可用PCR扩增的单拷贝序列。定向克隆：使外源DNA片段定向插入到载体分子中的方案叫定向克隆。比较基因组学:在基因组图谱和序列分析的基础上，对已知基因组进行比较，了解基因的功能，表达机理和物种进化的学科。摩尔吸光系数：是指在一定波长时，溶液浓度为1mol/

3、L，厚度为1cm的吸光度，用或EM表示分配系数是指一种溶质在两种互不相溶的溶剂中溶解达到平衡时，该溶质在两相溶剂中的浓度比值 K=固定相中溶质的浓度/流动相中溶质的浓度反离子 粘粒吸附决定电位离子层带电后，靠静电引力吸引溶液中电性相反的离子聚其周围，这部分离子称反离子，形成反离子层。cDNA文库：将真核细胞内全部mRNA转录成cDNA并将双链cDNA（dscDNA）和载体连接，由此得到的cDNA克隆群体称为cDNA文库。包含体：它是致密的不溶性蛋白和RNA的凝聚体，包含大部分的表达蛋白。 以大肠杆菌为宿主菌高效表达外源基因时，表达蛋白常常在细胞质内聚集，形成包含体。 相对离心力：是指颗粒所受的

4、离心力与地心引力（重力）之比。 即RCF=Fc/Fg概述结构基因组学研究工作的基本步骤 绘制染色体的低分辨率遗传图谱和物理图谱， 遗传作图（genetic mapping）又称连锁图谱（linkage map），是通过测定重组率，确定用重组率表示的基因之间的相对位置。物理图谱（physical map）是利用各种分子标记确定片段间的连接顺序，以及遗传标志之间用千碱基（kb）或兆碱基（Mb）表示的物理距离。重叠群的建立， 染色体被分解并完成测序后，需要组装，低分辨率物理图谱可以为组装提供标记。制作低分辨率物理图谱，广泛使用序列标签位点（sequence tagged site, STS）。所谓的

5、STS是在染色体上定位明确，且可用PCR扩增的单拷贝序列。高分别率物理图谱的制作，重叠群克隆中的大片段通常要被分解成较小的片段，用BAC进行亚克隆后，才可被用来通过随机切割进行测序。由于亚克隆中的片段也需要组装，在分解大片段之前，需要制作大片段的高分辨率物理图谱。制作高分辨率物理图谱，可以采用多种不同的分子标记。（1）限制性片段长度多态性标记 （2）DNA重复序列的多态性标记 （3）单核苷酸多态性标记 序列测定 在制作高分别率物理图谱的基础上，就可以对BAC中插入的片段逐个进行测序。基因定位 基因定位的一个基本方法是重组分析，若某致病基因和某个分子标记如微卫星DNA的重组率超过5%，说明二者不

6、连锁，若重组率接近于零，说明该基因位于标记位点符近。 基因定位的另一个基本方法，是根据蛋白质结构的氨基酸序列，设计特异性的探针，通过分子杂交，筛选cDNA文库，这种方法称作功能克隆。概述用分光光度法进行定量测定的常用方法和为减小测量误差应注意的问题1. 吸光系数法（绝对法） 根据比尔定律A = c l ，若 l 和吸光系数或E1%1cm已知，即可根据测得的A，求出被测物的浓度。 C = A / l 通常和E1%1cm可以在手册或文献中查到2. 标准曲线法 （1）配置一系列浓度不同的标准溶液。 （2）在测定条件相同的情况下，分别测定其吸光度。 （3）以标准溶液浓度为横坐标（不必考虑显色剂等引起的

7、体积和浓度变化），以相应的吸光度为纵坐标，绘制A-C关系图。 （4）在相同条件下测出样品溶液的吸光度，从标准曲线上查出浓度。3. 对照法 在同样条件下配置标准溶液和样品溶液，在选定波长处，分别测量吸光度，根据定律 A标=EC标l A样=EC样l 在同种物质、同台仪器及同一波长测定的条件下l 和E 均为定值，所以： 减小测定误差的方法1. 选择合适的显色剂，使显色反应的灵敏度高、选择性好、显色产物稳定。 2. 通过条件试验，找出最佳的试剂加入量、酸度、温度和显色时间。并使样品与标准品在尽可能完全相同的条件下进行测定。 3. 设置合适的对照。 4. 通过加掩蔽剂和控制pH值，消除共存离子的干扰。

