凝胶过滤层析法测定蛋白质分子量

1、第一页，共20页。 掌握凝胶层析的基本原理掌握凝胶层析的基本原理 学习利用凝胶层析法测定蛋白质相对分子质量学习利用凝胶层析法测定蛋白质相对分子质量的实验技能的实验技能第二页，共20页。 第三页，共20页。第四页，共20页。 第五页，共20页。洗脱体积洗脱体积第六页，共20页。 洗脱体积洗脱体积（V Ve e）是指将样品中某一组分洗脱下来所需洗脱液的体是指将样品中某一组分洗脱下来所需洗脱液的体积。积。它包括自加入样品时算起，到组分最大浓度出现时所流出它包括自加入样品时算起，到组分最大浓度出现时所流出的体积。的体积。 V Ve e一般是介于一般是介于V Vo o 和和之间的。之间的。 对于对于完全

2、排阻完全排阻的大分子由于其不进入凝胶颗粒内，的大分子由于其不进入凝胶颗粒内， 故其洗脱体积故其洗脱体积 V Ve e V Vo o 对于对于完全渗透完全渗透的小分子由于它可以存在于凝胶柱整个体积内，的小分子由于它可以存在于凝胶柱整个体积内，故其洗脱体积故其洗脱体积 V Ve e 分子量介于二者之间的分子，它们的洗脱体积也介于二者之分子量介于二者之间的分子，它们的洗脱体积也介于二者之间。间。第七页，共20页。第八页，共20页。可以通过测定可以通过测定完全排阻完全排阻的大分子物质的洗的大分子物质的洗脱体积来测定，一般常用脱体积来测定，一般常用作为作为测定测定。可以通过测定可以通过测定的小分子溶质的

3、小分子溶质的洗脱体积来测定的洗脱体积来测定 即即 V Ve eV Vo oV Vi i 推出推出 V Vi i V Ve e V Vo o可用下式计算：可用下式计算： VtVt（D/2D/2）2 2h h 2 2）根据）根据 VtVtV Vo oV Vi i 可以得到可以得到 3 3）加入一定量的水至层析柱预定标记处，然后测量水的体）加入一定量的水至层析柱预定标记处，然后测量水的体积积。第九页，共20页。 表示某个组分在内水体积和在外水体积中的浓度分配表示某个组分在内水体积和在外水体积中的浓度分配关系。关系。 V Vo o 和和V Ve e 就可以得到这就可以得到这个个在一定的条件下，在一定的

4、条件下，V Vt t和和V Vo o都是恒定值。都是恒定值。 大分子大分子先从柱中流出先从柱中流出V Ve e值值小小K Kavav值值小小 小分子小分子后从柱中流出后从柱中流出V Ve e值值大大K Kavav值值大大K Kavav V Ve e V Vo oV Vt t V Vo o K Kavav值的大小和凝胶柱床的总体积（值的大小和凝胶柱床的总体积（V Vt t）、外水体积（）、外水体积（V Vo o）以）以及分离物本身的洗脱体积（及分离物本身的洗脱体积（V Ve e）有关。）有关。第十页，共20页。 对于对于的大分子的大分子 V Ve e V Vo o 故故 对于对于的小分子的小分子

5、 V Ve e V Vt t 故故 K Kavav 1 1 K Kavav是判断分离效果的一个重要参数，同时也是测定蛋白质分是判断分离效果的一个重要参数，同时也是测定蛋白质分子质量的一个依据。子质量的一个依据。 对于某一型号的凝胶，在一定的分子质量范围内，各对于某一型号的凝胶，在一定的分子质量范围内，各个组分的个组分的K Kavav与其与其分子质量的对数成线性关系：分子质量的对数成线性关系： K Kavav b blglgM Mr+r+c c 由于由于V Ve e 和和K Kavav也成线性关系所以同样有：也成线性关系所以同样有： V Ve e bblglgM Mr+r+cc第十一页，共20页

6、。 通过将一些已知分子质量的标准蛋白质在同一凝胶通过将一些已知分子质量的标准蛋白质在同一凝胶柱上以相同条件进行洗脱，分别测定柱上以相同条件进行洗脱，分别测定V Ve e 或或K Kavav，并根据并根据上述的线性关系绘出标准曲线，然后上述的线性关系绘出标准曲线，然后V Ve e 或或K Kavav，通过标准曲线即可求出其通过标准曲线即可求出其分子质量。分子质量。第十二页，共20页。吸水率是指吸水率是指1g1g干的凝胶吸收水的体积或者重量干的凝胶吸收水的体积或者重量，但它不包括颗粒间，但它不包括颗粒间吸附的水份。所以它不能表示凝胶装柱后的体积。吸附的水份。所以它不能表示凝胶装柱后的体积。Seph

