细胞冻存、解冻方法与细胞计数(虽基础但重要)

1、易读文库细胞冻存、解冻方法与细胞计数一、细胞冷冻保存1.材料：生长良好之培养细胞、新鲜培养基、DMSO(Sigma D-2650)、无菌塑料冷冻保存管(Nalgene 5000-0020)、0.4 % (w/v ) trypan blue(GibcoBRL15250-061)、血球计数盘与盖玻片、等速降温机(KRYO10SeriesII)2、冷冻保存方法：(1)传统方法：冷存管置于4 c 10分钟一-20C30分钟-一-80C 1618小时(或隔夜)-液氮槽vaporphase长期储存。-20 C不可超过1小时，以防止胞内冰晶过大，造成细胞大量死亡，亦可跳过此步骤直接放入-80 C冰箱中，惟存

2、活率稍微降低一些。(2)程序降温：利用已设定程序的等速降温机以-1-3C/分钟之速度由室温降至(-80 C以下)-120 C,再放在液氮槽vaporphase长期储存。适用于悬浮型细胞与hybridoma之保存。3、步骤：(1 )冷冻前24-48小时更换半量或全量培养基，使细胞处于指数生长期。(2)配制冷冻保存溶液(使用前配制)：另取一离心管，加入培养基、血清，逐滴加入二甲基亚碉(DMSO )至20%浓度，即制成双倍的冻存液，置于室温下待用。(3)离心收集培养之细胞，用加血清的培养基重悬起细胞，取少量细胞悬浮液(约0.1ml)计数细胞浓度及冻前存活率。(4)取与细胞悬液等量的冻存液，缓慢逐滴加

3、入细胞悬液，并晃动试管，制成细胞冻存悬液(DMSO最后浓度为510 %),使细胞浓度为 15X106cells/ml ,混合均匀，分装于已标示完全之冷冻保存管中,12ml/vial ,并取少量细胞悬浮液作污染检测。严密封口后，注明细胞名称、代数、日期。然后进行冻存。4、注意事项:(1)欲冷冻保存之细胞应在生长良好(logphase) 且存活率高之状态，约为 8090 %致密度。冷冻前检测细胞是否仍保有其特有性质，例如hybridoma应在冷冻保存前一至二日测试是否有抗体之产生。(2)细胞在液氮中可长期冻存无限时间，而不会影响细胞活力；在-70度可保存数月。(3)注意冷冻保护剂之品质。DMSO应

4、为试剂级等级，无菌且无色（以 0.22micronFGLP Telflon 过滤或是直接购买无菌产品，如SigmaD-2650),以510ml小体积分装，4 C避光保存，勿作多次解冻。Glycerol亦应为试剂级等级，以高压蒸汽灭菌后避光保存。在开启后一年内使用，因长期储存后对细胞会有毒性。本方法中先制备双倍冻存液，可避免DMSO直接加入时释放的热量对细胞的损伤。缓慢逐滴加入细胞悬液是使细胞逐步适应高渗，可降低细胞受损。DMSO可能引起部分白血病细胞株的分化，可换用10%甘油冻存。3X 106cells/ml(4)冷冻保存之细胞浓度: normal human fibroblast:1 hyb

5、ridoma:13X 106cells/ml,细胞浓度不要太高，某些 hybridoma会因冷冻浓度太高而在解冻24小时后死去。adherent tumor lines:5 7X 106 ,依细胞种类而异。Adenocarcinoma解冻后须较高之浓度，而HeLa 只需 1 3X 106cells/ml other suspensions:510X 106cells/ml , human lymphocyte须至少 5X 106cells/ml 。(5)冷冻保护剂浓度为 5或10 % DMSO ,若是不确定细胞之冷冻条件，在做冷冻保存之同时，亦应作一个backup culture ,以防止冷冻

6、失败。(6)冻存可用10%90%的血清，一般高浓度血清有助于维护细胞活力，此处介绍20% 终浓度有利于细胞悬浮而少沉积(4度时)，复苏存活率在80%90%以上，对原代培养细胞，以 90%血清冻存更为有效。二、冷冻细胞活化1、冷冻细胞之活化原则为快速解冻，以避免冰晶重新结晶而对细胞造成伤害，导致细胞之死亡。2、细胞活化后，约需数日，或继代一至二代，其细胞生长或特性表现才会恢复正常(例如产生单株抗体或是其它蛋白质)3、材料37 C恒温水槽、新鲜培养基、无菌吸管/离心管/培养瓶、液氮或干冰容器4、步骤：(1 )操作人员应戴防护面罩及手套，防止冷冻管可能爆裂之伤害。(2)自液氮或干冰容器中取出冷冻管，

7、检查盖子是否旋紧，由于热胀冷缩过程，此时盖子易松掉。(3)将新鲜培养基置于37 C水槽中回温，回温后喷以70%酒精并擦拭之，移入无菌操作台内(4)取出冷冻管，立即放入37 C水槽中快速解冻，轻摇冷冻管使其在1分钟内全部鬲化，以 70%酒精擦拭保存管外部，移入无菌操作台内。(5)取出解冻之细胞悬浮液，缓缓加入有培养基之培养容器内(稀释比例为1:101:15),混合均匀，放入 CO2培养箱培养。取 0.1ml解冻细胞悬浮液作存活测试。(6)解冻后是否立即去除冷冻保护剂(例如DMSO或glycerol),依细胞种类而异，一般而言，大都不需要立即去除冷冻保护剂。惟若要立即去除，则将解冻之细胞悬浮液加入

