复旦大学医学分子病毒学

1、2013年复旦大学研究生医学分子病毒学试题1. 简述病毒的生活周期（包括复制机制）。（20分）答：病毒的生活周期可分为两个阶段：一个是细胞外阶段，以成熟的病毒粒子形式在；另一个是细胞内阶段，即感染阶段，在此阶段中进行复制和繁殖。感染阶段开始时，病毒的遗传物质由衣壳中释放出来，注入宿主细胞中，然后在病毒核酸信息的指导控制下，形成新的病毒粒子。 病毒的复制过程其大致可分为连续的五个阶段：吸附、穿入、脱壳、生物合成、病毒的装配与释放（一次性释放、出芽释放）。 （一）吸附 吸附是指病毒附着于敏感细胞的表面，它是感染的起始期。细胞与病毒相互作用最初是偶然碰撞和静电作用，这是可逆的联结。随后的特异性吸附是

2、非常重要的，根据这一点可确定许多病毒的宿主范围，不吸附就不能引起感染。 （二）穿入 穿入是指病毒核酸或感染性核衣壳穿过细胞进入胞浆，开始病毒感染的细胞内期。 主要有三种方式：（1）融合，在细胞膜表面病毒囊膜与细胞膜融合，病毒的核衣壳进入胞浆。（2）胞饮，由于细胞膜内陷整个病毒被吞饮入胞内形成囊泡。胞饮是病毒穿入的常见方式，也是哺乳动物细胞本身具有一种摄取各种营养物质和激素的方式。当病毒与受体结合后，在细胞膜的特殊区域与病毒一起内陷形成膜性囊泡，此时病毒在胞浆中仍被胞膜覆盖。（3）直接进入，某些无囊膜病毒，病毒核酸可直接穿越细胞膜到细胞浆中，而大部分蛋白衣壳仍留在胞膜外，这种进入的方式较为少见。

3、 （三）脱壳穿入和脱壳是延续的过程，失去病毒体的完整性被称为“脱壳”。脱壳到出现新的感染病毒之间叫“隐蔽期”。经胞饮进入细胞的病毒，衣壳可被吞噬体中的溶酶体酶降解而去除。有的病毒，如脊髓灰质炎病毒，在吸附穿入细胞的过程中病毒的RNA释放到胞浆中。而痘苗病毒当其复杂的核心结构进入胞浆中后，随之病毒体多聚酶活化，合成病毒脱壳所需要的酶，完成脱壳。 （四）生物合成包括病毒核酸的复制和蛋白质的生物合成。病毒侵入敏感细胞后，将核酸释放于细胞中，此时，该病毒粒子已不存在，并失去了原有的感染性，开始了核酸复制与蛋白质合成。在宿主细胞内，病毒基因组从核衣壳中释放后，首先转录早期基因，合成它们的早期mRNA，与

4、宿主多聚核糖体结合翻译成早期蛋白。一部分是抑制蛋白，可封闭宿主的正常代谢，使细胞转向有利于合成病毒，如分解宿主DNA的DNA酶。一部分作为病毒生物合成所必需的复制酶，如复制病毒DNA的DNA聚合酶，用以复制子代基因组。基因组复制完成后，在早期基因产物作用下，晚期基因转录产生晚期mRNA，经晚期翻译产生成熟病毒衣壳蛋白及其它结构蛋白，还有在病毒装配中所需的非结构蛋白，如各种装配蛋白、溶菌酶等。 (五) 装配与释放DNA病毒 (多数核内装配)；RNA病毒(多数胞浆内装配) 包膜病毒 (出芽释放)；无包膜病毒(破胞释放)新合成的病毒核酸和病毒结构蛋白在感染细胞内组合成病毒颗粒的过程称为装配，而从细胞

5、内转移到细胞外的过程为释放(Release)。大多数DNA病毒，在核内复制DNA，在胞浆内合成蛋白质，转入核内装配成熟。而痘苗病毒其全部成份及装配均在胞浆内完成。RNA病毒多在胞浆内复制核酸及合成蛋白。感染后6个小时，一个细胞可产生多达10，000个病毒颗粒。病毒装配成熟后释放的方式有：（1）宿主细胞裂解，病毒释放到周围环境中，见于无囊膜病毒，如腺病毒、脊髓灰质炎病毒等；（2）以出芽的方式释放，见于有囊膜病毒，如疱疹病毒在核膜上获得囊膜，流感病毒在细胞膜上获得囊膜而成熟，然后以出芽方式释放出成熟病毒。也可通过细胞间桥或细胞融合邻近的细胞。病毒复制周期图2. 简述疫苗的种类（包括临床上使用的和研

