RT-PCR实验步骤及注意事项

1、RT-PCR实验步骤及注意事项RT-PCR实验步骤及注意事项RT-PCR实验时间:2013-01-0522:32来源:www.B作者:生物界RT-PCR实验有三步：抽提RNA,RT,PCR。要求：1. 做RT前必需测RNA浓度,逆转录体系对RNA量还是有一些要求，常用500ng或lugo2. RT按要求做，一般不会出太大问题。3. PCR,按常规。但如需扩长片段，则对前两步要求较高，需要有完整的cDNA存在，不是单改变Mg2+浓度、退火温度能解决的。1. RT和PCR时的引物设计是不是一定要先知道目的基因的序列？必须在RT时，引物设计有3种方法即a：Random9mers；b：OligodT-

2、AdaptorPrimer；和c：特异的下游引物。如果用a和b方法，是扩增的所有的cDNA（理论上），还要用此产物做PCR的模板继续扩增。如果用c方法，那么要去那里查它的序列呢？问题：在做RT-PCR遇到一怪现象，即对同一动物不同组织扩增同一段基因，结果从一种组织中可以扩出我的目的基因，条带非常的好，而另一组织在同样的条件下却得到许多非特异性的条带，尝试其他条件同样无法得到满意的结果，百思不得其解！（注：已肯定该基因在两种组织中都表达，且内参照在两种组织都可扩增出来）从这两种组织中提取的RNA的量是不一样的，我测过吸光度，差异还很大，会不会和

3、这有关呢？请高手指教！解答：RT-PCR有两种做法.条件具备的话可用kit进行一步法进行；若条件不太好的话可分两步进行逆转录再PCR。但后来发现两步法的结果更加理想，条带特异性强且无拖尾现象，我推测是体系更加单一比较利于PCR的进行，当然也可能是我买的kit不太好。（promega）o2. RT-PCR应具备的条件高质量的RNA（保留后可做5S3'RACE）；引物的（最好产物短点）：若涉及粗略定量的话还应考虑RNA的浓度或是cDNA的浓度（如果由内标分子更好，但我发现其实很不容易将RNA的浓度以及内标分子的表达量调整的完全一样）；体系的均一性等。3. RACE我做过RACE（3RACE

4、是宝生物的Kit；5'RACE是Gibico）,但现在再进行另一个同源基因的3'RACE时却怎么也P不出来，这两个基因是由同一对引物扩增出来的，其中一个已经获得了全序列（RACE的方法），而另一个基因的3'UTR却增么也扩不出来，我推测是不是该基因的3FTR太长的缘故，我都快绿了，有无RT-PCR的常用内标b-actin和GAPDH的使用有选择性吗？比如不同的细胞，不同的刺激。有关内参：RT-PCR内参照可以在一个管子里做（那样也是图好看一些），最好分开两管，把除了引物之外的mixture统一配，拍照后，算目的基因和内参的比值，这就是基因表达的相对浓度。问：我曾经作过同

5、一管的PCR,内有actin和目的基因引物。虽然可见到两条均一条带但图片质量不理想（而且酶量、Mg2+加倍）。请教mxbdna2003,你是如何处理同一管的PCR的各成分的浓度？答：itshoulddeterminedtheamountofRNA.butitnotforthequantitityofthePCR.itjustwasconvienenttoguesstheamountotthetemplate（forRTandPCR）andbettrerforpublicationandeditorifhedonnotknowthepreoceduremuch,buttheamountjustu

6、singaccuratepiptte“iswrong,itshoudberememberedtodotheinnercontrolofhousekeepinggeneeverytime.在同一管中做RT,其实没有什么问题，不需要taq魅加量，taq酶本来就是过量的（平时做per的时候，完全可以再省一些taq酶的，半斤八两就可以了，我想这肯定再很多贴子里应该都谈到了。Mg就跟不能变了，一变整个体系就变了。能看到均一条带就很好了。关键是摸，十八摸（太少，只争朝夕，开个玩笑）虽然用不着，但是摸上3、5摸总是必要的，首先遥分开摸，然后再一起摸，直到摸的好了，还要考虑比较的不同的模板中的量，所以我们不建