8、5. 尽可能在吸光度0.11.0范围内测定，以减小吸光度误差。A < 0.1的溶液，尽量用摩尔吸光系数大的显色反应，在最大吸收波长处进行测定，吸收池厚度大一些，溶液可通过萃取、浓缩、增大取样量来增加吸光度。A > 1.0的溶液，可通过稀释或用薄的吸收池来降低吸光度。 6. 减小仪器误差。用稳压器稳定电压以使入射光强度保持不变；吸收池厚度应一致，透光性好，不要用手摸透光面；吸收池与入射光线应垂直，否则会因光程增大而发生误差。 比较用定时法，连续检测法和平衡法测定酶活力的优缺点 1 测定酶反应开始后某一时间内（t1到t2）产物或底物浓度的总变化量来求取酶反应初速度 的方法称为定时法 这

9、种方法的优点是简单，因最后测定产物时酶反应已被终止，故比色池无需保温装置，显色剂的选择也可不考虑对酶活力的影响。缺点是如果不用预试验确定，无法了 解酶作用的这段时间内是否都是零级反应，故很难保证测定结果的真实性。 2 连续测定（每15s1min监测一次）酶反应过程中某一反应产物或底物的浓度随时间的变化来求出酶反应初速度的方法称为连续监测法这种方法的优点是可将多点的测定结果（s或p的变化）连接成线，容易找到成直线的区段，可以观察到是否偏离零级反应，因而可选择线性反应期来计算酶活力，不需要终止反应。缺点是因酶和底物边保温边测定的需要，仪器（比色计或分光光度计）必须有保温装置，而且产物（或底物）应是

10、可被直接测定的化合物，且借以测定的特殊性质，必须与底物（或产物）有明显差别，否则，需加入其它试剂（如显色剂、酶试剂等），将其转变成可测物质，但必须专虑到加入的酶试剂或显色剂对待测酶是否有影响。3通过测定酶反应开始至反应达到平衡时产物或底物浓度总变化量来求出酶活力的方法称为平衡法。用平衡法测定时，因产物的增加或底物的减少与反应时间不成线性，故不能把p或s 的总变化量除以t来代表每分钟产物或底物的变化。另外，平衡法也会受到产物抑制、可逆 反应等因素的影响，由于反应时间较定时法更长，故这种影响会更大，测定结果也较连续监 测法低，不能代表初速度，也不是零级反应的速度。但是与定时法相同，只要待测标本与正

11、常标本在相同条件下反应并测定，亦能以此判断出待测标本酶活力的相对大小。而且，对于有些零级反应期很短的酶促反应，用连续监测法和定时法很难测出其初速度，也只得采用平衡法测定。 抽提蛋白质时，哪些因子可影响抽提的效率（1）pH值改变溶质解离状态。 对蛋白质或酶等具有等电点的两性电解质物质，一般选择抽提液的pH值应在偏离等电点的稳定范围内。通常碱性蛋白质选用低pH值的溶液抽提，酸性蛋白质选用高pH值的溶液抽提，或者用调至一定pH值的有机溶剂抽提。 （2）溶剂的极性和离子强度 有些生物大分子在极性大、离子强度高的溶液中稳定；有些则在极性小、离子强度低的溶液中稳定。一种物质溶解度大小与溶剂性质密切相关（相

12、似相溶原理）；离子强度通过影响溶质的带电性也影响溶质的溶解度。一般离子强度较低的中性盐溶液可促进蛋白溶解（盐溶），高离子强度的中性盐可引起蛋白质沉淀，析出（盐析）。高离子强度使DNA溶解度增加；低离子强度使RNA溶解度增加（核酸分离依据）。（3）水解酶 细胞破裂后，许多水解酶释放出来。水解酶与欲抽提的蛋白质或核酸接触时，会导致蛋白质或核酸分解，而使实验失败。为此，必须采用加入抑制剂，调节抽提液的pH、离子浓度或极性等方法，使这些酶丧失活性（4）温度 提高温度，溶解度增加，但易使大分子物质变性失活。小分子物质：5070；生物大分子：010，最好控制在04（5）搅拌 搅拌能促使欲抽提物与抽提液的接