7、adex G-Sephadex G-2525200 200 数字是吸水率数字是吸水率1010 例如例如Sephadex G-75 Sephadex G-75 吸水率吸水率 7.57.5ml/g ml/g 床体积指床体积指1g1g干的凝胶吸收水后的最终体积干的凝胶吸收水后的最终体积 例如例如SephadexSephadexG-75 G-75 床体积床体积 121215 ml/g15 ml/g 干胶用量干胶用量(g) = (g) = 柱柱(ml)(ml)床体积床体积/ /凝胶床体积凝胶床体积(ml/g)(ml/g)第十三页，共20页。第十四页，共20页。取取110mL Sephadex G-751

8、10mL Sephadex G-75于于250 mL250 mL烧杯中，加入洗脱液烧杯中，加入洗脱液100mL100mL，在沸水浴中煮沸，在沸水浴中煮沸1h1h，冷却至室温后抽真空脱去颗粒空隙，冷却至室温后抽真空脱去颗粒空隙中的空气。中的空气。 取洁净的玻璃层析柱垂直固定在铁架台上。取洁净的玻璃层析柱垂直固定在铁架台上。 凝胶柱床总体积（凝胶柱床总体积（）的测定：在距柱上端约）的测定：在距柱上端约5 5处作一记号，关闭柱出水口，加入蒸馏水，打开出水口，处作一记号，关闭柱出水口，加入蒸馏水，打开出水口，液面降至柱记号处即关闭出水口，然后用量筒接收柱中蒸液面降至柱记号处即关闭出水口，然后用量筒接收

9、柱中蒸馏水，读出的体积即为柱床总体积馏水，读出的体积即为柱床总体积 。第十五页，共20页。 第十六页，共20页。打开柱上端的塞子，待柱内洗脱液下降至与凝胶胶面打开柱上端的塞子，待柱内洗脱液下降至与凝胶胶面相切时，关闭出水口。用细滴管吸取相切时，关闭出水口。用细滴管吸取1 mL1 mL蓝色葡聚糖蓝色葡聚糖液，小心地绕柱壁一圈液，小心地绕柱壁一圈（缓慢加入，缓慢加入，打开出水口打开出水口，待溶液完全渗入柱床后，关，待溶液完全渗入柱床后，关闭出水口，取闭出水口，取洗脱液沿管壁洗柱一次，等溶液完全渗洗脱液沿管壁洗柱一次，等溶液完全渗入柱床，柱上端再加入几毫升洗脱液，将柱上端接口与储入柱床，柱上端再加入

10、几毫升洗脱液，将柱上端接口与储液瓶连接，打开出水口，开始洗脱。液瓶连接，打开出水口，开始洗脱。收集收集洗脱峰洗脱峰，测出洗脱体积，测出洗脱体积V Ve e ，得出得出第十七页，共20页。 用洗脱液配制标准蛋白质溶液（用洗脱液配制标准蛋白质溶液（牛血清蛋白、鸡卵清蛋白、牛血清蛋白、鸡卵清蛋白、溶菌酶）。溶菌酶）。 按上述方法按上述方法加入加入1mL1mL标准蛋白质混合液，以标准蛋白质混合液，以3mL/10min 3mL/10min 的速的速度洗脱并收集洗脱液体积。度洗脱并收集洗脱液体积。（灵敏度灵敏度0.2A0.2A），测量它），测量它们的洗脱体积们的洗脱体积V Ve e。计算出各标准蛋白质的计算出各标准蛋白质的值。值。以以KavKav值为横坐标，标准蛋白质值为横坐标，标准蛋白质lglgMrMr为纵坐标，绘出标准曲线。为纵坐标，绘出标准曲线。第十八页，共20页。将待测将待测配制成配制成5mg/mL5mg/mL溶液溶液, ,以下以下步骤完全按照标准曲线的条件操作。根据紫外检测的洗步骤完全按照标准曲线的条件操作。根据紫外检测的洗脱峰位置，量出洗脱体