7、议再同一管中进行，因为还有互相竞争抑制的问题，即使不同基因之间。有关内参的建议：一定要做内参的，每一次，我想。不作内参的结果是不可信的电泳可以不一起跑，没有关系，计算的是相对表达程度，着我在好几封帖子里都谈了，再说一边我得观点，1、半定量和定量RT-PCR做的都是基因相对表达量，不是绝对表达量，除非你能准确知道来自多少细胞，但是细胞还有死的呢。2、以电泳为基础的半定量RT-PCR本身是不可信的，作为实验的粗筛是可以的,但不能作为最终结果的，3、半定量RT-PCR应该再两管中进行，除非内参基因和目的基因表达相同，长度差不多，GC含量相似，或者实在穷的要省PCR管和taq。关于平台期和线性期的问题

8、，实际上线性期是指数期，只不过碰巧2的冥和2的倍数是相同的。看上去任何一个时期都可以，实际上是不对的，因为牵涉到酶促动力学的问题，这个我也不懂，有一些专门的文章，好像，涉及到很多化学的东西。我们学医的，也没必要知道那些，但是其中主要是因为模板引物酶原料和buffer之间的关系，这种反应单靠改变其中一种成分没有用的，酶一直是过量，再加酶也没用，引物ntp都是这样。烟鬼正传，最好选线性期的开始阶段，但是要在你的凝胶成像分辨范围内，所以选一个这两种的契合点。给你一张图你就明白了，再开始的时候酸的是切线，这图我在*帖过。关于引物设计，再可能的情况下，除了常规要求之外，最好兼顾跨内含子（不过，根据要求，

9、还可以专门设计隔内含子的，这样还可以用于基因组PCR）、长度小于500bp-600bp等等。引物当然要设计成一样的退火温度，即使不再一管中，也要一样的，要在一台机器里啊。我的引物占了冰箱一格，大部分是一个温度，这样任何几个都可以拿来披，也不用查。我反复说过了，别用软件，就用眼睛看，软件涉及的在好，有些基因在它出软件的时候，还没发现呢，跟不要说在基因组的位置和序列了，怎么考虑内含子的问题呢？18s的引物也和著名的Bactin一样是设计的，只要拿到序列就可以了，但是限制是只能用总RNA为模板，但是比actin和bubulin等可准多了，更不要说GAPDH这个破烂了。18s除了在细胞中更相同（量）夕

10、卜，主要是它占的比例远远高于看家基因，所以定量更加准确，我想，不知对不对，请几位主任和eeflying指教。我认为，就像你用某一种东西的数量去概括，因该选那种多的东西，说一座房子是由2000块砖造成的，比说又29根梁更准确吧。更不要说没有看家基因不看家的缺点，因为他是服务于整个基因组表达谱什么的。PE有专门的用于实时PCR的内参试剂盒，就是用18s,不过我们看懂使用的那条序列，不知有没有人用过，告知其序列和genbank号。正好问一下，我查了一些序列，一直没有去合成，主要是因为手上的actin的荧光探针还没有完，当初和成了一堆。有那位高手用过18s的内参，请问您的序列（我指的是模板的序列）？原

11、位杂交最好用RNA做探针，效果好一些，反正你有钱卖roche的盒子，而且量也能保证，因为转录过程嘛，沿着一条线突突地跑就是了。正义反义也容易理清。我觉得做RT-PCR的方法和条件及应注意的事项就是那么几条，许多专业书都有详细的描述，但是许多人还是历经多次磨难，有时就是得不出结果。因此，我认为因为每个人所要克隆的片断不同，引物不同等，因此对不同的人来说还是有他自己的特殊性,我的以下经历说明：做实验时各人的情况不同,做不出时还是要好好动一下脑子。记得我开始我的RT-PCR时，按常规方法，提取总RNA后，首先用自己设计的下游引物进行逆转录，不断改变反应条件，进行了N次均没有结果。后来考虑到本人的克隆

12、的PCR的片断位于我们实验另一位同学克隆的片断当中,而该同学己经用RT-PCR克隆出她的片断（尽管她用这些RTPCR产物做模版再进行PCR时也没办法重复出她的产物），因此，我先用她的引物和条件扩增出她的片断，然后用她的RTPCR产物作模板（有点改进，逆转录反应换用了9mers随机引物），用我的引进物进行一般PCR,终于得到我的产物，测序结果完全正确。尽管我的这个经历别人很人遇到，但足可以说明实验可以有自己的模式，书本的知识和别人的经验很重要，但有时也不定要受到书本框框和别人经验的限制请问：1引物的特异退火温度怎样设定？可以根据gc和at含量算出吗？可以用引物报告单上的Tm值吗？2PCR时20微