8、含有5-10ml培养基之离心管内，离心 1000rpm , 5分钟，移去上清液，加入新鲜培养基，混合均匀，放入 CO2培养箱培养。(7)若不需立即去除冷冻保存剂，则在解冻培养后隔日更换培养基。三、细胞计数与存活测试1、原理：(1)计算细胞数目可用血球计数盘或是Coultercounter粒子计数器自动计数。(2)血球计数盘一般有二个chambers ,每个chamber 中细刻9个1mm2 大正方形，其中 4个角落之正方形再细刻16个小格，深度均为 0.1mm 。当chamber 上方盖上盖玻片后，每个大正方形之体积为1mm2x 0.1mm=1.0x10-4ml。使用时，计数每个大正方形内之细

9、胞数目，乘以稀释倍数，再乘以 104 ,即为每ml中之细胞数目。(3)存活测试之步骤为dyeexclusion ,利用染料会渗入死细胞中而呈色，而活细胞因细胞膜完整，染料无法渗入而不会呈色。一般使用蓝色之trypan blue染料，如果细胞不易吸收trypan blue，则用红色之 Erythrosin bluish 。计算细胞活率：活细胞数/ (活细胞数+死细胞数)X100%。计数应在台盼兰染色后数分钟内完成，随时间延长，部分活细胞也开始摄取染料；因为台盼兰对蛋白质有很强的亲和力，用不含血清的稀释液，可以使染色计数更为准确。2、材料:0.4%w/v trypan blue(GibcoBRL1

10、5250-061) ; Erythosin bluish stain ;取 0.1gram Erythrosin bluish(SigmaE-9259) 及 0.05grampreservative methyl paraben(SigmaH-3647)溶于 100mlCa+/Mg+freesaline;血球计数盘及盖玻片(Hemocytometerandcoverslip);计数器(counter);低倍倒立显微镜；粒子计数器(Coultercounter,CoulterElectronics)白细胞稀释液(4%乙酸溶液)3、步骤:(1)取 50(j. 1 细胞悬浮液与 50(j. l tr

11、ypan blue(orErythrosinbluish)等体积混合均匀于1.5ml小离心管中(2)取少许混合液(约15nl)自血球计数盘chamber上方凹槽加入，盖上盖玻片，于 100倍倒立显微镜下观察，活细胞不染色，死细胞则为蓝色(或红色-Erythrosin bluish)。(3)计数四个大方格之细胞总数，再除 4,乘以稀释倍数(至少乘以2,因与trypanblue 等体积混合)，最后乘以104 ,即为每 ml中细胞悬浮液之细胞数。若细胞位于线上，只计上线与右线之细胞(或计下线与左线之细胞 )注：4大格细胞总数 x稀释倍数x 104/4= 细胞数/ml ;每一大格的体积=0.1cmx

12、0.1cmX 0.01cm=10-4ml计数板计数时，最适浓度为510X 105细胞/ml ,此范围外计数误差偏大。高浓度细胞悬液，可取出部分作稀释或连续稀释后计数。5、范例：T75 monolayer culture 制成10ml细胞悬浮液，取0.1ml溶液与0.1ml trypan blue混合均匀于试管中，取少许混合液加入血球计数盘，计数四大方格内之细胞数目。活细胞数/方格：55 , 62 , 49 , 59 ;死细胞数/方格：5, 3, 4, 6;细胞总数=243平均细胞数/方格=60.75 ;稀释倍数=2 ;细胞数/ml : 60.75 x 104X 2 (稀释倍数) =1.22 x

13、 106 ;细胞数/flask (10ml ) : 1.22 x 106X 10ml=12.2x 106存活率：225/243= 92.6%细胞冻存、解冻方法与细胞计数转载请注明来自丁香园文章来源：丁香园细胞技术讨论版发布日期:2006-08-14 11:28关键词：细胞冻存初解冻祖细胞计数吊一、细胞冷冻保存1、材料:生长良好之培养细胞、新鲜培养基、DMSO Sigma D-2650 )、无菌塑料冷冻保存管( Nalgene 5000-0020 )、0.4% ( w/v ) trypan blue (GibcoBRL15250-061 )、血球计数盘与盖玻片、等速降温机(KRYO10Serie

14、sII )。2、冷冻保存方法:(1)传统方法：冷存管置于4 C10分钟-20 C 30分钟-80 C 1618小时(或隔夜)-液氮槽vaporphase长期储存。-20 C不可超过1小时，以防止冰晶过大，造成细胞大量死亡，亦可跳过此步骤直接放入-80 冰箱中，惟存活率稍微降低一些。(2)程序降温：利用已设定程序的等速降温机以-1-3C/分钟之速度由室温降至(-80 C以下)-120C,再放在液氮槽 vaporphase长期储存。适用于悬浮型细胞与hybridoma之保存。3、步骤:(1)冷冻前一日前更换半量或全量培养基，观察细胞生长情形。(2)配制冷冻保存溶液(使用前配制)：将DMS口入新鲜培