13、触，并能增加溶解度。但是，一般宜采用温和的搅拌方法 ，速度太快时容易产生泡沫，导致某些酶类变性失活。（6）氧化 一般蛋白质都含相当数量的巯基，该基团常常是酶和蛋白质的必须基团，若抽提液中存在氧化剂或氧分子时，会使巯基形成分子内或分子间的二硫键，导致酶（或蛋白质）失活（或变性）。在提取液中加入巯基乙醇，半胱氨酸。还原性谷胱甘肽等还原剂，可防止巯基发生氧化，使蛋白，酶失活。（7）金属离子 蛋白质的巯基除易受氧化剂作用外，还能和金属离子如铅、铁或铜作用，产生沉淀复合物。 （8）抽提液与抽提物的比例 在抽提时，抽提液与抽提物的比例要适当，一般以51为宜。概述对提取物进行浓缩的常用方法1. 盐析法 用添

14、加中性盐的方法来使某些蛋白质（或酶）从稀溶液中沉淀出来，从而达到样品浓缩的目的。最常用的中性盐是硫酸铵，其次是硫酸钠、氯化钠、硫酸镁、硫酸钾等。2. 有机溶剂沉淀法 在生物大分子的水溶液中，逐渐加入乙醇、丙酮等有机溶剂，可以使生物大分子物质的溶解度明显降低，从溶液中沉淀出来，这也是浓缩生物样品的常用方法。其优点是溶剂易于回收，样品不必透析除盐。在低温条件下用有机溶剂沉淀法得到的多种生物大分子可保持生物活性，但某些蛋白质或酶易变性失活，应小心操作。3. 葡聚糖凝胶浓缩法 向稀样品溶液中加入干的葡聚糖凝胶（Sephadex）G-25，缓慢搅拌30 min，葡聚糖凝胶吸水膨胀，进行吸滤，生物大分子全

15、部留在溶液中，如此重复数次，可在短时间使溶液浓缩，每次葡聚糖凝胶的加入量为溶液量的1/5为宜，用过的葡聚糖凝胶经去离子水洗净后，用乙醇脱水干燥后可重复使用。4. 聚乙二醇浓缩法 将待浓缩液装放入透析袋内，袋外复盖聚乙二醇，袋内的水分很快被袋外的聚乙二醇所吸收，在极短时间内，可以浓缩几十倍至上百倍。被溶剂饱和的聚乙二醇经加热除去溶剂后可再次使用。5. 超滤浓缩法 适用于生物大分子的浓缩或脱盐，并具有不存在相变、不添加任何化学物质、成本低、操作方便、条件温和、回收率高等优点。通过超滤法，蛋白质和酶的稀溶液一般可浓缩到1050浓度，回收率高达90。应用超滤法的关键是根据实验需要选择合适的滤膜和超滤装

16、置。 膜板式超滤装置，截留面积有限。中空纤维超滤在一支空心柱内装着许多的中空纤维毛细管，管的内径一般在0.2 mm左右，极大地增加了渗透的表面积，提高了超滤的速度。通过蠕动泵或液压泵将待超滤液注入中空纤维管内，小分子和溶剂被挤出管外，大分子逐步被浓缩，同时可以去除小分子和盐分。6. 常压蒸发法 蒸发是溶液表面的水或溶剂分子获得的动能超过溶液内分子间的吸引力以后，脱离液面进入空间的过程。在常压下加热使溶剂蒸发，溶液被浓缩称常压蒸发。该法操作简单，但仅适于浓缩耐热物质。7. 真空减压浓缩法 此法适于浓缩遇热易变性的物质，特别是蛋白质、酶、核酸等生物大分子。当盛液的容器与真空泵相连而减压时，溶液表面

