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文档简介
1、 Partec - Excellence in Flow CytometryContributions to New Developments in Medical Diagnosis and Microbiology德国 Partec公司中国(zhn u)服务中心张向阳超过41年的研发(yn f)经验第一页,共五十四页。 Partec - Excellence in Flow Cytometry超过41年的研发(yn f)经验流式细胞仪的原理流式细胞仪的原理流式细胞仪使用一般方法流式细胞仪使用一般方法(fngf)及技巧及技巧第二页,共五十四页。 Partec - Excellence in
2、Flow Cytometry超过(chogu)41年的研发经验流式细胞术流式细胞分析,又称流式细胞术(flow cytometry,FCM),是以高能量激光照射高速流动状态下被荧光色素染色的单细胞或微粒,测量其产生的散射光和发射荧光的强度,从而对细胞(或微粒)的物理、生理(shngl)、生化、免疫、遗传、分子生物学性状及功能状态等进行定性或定量检测的一种现代细胞分析技术。他综合了激光技术、计算机技术、半导体技术、流体力学、细胞化学等各门学科。第三页,共五十四页。 Partec - Excellence in Flow Cytometry超过41年的研发(yn f)经验流式细胞术流式细胞分析,又
3、称流式细胞术(flow cytometry,FCM),是以高能量激光照射高速流动状态下被荧光色素染色的单细胞或微粒(wil),测量其产生的散射光和发射荧光的强度,从而对细胞(或微粒(wil))的物理、生理、生化、免疫、遗传、分子生物学性状及功能状态等进行定性或定量检测的一种现代细胞分析技术。他综合了激光技术、计算机技术、半导体技术、流体力学、细胞化学等各门学科。第四页,共五十四页。 Partec - Excellence in Flow Cytometry超过41年的研发(yn f)经验特点:(1)单细胞分析。(2)快速分析。(3)多参数相关测量。(4)定性或定量分析(dnglingfnx)细
4、胞。(5)统计学意义明显。 (6)分选。第五页,共五十四页。 Partec - Excellence in Flow Cytometry超过(chogu)41年的研发经验荧 光有些物质,当用光照射时,它吸收了该种波长的光后还会发射出各种颜色和不同强度的光,而当光停止照射后,这种发射的光也随之消失,这种发射的光称为荧光(fluorescence)。荧光的波长比吸收光线的波长要长些。由于物质的分子结构不同,所吸收的光和所发射的荧光波长也不同。被这些物质吸收的光称为激发光,产生的发射光即荧光。荧光的颜色多为红、蓝、绿或黄等。物质的荧光有两种,一种是自发性荧光,即组织在短波长光照射下自行发射出的荧光。
5、如,组织中的蛋白质和脂类在紫外线照射下能发射出微弱的淡蓝色荧光。另一种荧光是诱发荧光,即细胞与荧光色素结合后,经一定(ydng)波长的光线照射后发出的荧光。常用的是诱发荧光,能产生荧光的生物染色剂称为荧光染料(或称荧光色素)。第六页,共五十四页。 Partec - Excellence in Flow Cytometry超过(chogu)41年的研发经验荧光激发(jf)与发射原理能量(nngling)级激发激发态发射激光能量损失第七页,共五十四页。 Partec - Excellence in Flow Cytometry超过41年的研发(yn f)经验免疫荧光技术(jsh)免疫荧光技术是根据
6、抗原抗体反应的原理,先将已知的抗原或抗体标记上荧光素,制成荧光抗原或抗体,再用这种荧光抗体(或抗原)作为探针检测细胞表面或细胞内的相应抗原(或抗体)。从而使形成的抗原抗体复合物上含有标记的荧光素,利用流式细胞仪检测标本,荧光素受外来(wili)激发光的照射而发生明亮的荧光(如,黄、绿色或红色等),通过确定抗原或抗体的性质、定位来推断细胞的信息,以及利用定量技术测定含量。常用方法:单抗直接标记第八页,共五十四页。 Partec - Excellence in Flow Cytometry超过(chogu)41年的研发经验嵌入(qin r)性染料如DAPI、赫斯特、PI等,直接与细胞内的DNA双螺