15、养基中，最后浓度为510%,混合均匀，置于室温下待用。(3)依细胞继代培养之操作，收集培养之细胞，取少量细胞悬浮液(约0.1ml )计数细胞浓度及冻前存活率。(4)离心,去除上清液，加入适量冷冻保存溶液，使细胞浓度为15X 106cells/ml ,混合均匀，分装于已标示完全之冷冻保存管中,1ml/vial ,并取少量细胞悬浮液作污染检测。4、注意事项：(1)欲冷冻保存之细胞应在生长良好( logphase )且存活率高之状态，约为 80- 90%致密度。(2)冷冻前检测细胞是否仍保有其特有性质，例如 hybridoma应在冷冻保存前一至二日测试是否有抗体之产生。(3)注意冷冻保护剂之品质。D

16、MS应为试剂级等级，无菌且无色(以 0.22micron FGLP Telflon 过滤或是直接购买无菌产品，如 Sigma D-2650 ),以510ml小体积分装，4 c避光保存,勿作多次解冻。Glycerol亦应为试剂级等级，以高压蒸汽灭菌后避光保存。在开启后一年内使用，因长期储存后对细胞会有毒性。(4)冷冻保存之细胞浓度:，3X 106cells/ml normal human fibroblast:124小时后死去。HeLa 只需 13 x 106cells/mlbackup culture ,以防止冷冻失败。hybridoma : 13x 106cells/ml,细胞浓度不要太高，

17、某些 hybridoma会因冷冻浓度太高而在解冻adherent tumor lines : 57x106,依细胞种类而异。Adenocarcinoma 解冻后须较高之浓度，而other suspensions: 510x 106cells/ml , human lymphocyte 须至少 5X 106cells/ml(5)冷冻保护剂浓度为 5或10 %DMSO若是不确定细胞之冷冻条件，在做冷冻保存之同时，亦应作一个二、冷冻细胞活化1、冷冻细胞之活化原则为快速解冻，以避免冰晶重新结晶而对细胞造成伤害，导致细胞之死亡。2、细胞活化后，约需数日，或继代一至二代，其细胞生长或特性表现才会恢复正常(

18、例如产生单株抗体或是其它蛋白质)3、材料：37 c恒温水槽、新鲜培养基、无菌吸管/离心管/培养瓶、液氮或干冰容器。4、步骤:(1)操作人员应戴防护面罩及手套，防止冷冻管可能爆裂之伤害。(2)自液氮或干冰容器中取出冷冻管，检查盖子是否旋紧，由于热胀冷缩过程，此时盖子易松掉。(3)将新鲜培养基置于 37 c水槽中回温，回温后喷以70%酉精并擦拭之，移入无菌操作台内。(4)取出冷冻管,立即放入 37c水槽中快速解冻，轻摇冷冻管使其在1分钟内全部融化，以70%酒精擦拭保存管外部，移入无菌操作台内。(5)取出解冻之细胞悬浮液，缓缓加入有培养基之培养容器内(稀释比例为1: 101: 15),混合均匀，放入

19、 CO培养箱培养。取 0.1ml解冻细胞悬浮液作存活测试。(6)解冻后是否立即去除冷冻保护剂(例如DMSB glycerol ),依细胞种类而异，一般而言，大都不需要立即去除冷冻保护剂。惟若要立即去除，则将解冻之细胞悬浮液加入含有5-10ml培养基之离心管内，离心1000rpm, 5分钟，移去上清液，加入新鲜培养基，混合均匀，放入CO培养箱培养。(7)若不需立即去除冷冻保存剂，则在解冻培养后隔日更换培养基。三、细胞计数与存活测试1、原理：(1)计算细胞数目可用血球计数盘或是Coultercounter 粒子计数器自动计数。(2)血球计数盘一般有二个chambers,每个chamber中细刻9个

20、1mm大正方形,其中 4个角落之正方形再细刻16个小格，深度均为 0.1mm。当chamber上方盖上盖玻片后，每个大正方形之体积为1mrmx 0.1mm=1.0x10-4ml。使用时，计数每个大正方形内之细胞数目，乘以稀释倍数，再乘以104,即为每 ml中之细胞数目。(3)存活测试之步骤为dyeexclusion ,利用染料会渗入死细胞中而呈色，而活细胞因细胞膜完整，染料无法渗入而不会呈色。一般使用蓝色之trypan blue染料，如果细胞不易吸收trypan blue ,则用红色之 Erythrosin bluish 。2、材料：0.4%w/v trypan blue (GibcoBRL15250-061 ) ; Erythosin bluish stain ;取 0.1gram Erythrosin bluish (SigmaE-9259 )及 0.05gram preservative methyl paraben (SigmaH-3647 )溶于 100mlCa+/Mg+freesaline ;血球计数盘及盖玻片( Hemocytometerandcoverslip );计