17、的蒸发速率将随真空度的增高而增大。简述差速离心，密度梯度离心和等密度离心的特点1. 差速离心法 这是最普通的离心法。即采用逐渐增加离心速度或低速和高速交替进行离心，使沉降速度不同的颗粒，在不同的离心速度及不同离心时间下分批分离的方法。此法一般用于分离沉降系数相差较大的颗粒。差速离心首先要选择好颗粒沉降所需的离心力和离心时间。当以一定的离心力在一定的离心时间内进行离心时，在离心管底部就会得到最大和最重颗粒的沉淀，分出的上清液在加大转速下再进行离心，又得到第二部分较大较重颗粒的沉淀及含较小和较轻颗粒的上清液，如此多次离心处理，即能把液体中的不同颗粒较好地分离开。此法所得的沉淀是不均一的，仍杂有其它

18、成分，需经过23次的再悬浮和再离心，才能得到较纯的颗粒。2. 密度梯度离心 又称速率区带离心法。是在离心前于离心管内先装入密度梯度介质（如蔗糖、甘油、KBr、CsCl等），待分离的样品铺在梯度液的顶部、离心管底部或梯度层中间，同梯度液一起离心。在一定的离心力下把颗粒分配到梯度中某些特定位置上，形成不同区带的分离方法。此法仅用于分离有一定沉降系数差的颗粒（20% 的沉降系数差或更大）或分子质量相差3倍的蛋白质。大小相同，密度不同的颗粒（如线粒体，溶酶体等）不能用此法分离。3. 等密度离心 密度梯度液包含了被分离样品中所有粒子的密度，待分离的样品铺在预先制备好的梯度介质溶液顶上，或先与梯度液混合后

19、装入离心管，离心开始后，当梯度液由于离心力的作用逐渐形成管底浓而管顶稀的密度梯度，与此同时原来分布均匀的粒子也发生重新分布。 离心时，样品的低密度的颗粒向上浮起，高密度的颗粒向下沉降，一直移动到与它们的密度相等的等密度点的特定梯度位置上，形成不同的区带。凝胶层析法测定蛋白质相对分子质量的实验原理当含有各种组分的样品流经凝胶层析柱时，大分子物质由于分子直径大，不易进入凝胶颗粒的微孔，沿凝胶颗粒的间隙以较快的速度流过凝胶柱。而小分子物质能够进入凝胶颗粒的微孔中，向下移动的速度较慢，从而使样品中各组分按相对分子质量从大到小的顺序先后流出层析柱，而达到分离的目的。 按照分离机制可将HPLC分为哪几种主

20、要类型1. 液固吸附色谱 以吸附剂为固定相，以不同极性的溶剂为流动相，根据试样中各组分吸附能力的不同而进行分离的方法，称液相吸附色谱。在HPLC中常用全多孔型硅胶微粒为吸附剂。2. 液-液分配色谱 按照固定相和流动相极性的差别，可分为正相与反相色谱法两类。 正相液液色谱法 流动相极性小于固定相的液-液色谱法称正相液-液色谱法。 反相液-液色谱法 流动相极性大于固定相的液-液色谱法称反相液-液色谱法3. 离子交换色谱 由于聚苯乙烯树脂类具膨胀性，不耐压，HPLC的离子交换剂多用薄壳型或全多孔微粒硅胶为载体，表面化学键合各种离子交换基团，常用的为强酸性磺酸基和强碱型季铵盐。4. 空间排斥（凝胶）色

21、谱 由苯乙烯和二乙烯苯交联而成的半硬质凝胶柱效较高，常用有机溶剂为流动相，缺点是具膨胀性，流动相流经时柱的填充状态会发生变化。以多孔硅胶及多孔玻璃珠等无机材料制成的硬质凝胶，在溶剂中不变形，但装柱时易碎，柱效较差，吸附性较强，有时易拖尾。 5. 亲和色谱 常用的基质有高度交联的Sephadex和Bio-gel等琼脂糖凝胶，大孔径聚丙烯酰胺凝胶和多孔硅胶，配基选择及交换剂合成的原理类似经典亲和层析。简要说明HPLC的仪器构成和主要的应用领域高效液相色谱仪通常由溶剂输送系统、进样系统、色谱分离系统和检测记录系统四部分组成。1. 高压泵：由于HPLC的固定相颗粒很小，柱阻力很大，故载液必须用高压泵来

