液相色谱串联质谱联用技术-实验指导(许煊炜)

1、液相色谱串联质谱联用仪检测技术实验指导2021、2021级课程内容(一个实验8学时)：(1)ABSciexQtrap4500三重四级杆/离子阱液相色谱串联质谱联用仪的结构原理、操作及定性定量应用.(2)利用液相色谱串联质谱联用仪快速测定水果中7种农药的残留量.吉林农业大学农业部参茸质检中央2021.03实验一ABSciexQtrap4500三重四级杆/离子阱液相色谱串联质谱联用仪的结构原理、操作及定性定量应用一.实验目的和意义通过学习液质联用仪的构成和使用方法,及其在定性、定量分析中的应用,培养学生使用液质联用仪进行仪器分析的水平,并培养学生严谨的科学态度、细致的工作作风、实事求是的数据报告和

2、良好的实验习惯准备充分、操作标准,记录简明,台面整洁、实验有序,良好的环保和公德意识.培养培养学生的动手水平、理论联系实际的水平、统筹思维水平、创新水平、独立分析解决实际问题的水平、查阅手册资料并运用其数据资料的水平以及归纳总结的水平等.一检测仪器1、仪器名称高效液相色谱串联质谱联用仪简称LC-MS-MS.型号：4500QTRAP美国AppliedBiosystems公司.2、仪器组成液相色谱局部：岛津LC-30A,配有在线脱气机、超高压二元泵、自动进样器；串联质谱局部：QTRAP4500,配有ESI离子源、串联四级杆/线性离子阱.3、主要性能指标离子化方式：ESI电离质量范围：51700am

3、u分辨率：6900质量稳定T0.1amu/12h灵敏度：1pgreserpine,ESI+,MRM扫描m/z:609/195,信噪比S/N120:1扫描速度：4000amu/sec质量准确度：0.01%全质量数范围4、方法原理高效液相色谱二元泵将流动相泵人系统并混合,自动进样器将待测样品注入流动相中,随流动相进入色谱柱,由于样品不同组分在色谱柱中保存时间不同,各组分被分开,依次进入离子源.在离子源中,各组分以ESI或APCI方式电离,被加速后进入质量分析器.4500QTRAP的质量分析器主要由Q1、Q2、Q3三组四级杆串联组成.Q1可将分子离子按质荷比m/z大小分开；Q2是碰撞室,可将母离子进

4、一步破碎为碎片离子；Q3具有四级杆和线性离子阱两种功能,作为四级杆时可将分子离子或碎片离子按质荷比大小分开,作为离子阱还可富集离子从而提升检测灵敏度.各组分的不同离子在质量分析器中被破碎、别离,并按质荷比大小依次抵达监测器,经记录即得到按不同质荷比排列的离子质谱图.4500QTRAP通过串联四级杆/线性离子阱两种不同质谱技术的结合,可以在单次分析中对复杂样本中的单个成分同时进行定性和定量,也可以对多个化合物进行定量分析.整台仪器的限制、数据采集、数据处理、结果输出均由PC计算机Windows操作系统支持下的Analyst软件限制完成.二样品1、样品要求本仪器适合分子量在51700amu范围内的

5、有机样品的定性及定量分析.待测样品必须能溶解于水或其它有机溶剂中.假设样品或配制的样品溶液发生沉淀、挥发、变质等异常现象时,应重新取样或重新配制溶液.2、试剂要求所有的试剂均选用色谱纯级,所用水的电导率应大于18KQ.流动相必须用0.2m或0.45m滤膜过滤前方可使用.3、别离条件要求在液相色谱仪上确定别离条件,使待测组分能完全别离,且该色谱条件中流动相不应含有不挥发性盐,如磷酸盐.三、操作步骤实施检测操作的人员,必须熟悉该仪器的操作规程,仪器的工作状态、包括检测灵敏度和分辨率,必须满足检测工程的要求.1、开机前准备开机前应检查仪器室内电、气的供给情况及空调机的工作状态是否稳定,检查真空机械泵

6、泵油是否需要更换.只有当UPS工作正常,Gas1/Gas2、CurtainGas和ExhaustGas的压力分别稳定在0.35、0.35和0.7Mpa,环境温度为1030C,相对湿度小于70%时才能开机.2、开机1翻开真空机械泵上的电源开关.2真空机械泵继续工作至少15分钟后,翻开MS电源主开关.3等真空度到达2X10-5Torr绿色指示灯不闪后,翻开PC计算机电源3、仪器调谐四、方法建立1 .在Analyst软彳Tools菜单中选择ProjectfCreateProjectProjectname项下输入新建的Project名称.注意,不要点选窗口中的其他按钮！点击OK,确认新建Project