6、究中的疫苗）及其各自的优缺点（举例说明）。（20分）答：1.活疫苗 是指通过用人工诱变获得的弱毒株或自然减弱的天然弱毒株，或者是异源弱毒株所制成的疫苗。例如，如小儿麻痹、脊髓灰质炎、麻疹、BCG(卡介苗)等疫苗皆是。 （1）活疫苗（减毒活疫苗、活疫苗）的优点1） 免疫效果好。激活所有的免疫应答。免疫应答针对所有的保护性抗原。免疫力持久，具交叉反应。接种活疫苗后，活疫苗在一定时间内，在动物机体内有一定的生长繁殖能力，机体犹如发生一次轻微的感染，所以活疫苗用量较少，而机体所获得的免疫力比较坚强持久。2）接种途径多。可通过滴鼻、点眼、饮水、口服、气雾等途径看，刺激机体产生细胞免疫、体液免疫和局部黏膜

7、免疫。 （2）活疫苗的缺点1）可能出现毒力返强。一般来说，活疫苗弱毒株的遗传性状比较稳定，但由于反复接种传代，可能出现病毒返祖现象，造成毒力增强。2）贮存、运输要求条件高。一般冷冻干燥活疫苗，需零下15以下贮藏、运输。因此，必须具有贮藏、运输设施，进行贮藏、运输，才能保证疫苗质量。3）免疫效果受免疫动物用药状况影响。疫苗接种后，疫苗菌毒株在在机体内有效增殖，才能刺激机体产生免疫保护力，如果免疫动物在此期间用药，就会影响免疫效果。4）回复突变。5）疫苗株可传播。6）对免疫缺陷病人致病性。7）潜在可能会被污染。 2.灭活疫苗 是用免疫原性良好的细菌、病毒等病原微生物经工人培养后，用物理或化学方法将

8、其杀死（灭活），使其传染因子被破坏而仍保留其免疫原性所制成的疫苗。如百日咳、乙型脑炎、流行感冒等疫苗皆是。 （1）灭活疫苗的优点1）安全性能好，一般不会有散毒和毒力返祖的危险。2）一般只需在28贮藏和运输条件，易于贮藏和运输。3）受母源抗体干扰小。4）抗原成分明确。5）足够的体液免疫应答。6）无回复突变。7）可用于免疫缺陷者。8）适合于热带地区。 （2）灭活疫苗的缺点1）接种途径少。主要通过皮下或肌肉注射进行免疫。2）产生免疫保护所需时间长。由于，灭活疫苗在动物体内部能繁殖，因而接种剂量较大，产生免疫力较慢，通常需要23周后才能产生免疫力，故不适于用作紧急预防免疫。3）疫苗吸收慢，注射部位易形

9、成结节，影响肉的品质。4）有无反应者。5）需配合优良佐剂使用。6）局部反应常见。7）需要加强免疫。8）免疫力不持久。9）无局部黏膜免疫。10）昂贵。11）潜在灭活失败。 3.类毒素：白喉、破伤风的疫苗即属此类。将细菌在生长繁殖中产生的外毒素，用适当浓度的甲醛溶液处理后，其毒性消失而保留其免疫原性，称为类毒素。类毒素经过盐析并加入适量的磷酸铝或氢氧化铝胶等，即为吸附精制类毒素，注入动物体内吸收较慢，可较久的刺激机体产生高低度抗体以增强免疫效果。如破伤风类毒素，注射一次免疫期一年，第二年再注射一次，免疫期可达四年。 4.新型疫苗新型疫苗是采用生物化学合成技术、人工变异技术、分子微生物学技术、基因工

10、程技术等现代微生物技术制造出的疫苗。包括基因工程亚单位疫苗、结合疫苗、合成肽疫苗、基因工程载体疫苗、DNA疫苗(免疫应答谱广、诱导细胞免疫应答，但也存在一些问题，比如：潜在的质粒整合到宿主基因组导致插入突变、诱导自身免疫反应、诱导免疫耐受)、抗独特型疫苗等。新型疫苗具有诱导全面免疫应答的高效力,而且具有性质稳定、制作方便、成本低廉和不受抗体干扰等其他疫苗所不具备的一系列优点,同时在安全性、保护效率和免疫耐受等方面也面临着许多挑战。3. 简述干扰素分类及其作用机制的异同点。（20分）答：1）干扰素的分类 是指动物机体细胞，在干扰素诱生剂作用下，产生的一组低分子量的具有抗病毒、抗肿瘤、免疫调节作用