13、升体系中cDNA应加多少比较合适？MgC12应加多少？各个成分的量有无确定标准？3PCR结果跑电泳，actin有，但跑不出目的条带，有几种原因？与cDNA的量少有关吗？Mg离子太多是否会抑制Taqase的活性？一般来说引物报告单伤得是对的，也可以自己算，实际上重要的各条引物一致,剩下的可以摸的.20中是指体积还是量?只要不明显改变体系的离子强度，加1l,2ul都可以的.rng要调的,但我总觉得没有书里讲的那么玄乎,我都是常年不变的.如果内参照有，目的没有,至少证明不是"美丽惹"的祸.原因书里应该都说了.在所有RNA实验中，最关键的因素是分离得到全长的RNA。而实验失败的主要

14、原因是核糖核酸酶(RNA酶)的污染。由于RNA酶广泛存在而稳定，一般反应不需要辅助因子。因而RNA制剂中只要存在少量的RNA酶就会引起RNA在制备与分析过程中的降解，而所制备的RNA的纯度和完整性又可直接影响RNA分析的结果，所以RNA的制备与分析操作难度极大。在实验中，一方面要严格控制外源性RNA酶的污染；另一方面要最大限度地抑制内源性的RNA酶。RNA酶可耐受多种处理而不被灭活，如煮沸、高压灭菌等。外源性的RNA酶存在于操作人员的手汗、唾液等，也可存在于灰尘中。在其它分子生物学实验中使用的RNA酶也会造成污染。这些外源性的RNA酶可污染器械、玻璃制品、塑料制品、电泳槽、研究人员的手及各种试

15、剂。而各种组织和细胞中则含有大量内源性的RNA酶。一、防止RNA酶污染的措施1 .所有的玻璃器皿均应在使用前于180C的高温下干烤6hr或更长时间。2 .塑料器皿可用0.1%DEPC水浸泡或用氯仿冲洗(注意：有机玻璃器具因可被氯仿腐蚀，故不能使用)。3 .有机玻璃的电泳槽等，可先用去污剂洗涤，双蒸水冲洗，乙醇干燥，再浸泡在3%H2O2室温lOmin,然后用0.1%DEPC水冲洗，晾干。4 .配制的溶液应尽可能的用0.1%DEPC,在37C处理12hr以上。然后用高压灭菌除去残留的DEPC。不能高压灭菌的试剂，应当用DEPC处理过的无菌双蒸水配制，然后经0.22Um滤膜过滤除菌。5 .操作人员戴

16、一次性口罩、帽子、手套，实验过程中手套要勤换。6 .设置RNA操作专用实验室，所有器械等应为专用。二、常用的RNA酶抑制剂1 .焦磷酸二乙酯(DEPC)：是一种强烈但不彻底的RNA酶抑制剂。它通过和RNA酶的活性基团组氨酸的咪哇环结合使蛋白质变性，从而抑制酶的活性。2 .异硫氟酸服：目前被认为是最有效的RNA酶抑制剂，它在裂解组织的同时也使RNA酶失活。它既可破坏细胞结构使核酸从核蛋白中解离出来，又对RNA酶有强烈的变性作用。3 .氧钿核糖核昔复合物：由氧化钢离子和核昔形成的复合物，它和RNA酶结合形成过渡态类物质，几乎能完全抑制RNA酶的活性。4 .RNA酶的蛋白抑制剂(RNasin)：从大

17、鼠肝或人胎盘中提取得来的酸性糖蛋白。RNasin是RNA酶的一种非竞争性抑制剂，可以和多种RNA酶结合，使其失活。5 .其它：SDS、尿素、硅藻土等对RNA酶也有一定抑制作用。mRNA的分离与纯化真核细胞的mRNA分子最显著的结构特征是具有5,端帽子结构(m7G)和3,端的Poly(A)尾巴。绝大多数哺乳类动物细胞mRNA的3,端存在20-30个腺昔酸组成的Poly(A)尾，通常用Poly(A+)表示。这种结构为真核mRNA的提取，提供了极为方便的选择性标志，寡聚(dT)纤维素或寡聚(U)琼脂糖亲合层析分离纯化mRNA的理论基础就在于此。mRNA的分离方法较多，其中以寡聚(dD-纤维素柱层析法