22、输送，通常柱前压达1530MPa，才能获得高速的液流，以达到快速分离目的。2. 进样装置：为了将试样有效地送入色谱柱，可用微量注射器通过六通进样阀的进样口注入样液；亦可将样液先注入与柱头相连的贮样环管，然后利用切换阀让载液将样品定量地送入色谱柱。 3. 色谱柱 固定相可通过干法或湿法在高压下装入色谱柱，要求填充均匀。多数使用者可直接购置各种类型的预装柱，在使用过程中由于杂质污染往往使柱效逐渐降低，因此，每次测定后要用流动相慢速（0.1mL/min）冲洗柱子，使其再生。4. 检测器：目前应用较多的是紫外检测器、差示折光检测器和荧光检测器。紫外检测器是基于试样中的待测组分对特定波长的紫外光有选择性

23、的吸收，其吸光度与组分消光度成正比的关系进行检测的差示折光检测器是利用连续测定流通池中溶液折射率的变化来测定试液浓度的检测器。荧光检测器是根据某些物质在紫外光照射下具有荧光的特性来检测的。已成为化学，医学，工业，农学，商检和法检等学科领域中重要的分离分析技术。说明SDS-PAGE 和 IEF/SDS-PAGE 的原理和主要用途SDS-PAGE 由于SDS带有大量负电荷，当其与蛋白质结合时，所带的负电荷大大超过了天然蛋白质原有的负电荷，因而消除或掩盖了不同种类蛋白质间原有电荷的差异，使蛋白质均带有相同密度的负电荷，因而可利用Mr差异将各种蛋白质分开。它不仅用于蛋白质Mr测定，还可用于蛋白混合组分

24、的分离和亚组分的分析，当蛋白质经SDS-PAGE分离后，设法将各种蛋白质从凝胶上洗脱下来，除去SDS，还可进行氨基酸顺序、酶解图谱及抗原性质等方面的研究。IEF/SDS-PAGE 双向PAGE电泳是由两种类型的PAGE组合而成。样品经第一向电泳分离后，再以垂直它的方向进行第二向电泳。如这二向电泳体系pH及凝胶浓度完全相同，则电泳后样品中不同组分的斑点基本上呈对角线分布，对提高分辨率作用不大。第一向为IEF-PAGE，第二向为SDS-PAGE，简称为IEF/SDS-PAGE；基本原理与IEF-PAGE，SDS-PAGE完全相同。 IEF/SDS-PAGE双向电泳已成为当前分子生物学领域内常用的实

25、验技术，可广泛用于生物大分子如蛋白质，核酸酶解片段及核糖体蛋白质的分离和精细分析，是蛋白质组学的基本方法概述巢式PCR，反向PCR，锚定PCR，实时定量PCR的特点和主要应用1. 巢式PCR（nested PCR） 先用一对引物对模板进行扩增，然后再用另一对引物扩增第一对引物扩增的产物，这一PCR 技术即巢式PCR。第一次扩增所用引物称外引物（outer-primer），第二次扩增作用的引物称内引物（inter-primer）。一般应用于动物方面，如病毒，HIV，肿瘤基因等。2反向PCR（inverse PCR） 扩增引物相反方向DNA序列的PCR技术称反向PCR。在反向PCR中，要先将含有一

26、段已知序列的感兴趣的未知DNA片段进行酶切和环化，然后直接进行PCR，也可将已知序列酶切环化后再进行PCR。反向PCR主要用于已知序列两翼未知DNA序列的扩增。3锚定PCR（anchored PCR）用酶法在一通用引物反转录的cDNA 3'端加上一段已知序列，然后以此序列为引物结合位点对该cDNA进行PCR扩增称为锚定PCR，可用于未知cDNA的制备及低丰度cDNA文库的构建4实时定量PCR实时定量PCR（real time PCR）在每个反应管中加入荧光标记物，扩增产物越多，荧光强度越大。在进行RT-PCR的过程中，实时检测各反应管的荧光强度，做出每个样本荧光强度随扩增次数变化的曲线