7、.2 .在Analyst软件界面下,双击导航栏内HardwareConfiguration.在弹出窗口中选择MassOnly,点击ActivateProfile,激活MassOnly只联接质谱主机.3 .在导航栏内单击TuneandCalibrate,进入调谐模式.点击上方工具条中的T钮.此时,应注意到主机有扑声音,说明进入调谐状态.此时右下角质谱状态显示绿色.双击ManualTuning,进入质谱参数设置及运行窗口.4 .使用1mL玻璃进样针吸取适当标准溶液,置于进样针座上.点击MSMethod下拉菜单,选择SyringePumpMethod,设定针泵流速FlowRate为10科L/min5

8、 .点击StartSyringePump按钮开针泵进样.6 .返回MSMethod,选择扫描模式ScanType为Q1MS,设定扫描速度ScanRate为10Da/s,设定扫描范围StartStop设定为50化合物分子量.DP预输入60.7 .点击start开始采集数据.运行稳定后,注意观察是否有预期的母离子出现,并限制其响应值在名EE4以下.点击stop,选择第一个峰后面是同位素峰的平稳段,双击,选中母离子.点击右键,选择DeletePane.8 .设定Scantype为产物离子扫描ProductIonMs2,扫描速度200Da/s,选择扫描正/负离子,输入母离子productof,设定扫描

9、范围startstop为50MW+20,覆盖可能的子离子质量范围,点击compoud标签,设定DP60,CE5.9 .点击start,开始采集数据,注意观察是否有预期的母离子出现.手动调节CE,以5eV为步长,逐渐增加.每次增加后稍作等待,直至目标化合物的子离子清楚看见.选择平稳的一段,双击,选择子离子.10 .选才iScanType为MRM.设定参数表格中的Q1对应的母离子,Q3对应的子离子,timems为50,ID值设为名称1定量,名称2定性.11 .点击EditRamp,在Parameter下选择CollisionEnergy,点击OK.点击start开始采集数据,记录每个MRM通道的最

10、正确CE电压.在MRM参数设定表中,右键点击.选才iCollisionEnergyCE,调出表格中的CE歹U,输入每个MRM通道的最正确CE电压值,精确到个位数.重复以上步骤,在Parameter项下选择DeclusteringPotential,优化并保存DP.完成后选择菜单File/Save保存采样方法,文件名.dam.五LCM鲂法的建立：12 连接仪器：翻开HPLC质谱电源,将HPLC系统接上柱子,将6号出口管线与离子源连好.调离子源喷雾针位置到2mm处,双击HardwareConfigure,在硬件配置菜单下单击LCMS液相与质谱联用,单击Activateprofile激活仪器,会听到

11、笛的一声,说明仪器已经连接上.13 确认液质同步：选择工程之前优化方法的时候已经建立的工程；双击Buildacquisitionmethod新建方法,弹出新建方法模板.在模板左侧点击acquisitionmethod,模板右边显示对应的参数,确认synchronizationmode选择LCSync,表示液质同步.14 设置MRM参数：点击方法模板左侧的MRM,在模板右侧ScanType下选择MRM;在polarity下选择化合物极性：Positive正离子、Negative负离子；Duration为15min与液相别离相同的时间；表格中Q1:母离子分子量,Q3Da:子离子分子量,Timems

12、ec:50,ID栏：化合物名称离子对名称后空格加1为定量,空格加2为定性,在表格中右键分别单击DP、CE,点击工具栏的OPEN翻开之前优化的方法参数,调出DP,CE值,选中整行,Ctrl+c复制参数,关闭窗口,再Ctrl+v粘贴参数；最后点击Editparameter设置离子源参数：Source/Gas项用以下推荐值：CUR35,IS:5500正离子或-4500负离子,TEM600,GS160,GS270,点击OK.4、设置液相参数：点击模板左边的shimadzuLCsystem,在右边的pumps栏下,设置stoptime运行时间为15min,flow流速为1mL/min,A为水相设为95%

13、,B为有机相设为5%设置时改B,A自动,泵最大压力为50;点击timeprogram设置液相梯度：例咪门坐类梯度设置：Time(min)AB95%5%55%95%105%95%10.195%5%1595%5%接着在右边的Autosampler栏下,设置清洗时间,在Rinsemode下选择Beforeandafter前后都洗,并设置清洗时间为5s,清洗液用50%甲醇水.最后点击保存按钮,在保存窗口输入该方法的名称.五数据处理双击才T开Multiquilt,选择工程,点击File下的荧光棒型图标,点击sample,选择需要的标准品和样品数据,点击next,createnewmethod,为方法命名