7、旋结构(jigu)中的A-T碱基对结合,从而使细胞在激发光的照射下发特定波长的光,通过判断发射光的强弱来推算A-T碱基对的多少,从而得知DNA的倍性关系。第九页,共五十四页。 Partec - Excellence in Flow Cytometry超过(chogu)41年的研发经验细胞膜电位(din wi)、离子、脂类探针现已发现或开发出来了各种细胞膜电位、各类离子、pH值、脂类探针,运用(ynyng)这些探针在流式细胞仪上可轻易检测各种细胞功能,可实现一些意想不到的效果。详细信息,见细胞探针公司网站: www.molecularP第十页,共五十四页。 Partec - Excellence
8、 in Flow Cytometry超过(chogu)41年的研发经验与流式细胞仪相关的荧光(ynggung)术语MESF(Molecules of equivalent soluble fluorochrome)等量可溶性荧光分子:国际标准单位,用来衡量荧光强度自发荧光:细胞或颗粒在激发照射下会发出各种波长的荧光。白细胞自发荧光强度为6501150MESF,血小板及其他颗粒自发荧光更低流式细胞仪精度:分析(fnx)白细胞要求精度在600MESF以内,分析其他细胞或颗粒需要更高的精度:200MESF以内第十一页,共五十四页。 Partec - Excellence in Flow Cytome
9、try超过(chogu)41年的研发经验常见(chn jin)荧光染料列表染料名称激发波长(nm)最大发射波长(nm)应用抗体FITC488530一般应用PEARDI488/565575FITC及2重染色ECD488/565613多重免疫染色用PC5/PE-Cy5488/565/650670多重免疫染色用PC7/PE-Cy7488/565767多重免疫染色用Cy5633670多重免疫染色用APC650660多重免疫染色用DNA/RNAPl488/5366171色染色体、DNA细胞周期、除去死细胞YOYO-l491509DNA细胞周期、除去死细胞CPO488530/670DNA(530)/RNA
10、(670)、网织红细胞检测7-AAD546647G-C特异性、DNA细胞周期、除去死细胞SYTO16488518活细胞染色SYTOX Green504523DNA细胞周期TO-PRO-3642661除去死细胞DAPI360DNA细胞周期第十二页,共五十四页。 Partec - Excellence in Flow Cytometry超过(chogu)41年的研发经验常见(chn jin)荧光染料列表钙Fluo-3AAMA506525细胞内钙离子的检测Fura RedAAMA473670细胞内钙离子的检测pHBCECF (AM)488535细胞内pHSNARF-l (AM)488587A635细
11、胞内pH (pH6-9)酶Fluorecein495519与酶基质结合后使用、检测活细胞内酶活性Rhodamine-110497520与酶基质结合后使用、检测活细胞内酶活性其它CMFDA488530活细胞内水平检测、MDRRhodamine-123488530活细胞内线粒体、MDREGFP488510基因表达DiOC2 (3)488530细胞膜电位DiBAC4 (3)493516细胞膜电位DCFH-DA488530细胞内活性酶DHR505534细胞内活性酶FDA488530活细胞染色Calcein AM496517活细胞染色、乙啡叮 同型二聚体-1的双色检测判断细胞死活第十三页,共五十四页。
12、Partec - Excellence in Flow Cytometry超过(chogu)41年的研发经验常用荧光(ynggung)染料种类488nm蓝色激光激发: FITC(异硫氰酸荧光素):绿色 530nm PE(藻红蛋白(dnbi)):橙黄色 575nm PE-Cy5(PE的衍生物):红色 665nm PerCP(多甲藻黄素叶绿素蛋白):红色675nm PI(碘化丙啶):橙红色 620nm637nm红色激光激发: APC(别藻兰蛋白):红色 665nm APC-Cy5(别藻兰蛋白的衍生物):深红色 710nm365nm紫外光激发: DAPI(4,6-咪基-2联苯吲哚):蓝色 455nm