27、。应用： mRNA表达的研究，DNA拷贝数的检测，单核苷酸多态性的测定比较设计PCR引物和寡核苷酸探针应遵循的基本原则，并指出设计不当会造成什么后果引物设计一般遵循以下原则：(1) 引物长度 一般为1530b，引物太短，就可能同非靶序列杂交得到不需要的扩增产物。 (2) G + C含量 G + C含量一般为40%60%。引物的G+C含量和引物Tm值应该协调，按公式 Tm = 4(G + C) + 2(A + T) 估计引物的Tm值。(3) 碱基的随机分布 引物中4种碱基应随机分布，不要多个嘌呤或多个嘧啶连续出现。引物自身不应存在互补序列，以免自身折叠成发夹结构影响与模板的退火结合。两引物之间也

28、不应有互补性，尤其是避免3端的互补而形成引物二聚体，使靶序列的扩增量下降。(4) 引物浓度 引物的浓度一般为0.10.5mol/L，引物浓度偏高会引起错配和非特异性产物扩增。 设计寡核苷酸序列用于分子杂交时应遵循以下几个原则： （1）探针长度 一般要求1050bp。过短则特异性降低，过长则不仅合成较困难，而且延长杂交时间。 （2）GC对含量 应为40%60%，超出此范围会增加非特异性杂交。（3）一定不要含有探针内部互补顺序 即不应有4bp的碱基反向互补配对，否则会形成探针内部“发夹”状结构。（4）避免有同一碱基的连续出现 不可4个，如-GGGGG-。（5）最好用计算机与已知的各种基因序列进行同

29、源性比较 如果此寡核苷酸序列与非靶基因序列有70%以上的同源性或连续8个以上的碱基序列相同，则最好不用，重新设计。进行基因克隆时，可以通过哪些途径获取目的基因，并简要评价这些方法的优缺点1. 基因组DNA的非特异性断裂 超声波处理基因组DNA可得到300bp左右的随机片段，高速组织捣碎器，控制一定的条件也能得到不同大小的DNA片段，如将高分子量DNA 1500r/m捣碎30分钟，可得到大约8kb的DNA片段。由机械处理产生的DNA片段末端不一，断点随机，条件难以掌握，所以目前较少使用这种方法。2. 染色体DNA的限制性内切酶酶解 型限制性内切酶可专一识别并切割特定的DNA顺序，产生不同类型的D

30、NA末端。若载体DNA与插入片段用同一种内切酶消化，可以直接进行连接。3. 通过mRNA合成cDNA 基因组DNA中重复顺序和假基因占有很大比重，克隆完整的基因比较困难。用mRNA反转录成cDNA，得到相应的双链cDNA，再进行克隆，获得较完整的连续编码顺序，容易在宿主细胞中表达。4. 人工体外合成DNA片段一些小分子生物活性多肽，可以通过人工合成编码顺序插入载体后，转化细菌进行表达。分子较大的基因，可以通过分段合成，然后连接组装成完整的基因。目前已经合成了人胰岛素A、B链基因和干扰素基因，并成功表达，制备成商业产品。5. 聚合酶链反应（PCR）扩增特定基因片段 对于有部分了解或完全清楚的基因

31、，可以通过PCR反应，直接从染色体DNA或cDNA上高效快速地扩增出目的基因片段，然后进行克隆操作。唯一的要求是，对基因片段两侧的序列了解清楚。 6. 用cDNA文库选择特定的基因（1）用斑点杂交选择特定的克隆 （2）用已知的氨基酸序列选择特定的克隆（3）差别杂交 （4）扣除杂交进行基因克隆时，筛选重组子常用哪些方法（一）针对遗传表型改变的筛选法1. 插入失活双抗生素对照筛选 如前述pBR322质粒，若外源DNA插入tetr基因，则先将转化菌接种到含氨苄青霉素的平板培养基上，凡生长的菌落均含有质粒。再用无菌牙签将这些菌落接种到含四环素平板培养基 的对应位置，凡不能生长者均含有重组质粒，扩大培养