11、等高度生物学功能的糖蛋白。它是细胞基因组自我稳定的反应产物，能调节细胞功能，防御外来物质尤其是核酸的入侵，维持细胞的正常生理状态。干扰素是诱生蛋白，正常细胞一般不自发产生干扰素，只存在合成干扰素的潜能，干扰素的基因处于被抑制的静止状态。根据干扰素的来源、生物学性质及活性可分为以下三大类： 1型干扰素 型干扰素包括IFN-、IFN-、IFN-、IFN-和IFN-等。IFN-主要由单核-巨噬细胞产生，此外B细胞和成纤维细胞也能合成IFN-；IFN-主要由成纤维细胞产生。它们具有相似的生物学活性，结合相同的细胞受体。IFN-/二者结合相同受体，分布广泛，包括单核-巨噬细胞、多形核白细胞、B细胞、T细

12、胞、血小板、上皮细胞、内皮细胞与肿瘤细胞等。 2型干扰素 型干扰素即干扰素，主要由活化的T细胞（包括Th0、TH1细胞和几乎所有的CD8+T细胞）和NK细胞产生，IFN-可以以细胞外基质相连的形式存在，故通过旁邻方式控制细胞生长，其可以分布在除成熟红细胞以外的几乎所有细胞表面。在基因方面，IFN-有17个以上不同的基因编码，IFN-和IFN-的基因均只有1个。型干扰素可以耐受pH值为2.0的处理或601h的加温，而型干扰素则可被这种处理灭活。可以用盐酸将样品的pH值调节到2.0，处理25h后再恢复到中性；或将样品在水浴中加温至60，处理1h，这样就灭活了型干扰素，从而可区分型和型干扰素。 3.

13、 III型干扰素 III型干扰素即干扰素，主要由什么细胞产生目前还不清楚。有的研究表明干扰素-是干扰素家族的新成员，包括IFN-1，IFN-2和IFN-3，主要在抗原提呈细胞中表达。2） 作用机制的异同点：1抗病毒作用：型干扰素的抗病毒作用较强，而型干扰素则具有较强的抑制肿瘤细胞增殖和免疫调节作用。型干扰素具有广谱的抗病毒活性，对多种病毒如DNA病毒和RNA病毒均有抑制作用；但这种效应不是直接的，而是通过对宿主细胞的作用引起的。对干扰素敏感的细胞表面存在于干扰素受体，核内有“抗病毒蛋白”基因，受干扰素作用后该基因活化，产生的抗病毒蛋白可阻止病毒mRNA翻译，并促进病毒mRNA降解。干扰素能提高

14、细胞表面MHC类分子的表达水平，受到病毒感染的细胞表面MHC类分子的增加有助于向Tc细胞递呈抗原，引起靶细胞的溶解。干扰素可增强NK细胞对病毒感染的杀伤能力。而型干扰素相对较弱。 2抗肿瘤作用：型干扰素能抑制细胞的DNA合成，减慢细胞的有丝分裂速度；这种抑制作用有明显的选择性，对肿瘤细胞的作用比对正常细胞的作用强5001000倍。另外，型干扰素也可通过增强机体免疫机制、加强免疫监督功能来实现其抗肿瘤效应。 3. 控制细胞凋亡：型和型均能诱导细胞凋亡， I F N 调节的转录因子如 ST AT、 I RF 家族是这些作用的重要介导因子。I F N - 可以通过依赖或非依赖于 P 53 的路径，抑

15、制细胞周期进程，促进细胞凋亡。许多研究表明 型与 型 I F N 均能诱导T NF - 与 T R AI L 的产生和分泌，共同增强细胞的死亡。在某种条件下， I F N 还有抑制细胞凋亡的作用，如 I F N - 、 I F N - 均能增强 B 淋巴细胞白血病细胞的存活， 可能是由于上调了抗凋亡蛋白 Bcl - 2。某些I F N 诱导基因，如 p202，可能具有抗凋亡的作用。 型 I F N 活化 NF - B 的能力可能对于细胞的存活发挥关键作用，而 NF - B 家族的转录因子能够保护细胞免受多种凋亡刺激诱导的凋亡。 磷脂酰激酶 3 激酶( PI 3 - K ) 路径也被认为与 型