18、最为有效，已成为常规方法。此法利用mRNA3,末端含有Poly(A+)的特点，在RNA流经寡聚(dT)纤维素柱时，在高盐缓冲液的作用下，mRNA被特异地结合在柱上，当逐渐降低盐的浓度时或在低盐溶液和蒸储水的情况下，mRNA被洗脱，经过两次寡聚(dT)纤维柱后，即可得到较高纯度的mRNA。寡聚(dT)纤维素柱纯化mRNA一、试剂准备1. 3M醋酸钠(pH5.2)2. 0.IMNaOH3. IX上样缓冲液：20mMTris-HCl(pH7.6)；0.5MNaCl；IMEDTA(pH8.0)；0.1%SLS(十二烷基氨酸钠。配制时可先配制Tris-HCl(pH1.6)、NaCKEDTA(pH8.0)

19、的母液，经高压消毒后按各成分确切含量，经混合后再高压消毒，冷却至65P时，加入经659温育(30min)的10%SLS至终浓度为0.1%。4. 洗脱缓冲液：10mMTris-HCl(pH7.6)；ImMEDTA(pH8.0)；0.05%SDS5. 无水乙醇、70%乙醇6. DEPC二、操作步骤1.将0.5-L0g寡聚(dT)-纤维悬浮于0.1M的NaOH溶液中。2 .用DEPC处理的1ml注射器或适当的吸管，将寡聚(dT)-纤维素装柱0.5-lml,用3倍柱床体积的DEPCH20洗柱。3 .使用IX上样缓冲液洗柱，直至洗出液pH值小于8.0。4 .将RNA溶解于DEPCH2O中，在65中温育l

20、Omin左右,冷却至室温后加入等体2X上样缓冲液，混匀后上柱，立即收集流出液。当RNA上样液全部进入柱床后，再用IX上样缓冲液洗柱，继续收集流出液。5 .将所有流出液于65P加热5min,冷却至室温后再次上柱，收集流出液。6 .用5-10倍柱床体积的IX上样缓冲液洗柱，每管1ml分部收集，0D260测定RNA含量。前部分收集管中流出液的0D260值很高，其内含物为无Poly(A)尾的RNAo后部分收集管中流出液的0D260值很低或无吸收。7 .用2-3倍柱容积的洗脱缓冲液洗脱Poly(A+)RNA,分部收集，每部分为1/37/2柱体积。8 .0D260测定Poly(A+)RNA分布，合并含Po

21、ly(A+)RNA的收集管，加入1/10体积3MNaAc(pH5.2)>2.5倍体积的预冷无水乙醇，混匀，-20放置30min。9 .4C离心，10000gX15min,小心吸弃上清。用70%乙醇洗涤沉淀。注意：此时Poly(A+)RNA的沉淀往往看不到。4c离心，10000gX5min,弃上清，室温隙干。10 .用适量的DEPCH20溶解RNA。三、注意事项1 .整个实验过程必须防止Rnase的污染。2 .步骤(4)中将RNA溶液置65C中温育然后冷却至室温再上样的目的有两个,一个是破坏RNA的二级结构,尤其是mRNAPoly(A+)尾处的二级结构，使Poly(A+)尾充分暴露,从而提

22、高Poly(A+)RNA的回收率;另一个目的是能解离mRNA与rRNA的结合，否则会导致rRNA的污染。所以此步骤不能省略。3 .十二烷基肌氨酸钠盐在18c以下溶解度下降，会阻碍柱内液体流动，若室温低于18'C最好用LiCl替代NaCL4 .寡聚(dT)-纤维素柱可在49贮存，反复使用。每次使用前应该依次用NaOH、灭菌ddH20、上样缓冲液洗柱。5 .一般而言，107哺乳动物培养细胞能提取l-5ngPoly(A+)RNA,约相当于上柱总RNA量的1%-2%oRNA酶保护试验(RNaseProtectionAssay,RPA)是通过液相杂交的方式,用反义RNA探针与样品杂交，以检测RN