13、532nm绿色激光激发: PE(藻红蛋白):橙黄色 575nm PE-Dy647 (PE的衍生物):红色 647nm PE-Cy5(PE的衍生物):红色 665nm第十四页,共五十四页。 Partec - Excellence in Flow Cytometry超过41年的研发(yn f)经验流式细胞仪的原理(yunl)概述流式细胞仪(Flow Cytometer 简称FCM)是一种自动分析细胞的高端技术设备,其原理是悬浮(xunf)在液体中的细胞一个个地依次通过测量区,当每个细胞通过测量区并被激发光照射时产生光信号,然后被光电倍增管(PMT)转化成电信号,这些信号可以代表荧光、普通光散射、光
14、吸收或细胞的阻抗等。这些信号可以被测量、存贮、显示,于是细胞的一系列重要的物理特征和生化特征就被快速地、大量地测定。上述特征可以是细胞的大小、活性,核酸的数量、酶、抗原等等。仪器还可以根据所规定的参量把指定的细胞亚群从整个群体中分选出来。废液检测器&计数器样品第十五页,共五十四页。 Partec - Excellence in Flow Cytometry超过41年的研发(yn f)经验流式细胞仪的原理流式细胞仪的原理(yunl)工作原理工作原理(yunl)待测细胞被制备成单个细胞的悬液,经特异性荧光染料染色后放入样品管中,在气体的压力下进入流动室。流动室内充满鞘液,在鞘液的约束下,细
15、胞排成单列由流动室的喷嘴喷出,成为细胞液柱。液柱与入射的激光束垂直相交,相交点称为测量区。通过(tnggu)测量区的细胞被激发产生荧光。在与入射光束和液柱垂直的方向放置光学系统(透镜、光阑,滤片和检测器等)用以收集荧光信号。光电倍增管将收集的光信号转化为电信号再传输至计算机,计算机通过(tnggu)相应的软件将电信号模拟成图像。流动室(Flow Cuvette或 Flow Cell)是仪器核心部件,被测样品在此与激光相交。流动室由石英玻璃制成,并在石英玻璃中央开一个孔径为350250um的长方形孔,供细胞单个流过,检测区在该孔的中心,这种流动室的光学特性良好,流速较慢,因而细胞受照时间长,可收
16、集的细胞信号光通量大,配上广角收集透镜,可获得很高的检测灵敏度和测量精度。流动室内充满了鞘液,鞘液的作用是将样品流环包。鞘液流是一种稳定流动的液体,操作人员无法随意改变其流动的速度,样品流在鞘流的环包下形成流体动力学聚焦,使样品流不会脱离液流的轴线方向,结合样品喷嘴的特殊结构,从而保证每个细胞通过激光照射区的时间相等,从而得到准确的细胞信息(散射光和荧光)。第十六页,共五十四页。 超过41年的研发(yn f)经验激光(jgung),如:488nmFL2 PESSCFSC液路电子元件部分(b fen)计算机FL3 PerCP, Cy5 FL1 FITC光学接收器第十七页,共五十四页。 Parte
17、c - Excellence in Flow Cytometry超过(chogu)41年的研发经验流式细胞仪的构造流式细胞仪的构造(guzo)流动室及液流驱动系统激光光源及光束(gungsh)形成系统光学系统(滤光片组)信号检测与存储系统显示、分析系统第十八页,共五十四页。 Partec - Excellence in Flow Cytometry超过41年的研发(yn f)经验激激 光光提供单波长、高强度及稳定性高的光照,是细胞微弱荧光快速分析的理想光源(gungyun),这是因为由于细胞的快速流动,每个细胞经过光照区的时间仅为微秒左右,每个细胞所携带荧光物质被激发出的荧光信号强弱,与被照射
18、的时间和激发光的强度有关,因此要求细胞必须达到足够的光照强度。激光光束在到达流动室前,先经过透镜,将其聚焦,形成几何尺寸约即短轴稍大于细胞的直径的光斑。这种椭园形光斑激光能量分布属正态分布;为保证样品中细胞是一个一个分别受到光照并且受照强度十分一致,须将样本流与激光束正交且相交于激光能量分布峰值处,台式机FCM的光路调节对用户是封闭的,即安装时由工程师调试完毕后,无需用户作任何调节, 所以用户操作十分方便。 第十九页,共五十四页。 Partec - Excellence in Flow Cytometry超过41年的研发(yn f)经验光学系统光学系统流式细胞仪的光学系统是由若干组透镜、滤光片