16、I F N 诱导的 B 细胞 、活化 T 细胞 、中性粒细胞的存活有关。最近研究认为， I F N - 处理后的细胞是存活 、增生还是死亡决定于 I F N - 受体表达水平的不同。高水平 I F NG R - 2 表达更容易导致细胞的凋亡， 这可能由于细胞表面配体- 受体相互作用程度的不同导致细胞内产生了不同的信号。 4.免疫调节作用干扰素的免疫调节作用表现在对宿主免疫细胞活性的影响，如对巨噬细胞、T细胞、B细胞和NK细胞等均有一定作用。 5.与型干扰素相比，型干扰素在抗病毒、抗肿瘤方面的作用与I型干扰素的类似，但作用较弱；但型有较强的免疫调节作用：促进APC(s)表达MHC类分子，提高抗原

17、递呈能力；促进MHCI类分子表达，增强NK细胞和Tc细胞的杀伤活性；抑制THO细胞向TH2细胞转化，同时抑制TH2细胞合成分泌细胞因子，对体液免疫应答产生下调作用；诱导血管内皮细胞表达ICAM-1，促进白细胞穿过血管到达炎症区域。6.有研究表明：干扰素(IFN-)是具有抗病毒活性的细胞因子,含有型IFN的生物学功能。4.病毒持续性感染是病毒学研究中的重大问题，据您所知，近十年来，该领域研究有哪些重要进展？（20分）答：1）现况（1）急性感染恢复后出现晚期并发症这是一类较少见的持续性感染, 主要为麻疹感染晚期出现的亚急性硬化性全脑炎( SSPE )。对这类感染的研究提示, 在一些微生物持续感染过

18、程中有可能累及神经元, 而在神经元中潜伏的病毒可致宿主细胞发生变化, 并提供微生物基因组在细胞中持续存在的条件。鉴于目前有相当一部分病因不明神经系统感染患者的脑组织检出有病变; 如果对脑组织做多种病原微生物基因的检测, 可能会发现一些新的病原微生物引起的持续性感染。（2）潜伏感染这类感染的特点为机体表现为临床急性感染痊愈后,微生物或其基因组(或基因)潜伏于某一部位, 一般不能用常规方法检出。在一定条件下, 潜伏的微生物可被激活而出现临床症状。如单疱疹病毒、水痘- 带状疱疹病毒、巨细胞病毒、EB病毒以及人类疱疹病毒6型均为可致潜伏感染的病原体。近日由于人免疫缺陷病毒(HIV)感染率的上升, 以及

19、器官移植技术、肿瘤化疗等的更多应用, 上述潜伏感染病毒的激活甚至可致残或致死。对于这一类感染的早期发现, 有些可用药物控制, 防止出现严重后遗症。（3）慢性感染：这类感染表现为病原微生物可持续存在于血液、组织或机体内的异物中, 并不断排出体外, 或经输血、器官移植或在机体免疫低下时引起疾病。一般微生物在不发病的间歇期可被检出。乙型肝炎及丙型肝炎为典型的慢性病毒感染。早期HIV感染也属于此类型的持续感染。在HIV 感染者出现症状前的几年甚至十几年, 其血液都具有传染性。这一类型的感染是公共卫生中的重大问题。（4）慢发性感染：慢发性感染是了解不多的一类,主要见于病毒逆转录病毒科中的慢病毒属(Len

20、tiv irus genus)与朊病毒( prion)。近来, 有一种疾病被称为慢性疲劳综合征(chronic fatigue syndrome)。患者多为青年, 表现为全身乏力、肌肉酸痛等。该综合征可能与EB病毒或肠道病毒引起的慢发性感染相关。朊病毒是一种非同寻常的致病因子, 有时也会被称为非常规性病毒。目前认为朊病毒是一类不可能检测出核酸, 但可以在动物或人体内传播的蛋白分子。由于用各种敏感的方法均未能检及致病因子有核酸, 学者用动物实验证明这一因子的传播主要是通过改变蛋白质的折叠构型而致病。2）机制（1）病毒基因变异,病毒基因整合至宿主基因组，病毒基因的表达被修饰或被抑制,出现缺损干扰病

21、毒颗粒(defective interfer ing particle, DIP)：（2）病原体干扰宿主免疫系统的正常功能：（3）宿主遗传因素（4）宿主免疫状态低下、异常或产生免疫耐受：3）成果（1）乙肝疫苗：预防性乙肝疫苗的问题已基本解决。目前含PreS的乙肝疫苗和新佐剂(如CpG)乙肝疫苗尚在研究，希望解决人群中10左右对现有乙肝疫苗(仅含S)无反应或低反应人群的免疫应答问题，同时希望用这种疫苗替代现有乙肝疫苗以提高免疫效果和进行治疗性疫苗研究。治疗性乙肝疫苗是目前乙肝疫苗研究的重点。具有我国自主知识产权的抗原一抗体复合物治疗性乙肝疫苗已完成期临床研究，该疫苗可诱发一定特异性细胞免疫反应，