23、A表达的技术。与Northern杂交和RT-PCR比较,RPA有以下几个优点：1 .检测灵敏度比Northern杂交高。由于Northern杂交步骤中转膜和洗膜都将造成样品和探针的损失，使灵敏度下降，而RPA将所有杂交体系进行电泳，故损失小，提高了灵敏度。2 .由于PCR扩增过程中效率不均一和反应“平台”问题，基于PCR产物量进行分析所得数据的可靠性将下降，而RPA没有扩增过程，因此，分析的数据真实性较高。3 .由于与反义RNA探针杂交的样品RNA仅为该RNA分子的部分片段，因此，部分降解的RNA样品仍可进行分析。4 .步骤较少，耗时短。与Northern杂交相比，省去了转膜和洗膜的过程。5

24、.RNA-RNA杂交体稳定性高，无探针自身复性问题，无须封闭。6 .一个杂交体系中可同时进行多个探针杂交，无竞争性问题。7 .检测分子长度可以任意设置，灵活性大。RPA的缺点是需要同位素标记探针。一、试剂准备1. GACUPOOL:取100mMATP、CTP、GTP各2.78H1、lOOmMUTP0.06Pl,加DEPCH20至100u1。2. 杂交缓冲液IPES0.134g、0.5MEDTA(pH8.0)20UK5MNaCl0.8ml>甲酰胺8ml,加DEPCH20至10ml。3. RNase消化液：5MNaCl120IMTris-HCl(pH7.4)20ul>0.5MEDTA(

25、pH8.0)20Hl、RNaseA(10mg/ml)8yl、RNaseT1(250U/U1)lul,加DEPCH20至2ml二、操作步骤1 .反义RNA可由含T7或SP6启动子的重组质粒为模板制备，也可以用含启动子的PCR产物为模板制备，本文介绍后者。(1)设计含T7启动子的PCR引物由于PCR产物将作为合成反义RNA的模板，所以一对引物中的下游引物5,一端要含T7启动子序列：T7启动子序列为：5'-TAATACGACTCACTATAGGG引物设计的其他要求与一般PCR引物的设计相同。PCR产物的长度决定了反义RNA探针的长度，具体设计时可考虑lOOYOObp长。最好采用巢式PCR,即

26、先扩增出一较长的片段，再以该片段为模板扩增出较短的片段，以保证探针的特异性，如下图所示：上游引物下游引物nT7启动子序列下游引物I2 2)PCR先用上游引物和下游引物I进行PCR,再以PCR产物为模板，用上游引物和下游引物II-T7进行二次PCR(具体操作参见PCR章节)。(3)探针合成标记与纯化在0.5ml离心管中加入下列试剂：RNasin(40U/ul)0.5u1GACUPOOLGAC(含GTP、CTP>ATP各2.75mM,UTP61PM)2U1a-32PUTP(10uCi/ul)2.5u1DTT(二硫苏糖醇，0.IM)lul5X转录buffer2U1模板(50ng/ul)1U1T

27、7RNA聚合酶(15U)1Ul混合后，短暂离心，370c保温Ihr。加入DNaseI(lOU/ul)1U1,370C15min,然后750C1Omin以灭活DNAseI和T7RNA聚合酶。加入：饱和酚50Ul氯仿50P1酵母tRNA(2ng/Rl)4DEPCH20100P1室温下充分混匀，离心10000gX2min。取上层液置另一0.5ml离心管中，加入100口1氯仿，混匀，离心10000gX2min。将上层液转移至另一0.5ml离心管中，再加入3MNaAc10口1、预冷无水乙醇250HL混匀后，-200C静置30min。40C离心13500gXIOmin。弃上清液，沉淀用75%乙醇100H1

28、洗涤，40C离心13500gX2min,弃上清液。室温下挥发残留乙醇。加入50U1杂交缓冲液溶解沉淀，40c下保存待用。可用尿素-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测探针质量。(参见本节电泳步骤)。2 .杂交(1) RNA提取后溶解在杂交缓冲液中，浓度为lug/口1。(2)取8P1RNA加入1-3U1探针(根据探针检测结果调整)于0.5ml离心管中。(2) 800C保温2min,然后40-450C下杂交12-18hr。3 .消化(1)杂交管于370C保温15min,加入RNase消化液，370C保温30min。(2)加入10%SDS10口1、10Pg/P1蛋白酶K20U1,混匀，370C保温lOmino(3