19、、小孔组成,它们分别将不同波长的荧光信号送入到不同的电子探测器。在流式细胞仪的光学系统中主要光学原件(yun jin)是滤光片,主要分为三类:长通滤片 LP短通滤片 SP带通滤片 BP第二十页,共五十四页。 Partec - Excellence in Flow Cytometry超过(chogu)41年的研发经验长通滤片长通滤片使特定(tdng)波长以上的光通过,特定(tdng)波长以下的不通过。如LP500滤片,将允许500 nm以上的光通过,而500 nm以下的光吸收或返回。第二十一页,共五十四页。 Partec - Excellence in Flow Cytometry超过(chog
20、u)41年的研发经验短通滤片与长通滤片相反,特定波长以下(yxi)的光通过,特定波长以上的光吸收或返回。第二十二页,共五十四页。 Partec - Excellence in Flow Cytometry超过(chogu)41年的研发经验带通滤片带通滤片可允许相当窄的一波长范围内光通过,一般(ybn)滤片上有两个数,一个为允许通过波长的中心值,另一为允许通过光波段的范围。如BP 500 / 50表示其允许通过波长范围为475nm525nm。第二十三页,共五十四页。 Partec - Excellence in Flow Cytometry超过(chogu)41年的研发经验信号(xnho)检测与
21、分析当细胞携带荧光素标记物,通过激光照射区时,受激光激发,产生代表(dibio)细胞内不同物质、不同波长的荧光信号,这些信号以细胞为中心,向空间360度立体角发射,产生散射光和荧光信号, 下图是以激发光光源波长488nm为例的示意图:第二十四页,共五十四页。 Partec - Excellence in Flow Cytometry超过(chogu)41年的研发经验1.散射光信号:散射光分为前向角散射( FSC ,Forward Scatter ) 和侧向角散射(SSC,Side Scatter),散射光不依赖任何细胞样品的制备技术(如染色),因此被称为细胞的物理参数(或称固有参数)。(1)前
22、向角散射:代表细胞体积大小,前向角散射与被测细胞的大小有关,确切说与细胞直径的平方密切相关,通常在FCM应用中,选取FSC作阈值,来排除样品中的各种( zhn)碎片及鞘液中的小颗粒,以避免对被测细胞的干扰。(2)侧向角散射:代表细胞内容物多少(或称为密度),侧向角散射是指与激光束正交900方向的散射光信号,侧向散射光对细胞膜、胞质、核膜的折射率更为敏感,可提供有关细胞内精细结构和颗粒性质的信息。2.荧光信号:当激光光束与细胞正交时,一般会产生两种荧光信号。一种是细胞自身(zshn)在激光照射下发出微弱的荧光信号,称为细胞自发荧光;另一种是经过特异荧光素标记细胞后,受激发照射得到的荧光信号,通过
23、对这类荧光信号的检测和定量分析就能了解所研究细胞参数的存在与定量。第二十五页,共五十四页。 Partec - Excellence in Flow Cytometry超过(chogu)41年的研发经验光电倍增管如何光电倍增管如何(rh)产生电压脉冲信号产生电压脉冲信号电压(diny)脉冲ttt电压脉冲电压脉冲1.2.3.第二十六页,共五十四页。 Partec - Excellence in Flow Cytometry超过(chogu)41年的研发经验高度高度(god)、宽度和面积、宽度和面积时间(shjin) (s)电压脉冲面积(A)脉冲高度 (H)脉冲宽度(W)400第二十七页,共五十四页
24、。 Partec - Excellence in Flow Cytometry超过41年的研发(yn f)经验脉冲信号脉冲信号(xnho)的宽度和面积通常用来辨别双粘体细胞的宽度和面积通常用来辨别双粘体细胞第二十八页,共五十四页。 Partec - Excellence in Flow Cytometry超过(chogu)41年的研发经验阈阈 值值阈值用来定义能够被光电倍增管识别(shbi)的最小或最大信号强度,低于阈值下限或高于阈值上限的信号将不被光电倍增管识别(shbi),也不在图形中显示。第二十九页,共五十四页。 Partec - Excellence in Flow Cytometry