14、,点击next,选择一个有代表性的样品一般选择浓度较大的标品数据,设置分组同一物质定量离子和定性离子设置为一组,并指定内标,next,对每个物质进行积分.设置积分参数：CausianSmoth平滑：一般是0,如有毛刺可改成1或2;ExpecetedTime保存时间：一般不动Expectedtime范围：一般30s,表示在保存时间±5s范围最小峰宽最小峰高背景噪音扣除：可调整目标峰基线以下被积分的面积,比例越高积分越往下,必要时调整.分峰因子：峰有分叉时设置,如有两个分叉,设置为2,峰分叉不能大于2单位：设置单位,勾选Applyunitstoall可将此单位用于所有化合物点击next,

15、点击finish.在新跳出窗口内将标准品选定,输入浓度.查看各化合物积分是否正常,点击第三个图标查看标准曲线.实验二利用液相色谱串联质谱联用仪快速测定水果中7种农药的残留量1实验目的：1.1 让学生了解利用液相色谱质谱联用仪测定食品、农产品中农药残留等有害化合物的分析流程.1.2 利用前2节课所学内容实际处理样品,增强学生实践水平.1.3 进一步增强液相色谱质谱联用仪的操作和数据处理.2试剂或材料除非另有说明,仅使用分析纯试剂,水为GB/T6682规定的二级水.2.1 乙睛C2H3N:色谱纯.2.2 氯化钠NaCl:140C枯燥4h.2.3 氨基固相萃取小柱：500mg/6mL或性能相当的其它

16、固相萃取柱.2.4 二氯甲烷-甲醇混合液：二氯甲烷+甲醇体积比=95+5.2.5 标准品：见表1.2.6 农药标准溶液配制2.6.1 标准储藏溶液1000mg/L的单分别准确称取一定量精确至0.1mg农药标准品,用甲醇溶解,逐一配成农药标准储藏液,密封贮存在-18C冰箱中,使用期为6个月.表19种农药标准品农药名称纯度多菌灵>98口比虫咻>98咤虫眯>98¥硫磷>98阿维菌素>98克白威>98喀霉胺>982.6.2 混合农药标准溶液分别准确吸取一定体积的9种农药标准储藏溶液4.8.1注入同一容量瓶中,用甲醇稀释至刻度配制成100mg/L的混合

17、标准储藏液,-18C冰箱中密封闭光保存,使用期为3个月.2.6.3 混合标准工作液吸取一定体积的混合农药标准储藏液,用甲醇配制成0.01mg/L、0.05mg/L、0.1mg/L、0.2mg/L、1.0mg/L、5.0mg/L的7种农药混合标准工作液,贮于4C以下冰箱中,需现用现配.3仪器设备3.1 电子天平：感量0.01g;3.2 破壁食物料理机：不低于20000r/min;3.3 均质机：不低于20000r/min;3.4 恒温水浴锅；3.5 旋转蒸发仪；3.6 氮吹仪.4试验步骤4.1 样品制备4.1.1 鲜人参取不少于500g水果于破壁食物料理机中,以不低于20000r/min的转速将

18、样品制成糊浆状,充分混匀后装入样品密封盒中直接测定或-18C保存,备用.4.2 样品预处理4.2.1 提取称取25g水果样品水果品种当季待定,精确至0.01g,于100mL具塞离心管中,参加50mL乙睛,于匀质机中高速匀质1min,过滤至装有7g氯化钠的比色管中,振荡200下,静止分层,吸取10mL上层有机相于50mL浓缩管中,60C水浴中氮气吹至近干,用2mL二氯甲烷甲醇混合液溶解残渣,待净化.4.2.2 净化氨基柱用5mL二氯甲烷甲醇混合液溶解进行预处理,当溶剂液面达上层筛板外表时,再倒入上述浓缩管中待净化溶液,用浓缩瓶接收,待液面下降至上层筛板外表,用8mL二氯甲烷甲醇混合液溶解分2次冲洗浓缩管并洗脱小柱,将浓缩瓶中洗脱液于40C水浴中旋转浓缩至尽干,氮气吹干后用2.5mL甲醇和2.5mL水定容,过0.22m滤膜待测.4.3 仪器参考条件4.3.1 液相色谱串联质谱联用仪：Qtrap4500三重四级杆/离子阱质谱仪配岛津30A超高效液相色谱仪,电喷雾离子源,美国ABSCIEX公司.4.3.2 色谱柱：KinetexXB-C18,2.1mmx150mmx2.6m4.3.3 流动相及流速见表14.3.4 色谱柱箱温度：40C4.3.5 进样体积：5.0L.表1流动相梯度及流速步骤总时间/min流速/(l