29、)加入65u1饱和酚和65yl氯仿，混匀，室温离心，10000gX2min<>(4)转移上层液到另一0.5离心管中，加入10H1酵母tRNA和3MNaAc15U1,再加入200u1异丙醇,混匀后，置-200c30min,40C离心，135000gXlOmino(5)弃上清液，室温下挥发乙醇，加入5-8P1上样缓冲液溶解沉淀。4、电泳与放射自显影(1)配制凝胶：(50ml)40%丙烯酰胺-亚甲双丙烯酰胺(19：D6.25ml5XTBE10ml尿素24g加H20至50ml溶解后加入25%过硫酸胺50PLTEMED50ul,混匀，注入电泳槽中，插入梳,待胶凝固。(2)预电泳以1XTBE为

30、上下槽电泳缓冲液，加上电压后进行预电泳，如果用测序电泳装置,电压应达2000v以上，功率设定为100w,温度设为50OCo待胶板温度达500C时，暂停电泳，准备加样。(3)加样将已溶解在加样缓冲液中的样品800C加热2min,立即加样到胶孔中，电泳l-2hro(电泳条件同预电泳)。(3)电泳结束后，打开胶板，用滤纸取下胶，覆上一层保鲜膜，放置于暗盒中，暗室红光下，压上一张X片，盖上暗盒，-700C曝光1-3天。暴光结束后，将X光片显影、定影、水洗、晾干。三、注意事项1 .本实验大部分为RNA操作，注意RNA酶的污染。2 .RNase消化液消化未杂交的单链RNA和探针RNA,当探针与样品之间有碱

31、基错配时，错配位点也将被消化，因此会产生片段较小的杂交片段。因此进行PCR时，采取尽量减少错配的措施。3、同位素对RNA合成有一定影响，有时会产生非全长的探针。因此，标记时间不宜过长。4、RNase消化液有时会产生过度消化而无检测信号，可以将消化液稀释10-100倍后使用。可能问题出在标本的保存：一般四小时之内就应处理，分离出细胞说的是套式PCR,可以在你的第一次PCR两个引物内,再设计一对引物进行第二次PCR就行了如果你的第一次PCR刚好包括目的片段,那只好设计个更长的了第二次的引物设计要求可以低一点以50nl体系为例引物各1P1第一次PCR产物5B1二次PCR和巢式PCR,即设计两对引物进

32、行扩增，不是一个概念，它是拿第一次的PCR产物，稀释100-1000倍做模板，加入底物，从新进行扩增反应,以期增加产物的量我做RT-PCR时,提总RNA时,都是用灭菌DEPC水，按1：100稀释后测0D260和0D280,后根据公式:RNA浓度=0D260*稀释度/25(ug/ul),后用ImgtotalRNA分离mRNA.做逆转录及PCR,效果很好.luoyulOwrote：各位大哥：我有一个问题请教，RT-PCR要求模板RNA的260nm/280nm的比值最低为多少，如果太低是不是会影响结果？最低到1.8,最好2.0,我感觉稍微低一点影响不算太大。问：我是RT-PCR的新手,想请教引物如何

33、设计？好的引物所具有的令人满意的特点：*典型的引物18到24个核昔长。引物需要足够长，保证序列独特性，并降低序列存在于非目的序列位点的可能性。但是长度大于24核昔的引物并不意味着更高的特异性。较长的序列可能会与错误配对序列杂交，降低了特异性，而且比短序列杂交慢，从而降低了产量。* 选择GC含量为40%到60%或GC含量反映模板GC含量的引物。* 设计5,端和中间区为G或C的引物°这会增加引物的稳定性和引物同目的序列杂交的稳定性O* 森免引物对3末端存在互补序列，这会形成引物二聚体，抑制扩增。* 避免T末端富含GC设计引物时保证在最后5个核昔中含有3个A或T。* 避免3,末端的错误配对。3,端核昔需要同模板退火以供聚合酶催化延伸。* 0避免存在可能会产生内部二级结构的序列，这会破坏引物退火稳定性。目的序列上并