25、超过(chogu)41年的研发经验荧光信号荧光信号(xnho)的线性测量和对数测量的线性测量和对数测量线性放大: 即放大器的输出与输入(shr)是线性关系,细胞DNA含量、RNA含量、总蛋白质含量等的测量一般选用线性放大测量。对数放大: 即放大器的输出成10倍关系,如果原来输出是1,当输入增大到原来10倍时,输出为2;当输入增大到原来100倍时输出是3等等。在免疫学样品中,细胞膜表面抗原的分布有时要差几十倍甚至几万倍。如果用线性放大将无法在一张图上清晰地将细胞阳性群、阴性群同时显示出来。 。第三十页,共五十四页。 Partec - Excellence in Flow Cytometry超过4
26、1年的研发(yn f)经验流式细胞仪数据格式FCS:帧校验序列(FCS)字段,通常为16位(2个字节长),也可以为4个字节。软件执行中可以通过预先协议采用32位FCS来提高差错检测效果。FCS 1.0 研发于1984年FCS 2.0 研发于1990年,兼容1.0格式FCS 3.0 研发于1997年,兼容前两者 支持(zhch)UNICODE文本 处理单个数据文件大于100MB第三十一页,共五十四页。 Partec - Excellence in Flow Cytometry超过41年的研发(yn f)经验FCS文件(wnjin)结构存储于3或4个片段中文件头信息:用于鉴别FCS文件,包含鉴别文
27、本文件片段的数值。文本信息:描述样品信息和状态(zhungti)的某些数值。数据:在文本信息中存储的数值的特殊格式。第三十二页,共五十四页。 Partec - Excellence in Flow Cytometry超过41年的研发(yn f)经验文 件 头 信 息(xnx):文本信息:第三十三页,共五十四页。 Partec - Excellence in Flow Cytometry超过41年的研发(yn f)经验参 数F S C / S S C /荧 光(ynggung):第一个细胞(xbo)第二个细胞最后一个细胞第三十四页,共五十四页。 Partec - Excellence in Fl
28、ow Cytometry超过(chogu)41年的研发经验数据显示(xinsh)的种类直方图 散点图 三维图第三十五页,共五十四页。 Partec - Excellence in Flow Cytometry超过41年的研发(yn f)经验直方图(用于单参数(cnsh)分析)横坐标,X轴表示(biosh)光强度,强度高的光信号靠右侧显示。纵坐标,Y轴表示数量累计,相同强度的光信号在同一横坐标点(通道)内向Y轴方向累计。FITCFITCFITCFITCFITCFITCFITCFITCFL1-FITCFITCFITC第三十六页,共五十四页。 Partec - Excellence in Flow
29、Cytometry超过41年的研发(yn f)经验散点图(用于双参数(cnsh)分析)横坐标,X轴表示光强度,强度高的光信号靠右侧(yu c)显示。纵坐标,Y轴表示光强度,强度高的光信号靠上侧显示。与X轴/Y轴平面900垂直相交,Z轴表示数量累计,相同强度的光信号在同一横/纵坐标点(X/Y轴通道)内向Z轴方向累计。第三十七页,共五十四页。 Partec - Excellence in Flow Cytometry超过41年的研发(yn f)经验什么(shn me)是Region?用户在显示的图形(txng)中限定一个区域或范围作为靶区域或范围叫做Region。在同一张图中可以设置多个Regio
30、n。 使感兴趣的簇独立。 对Region使用颜色可更好地描述该范围或区域。第三十八页,共五十四页。 Partec - Excellence in Flow Cytometry超过(chogu)41年的研发经验什么(shn me)是Gate?1.使用布尔数学体系的操作方法(逻辑学)定义一个或将多个Region进行联合叫做Gate。2.被定义的子集数据将被显示。3.被选定的子集将被计算机计算数据和显示状态。4.解除(jich)噪音信号并可以最终被存储在硬盘上。第三十九页,共五十四页。 Partec - Excellence in Flow Cytometry超过41年的研发(yn f)经验什么(s