22、该疫苗已申报期临床观察，进行效果评价。使用含B细胞和T细胞表位模拟基因(minogen)进行的多肽乙肝治疗性疫苗已完成IIa期临床研究，结果显示该疫苗在实验人体中产生高频率的CTL反应。我国的治疗性乙肝DNA疫苗也进行了I期临床研究。另外，尚有使用现有乙肝疫苗加淋巴因子和体外特异活化的树突细胞进行临床治疗的研究。（2）丙肝疫苗：国外使用非结构蛋白NS为靶抗原的重组疫苗在黑猩猩体内已证明有明显保护丙肝病毒样品攻击作用，提示丙肝疫苗很可能会研制成功。我国丙肝疫苗研究多集中在使用B细胞和T细胞多表位靶抗原基因工程疫苗和多抗原组合的重组设计及其免疫原性研究上，这些研究尚处于实验室阶段。（3）艾滋病疫苗

23、：是迄今为止疫苗学家碰到的最难研制的疫苗。20多年来，已有几十种疫苗进行了一百多个临床实验。特别是在泰国进行了两个期临床和Merk公司2007年终止的一个1I b期临床研究，均未显现出保护效果，使人们对近期研制成功艾滋病疫苗的期望跌到低谷。我国科学家使用DNA疫苗初免和痘苗病毒加强，使用非复制型痘苗病毒MVA加强的疫苗，使用我国复制型痘苗病毒天坛株痘苗病毒加强的疫苗正在进行临床研究；使用非复制型天坛株痘苗病毒加强的疫苗已完成了临床前研究，同源SHIV攻击在猴子中产生明显保护。这些研究仍属于“概念”性研究，可以最终用于疫苗产品研制的技术路线尚不清楚。另外，我国使用HIV核衣壳蛋白gag为靶抗原，

24、分别使用酵母和腺病毒载体研发的两种艾滋病治疗性疫苗。（4）人乳头瘤病毒疫苗：人乳头瘤病毒是性传播疾病，与宫颈癌密切相关。由于HPV很难培养又有潜在致癌作用，传统疫苗技术很难研制成功人乳头瘤疫苗。国际上已于近几年使用基因工程技术分别研制成功了杆状病毒和酵母表达的针对主要亚型HPVl618和HPVl618611的两种基因工程预防性疫苗，并已开始广泛使用。这是继使用基因工程乙肝疫苗替代传统血源乙肝疫苗后，第一个完全使用基因工程疫苗技术研制成功的新型人用疫苗。我国科学家采取新的技术路线，在大肠杆菌中表达了多种亚型的HPV保护性抗原基因L1，进行了新型HPV预防性疫苗的研究，该疫苗生产工艺简单、成本低，

25、可能成为新一代HPV疫苗料。使用HPV L2基因进行广谱HPV疫苗、使用HPV E6和E7进行的HPV感染和宫颈癌治疗型疫苗等的研究也在进行中。（5）2008年诺贝尔生理学或医学奖授予德国科学家哈拉尔德·楚尔·豪森及两名法国科学家弗朗索瓦丝·巴尔·西诺西和吕克·蒙塔尼。这3人帮助人类找到了导致宫颈癌和艾滋病这两大绝症的可怕病毒； （6）上海科研人员近日在艾滋病病毒型疫苗的研发上取得突破性成果，探索出新的疫苗制备方法，并首次在果蝇细胞上试验成功；（7）从靶细胞和机体两个水平探索病毒持续性感染的形成和维持机制；（8）从造血干细胞角度研究乙肝病毒持续

26、性感染机制；（9）各种新型疫苗的研发：如亚单位疫苗、基因疫苗等；5.简述病毒表面膜融合蛋白的类型与膜融合分子机制。（20分）答：1）病毒表面膜融合蛋白的类型：1.I类融合蛋白在电镜下可见到明显的“纤突”或刺突。 如：正粘病毒: HA0 HA1+HA2；（见下图）副粘病毒: F0 F1+F2；逆转录病毒: gp160 gp120+gp41 (HIV)；（见下图）冠状病毒: S S1+S2 (MHV)；纤丝病毒科：（见下图）GP GP1+GP2 (Ebola)等。2.II类融合蛋白不形成“纤突”,而是富含折叠结构, 如：黄病毒科: E protein (Dengue, YF, TBE, WN)； 披膜病毒科病毒属: E1 protein (Sindbis, Semliki Forest)等 。3.III类融合蛋白类病毒膜融合蛋白集合了/类融合蛋