32、这些菌落，即可扩增重组质粒。 2. 插入表达筛选 有些载体设计时，在筛选标志基因前面连接一段负控制序列，当插入失活该负调控序列时，其下游的筛选标记基因才能表达3.-半乳糖苷酶系统筛选 通过插入失活lacZ基因的载体包括M13噬菌体，pUC质粒系列，pEGM质粒系列等。它们的共同点是载体上携带一段细菌的基因lacZ，它编码-半乳糖苷酶的一段146个氨基酸的-肽 ，重组子中基因插入使-肽基因失活不能形成-互补作用，在X-gal平板上，含阳性重组体的细菌为无色噬菌斑或菌落，载体自身环化后转化的细菌为兰色噬菌斑或菌落（二）分析重组子结构特征的筛选法1. 快速裂解菌落鉴定分子大小 从平板中直接挑取菌落裂

33、解后，不需要内切酶消化，直接进行凝胶电泳，与载体DNA比较迁移率，初步判断是否有插入片段存在，本方法适用于插入片段较大的重组子初步筛选。2. 内切酶图谱鉴定对于初步筛选鉴定具有重组子的菌落，应小量培养后，再分离出重组质粒或重组噬菌体DNA ，用相应的内切酶（1种或2种）切割重组子释放出插入片段，对于可能存在双向插入的重组子，还要用内切酶消化鉴定插入方向，然后凝胶电泳检测插入片段和载体的大小3. Southern印迹杂交为了进一步确定DNA插入片段的正确性，在内切酶消化重组子，凝胶电泳分离后，通过Southern印迹转移将DNA移至硝酸纤维膜上，再用放射性核素或非放射性标记的相应外源DNA片段作

34、为探针，进行分子杂交，鉴定重组子中的插入片段是否是所需的靶基因片段。 4. PCR筛选重组子 一些载体的外源DNA插入位点两侧，存在恒定的序列，用相应的引物对小量抽提的质粒DNA进行PCR分析，不但可迅速扩增插入片段，而且可以直接进行DNA顺序分析。5. 菌落（或噬菌斑）原位杂交 菌落或噬菌斑原位杂交技术是先将转化菌直接铺在硝酸纤维素薄膜或琼脂平板上，再转移到另一硝酸纤维素薄膜上，用核素标记的特异DNA或RNA探针进行分子杂交，然后挑选阳性克隆菌落。用原核生物表达真核基因时，引用哪些措施提高表达水平？（一）提高翻译水平1. 调整SD序列与ATG之间的距离 SD顺序与ATG的距离不同，IL-2表

35、达水平可相差22000倍。2. 用点突变的方法改变某些碱基 紧随起始密码下游的几组密码子不同，可使基因的表达效率相差1520倍。 另外，在不改变编码的氨基酸顺序的条件下，尽量用强密码子取代弱密码子，确有可能提高表达水平。3. 增加mRNA的稳定性 多数情况下，细菌mRNA的半哀期短，仅为12分钟，而外源基因mRNA的半衰期可能更短。若能增加mRNA的稳定性，则有可能提高外源基因的表达水平。（二）减轻细胞的代谢负荷1. 表达载体的诱导复制 减轻宿主细胞代谢负荷的一个重要措施，是当宿主菌生物量积累到一定水平后，再诱导细胞中质粒DNA的复制。2. 诱导表达将宿主菌的生长和外源基因的表达分开成为两个阶段，是减轻宿主细胞代谢负荷最常用的方法（三）提高表达蛋白的稳定性 在大肠杆菌中表达的外源蛋白往往不够稳定，常被细菌的蛋白酶降解，因而会使外源基因的表达水平大大降低。因此，提高表达蛋白的稳定性，防止细菌蛋白酶的降解是提高外源基因表达水平的有力措施1. 表达融合蛋白 2. 采用某种突变菌株保护表达蛋白 大肠杆菌蛋白酶