31、hn me)是Mean?1.算术(sunsh)定义的平均值。2.几何定义的平均值。假设样品为V,数量为n,则:算术定义的平均值=(V1+V2+V3+Vn)/n几何定义的平均值=第四十页,共五十四页。 Partec - Excellence in Flow Cytometry超过(chogu)41年的研发经验如何(rh)取平均值?线性放大 对数(du sh)放大 对数(du sh)放大 算术平均值 算术平均值 几何平均值(4*64+6*128+2*192+1*256)/13 (4*10+6*100+2*1000+1*10000)/13 =128 =972.3 =100第四十一页,共五十四页。 P
32、artec - Excellence in Flow Cytometry超过41年的研发(yn f)经验光谱交叉重叠(chngdi)与补偿?当一种激光束激发(jf)两种荧光染料而发射出两种不同波长的荧光时,这两种发射光会出现光谱部分重叠的现象,从而造成检测的准确性下降,必须使用适当的滤片或进行电子补偿来尽量减少光重叠对实验的影响。 FL-1PMTFL-2 PMTFL-1 -% FL-2FL-2 -% FL-1第四十二页,共五十四页。 Partec - Excellence in Flow Cytometry超过41年的研发(yn f)经验未做补偿(bchng) R4/R1=41% R3/R1=
33、24.21% R2/R1=34.3%做补偿后 R4/R1=41.04% R3/R1=24.75% R2/R1=34.22%补偿,我们通常按照细胞聚集区的中心点来计算,但实际的原理是按细胞团的位置来定的,也就是纯粹按照计算得出的,比如上图的R4细胞团,它在X轴上的位置是0.3到1之间,在Y轴的位置是2到6之间,这团细胞平均值在FL1,FL2中的分部坐标为0.68,3.9;因此斜率为0.68/3.9=17.43,因此FL1的补偿后平均值为FL1-17.43%FL2=0.68-17.43%*3.9=0.0023,它的右侧区域应该在1-17.43%*3.9=0.32,左侧区域应该在0.3-17.43%
34、*3.9=-3.79,因为是负数,就自动归为0.1了,如果(rgu)是完全按照计算来做补偿,图形将很大一部分跑出了双参数图,也就是说无法得到我们满意的图形,但由于我们勾选了“Random Bias”,所有的图形将重新被分配,就像上图的Q1门中的显示一样。,我们通常按照细胞聚集区的中心点来计算,但实际的原理是按细胞团的平均值来计算。第四十三页,共五十四页。 Partec - Excellence in Flow Cytometry超过(chogu)41年的研发经验FL1-未染色(rns)FL2-未染色(rns)FL1-染色FL2-未染色FL1-FITC CD3补偿后平均值= 2.0 FL1-染色
35、FL2-未染色第四十四页,共五十四页。 Partec - Excellence in Flow Cytometry超过41年的研发(yn f)经验第四十五页,共五十四页。 Partec - Excellence in Flow Cytometry超过41年的研发(yn f)经验上机检测(jin c)样本染色及溶血过程处理完后应立即上机检测打开流式细胞仪 (选择进行质控程序)打开应用软件并选择相应(xingyng)的方案或新建方案加载或重新调节各参数上样检测流式细胞仪使用一般方法及技巧第四十六页,共五十四页。 Partec - Excellence in Flow Cytometry超过(chogu)41年的研发经验技巧一:定位目标(mbio)细胞群体寻找细胞群:如标本为外周血白细胞,在FSC/SSC散点图中信号最强的为粒细胞,依次为单核、淋巴、红细胞碎片。如寻找淋巴细胞,可首先调低FSC/SSC电压(diny)定位粒细胞后逐步调高电压(diny)依次寻找各细胞群。如标本中无明显特征细胞群,可使用已建淋巴细胞检测方案根据相对位置定位目标细胞群流式细胞仪使用一般方法及技巧第四十七页,共五十四
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