植物DNA提取方法

1、1.2实验方法1.2.1 茶花基因组DNA勺提取采用CTAB法8提取DNA,所有试剂(有机溶剂除外)和器皿都经高压灭菌，主要步骤如下：(1)取两片幼嫩新鲜叶片，置于预冷的研钵中，倒入适量液氮，迅速研磨成粉末状，随后加入3ml预热的2%CTAB抽提缓冲液和50ul抗氧化剂2-疏基乙醇，继续研磨成略有流动性的糊状或粥状，转入1.5ml的离心管中，于65c水浴锅中保温约60min.(2)待混合物冷却至室温后加入等600ul的CI(氯仿：异戊醇=24:1)溶液混匀，轻轻颠倒离心管几次使管内混合物成乳浊液，常温下10000rpm离心10min,取上清液转入另一干净的离心管中。(3)重复步骤(2)一次。(

2、4)取步骤(3)上清液加入2.5倍体积无水乙醇，仔细混匀，-20冰箱30min以上，沉淀DNA4C,12000rpm离心10min.(5)弃去上层有机溶剂，力口500ul75%乙醇洗涤沉淀，4c下8000rpm离心5min,弃去上清，洗涤沉淀3次。(6)倒置或者37度培养箱烘干.(7)力口50ulTE缓冲液溶解DNA,于-20C冷藏备用。1.2.2 DNA含量和质量的测定(1)紫外分光光度法：取4ml提取的DNA,将之稀释200倍，测定提取的DNA在260nm和280nm处的吸光度值，得出OD260/280的值以及DNA和蛋白质浓度。如蛋白质浓度过高，需纯化。(2)琼脂糖凝胶电泳：配制1.0%

3、琼脂糖凝胶，在0.5XTBE缓冲液中，电压5V/cm电泳约60min,澳化乙锭染色20min,在凝胶成像系统上观察并拍照。1.2.3 PCR扩增(1)PCR反应在BiometroPCR仪上进行，反应体系为25ul:ddH2O14ul,10xBuffer2.5ul,MgCl(25mM)2.5ul,dNTPs(2.5mM)2.0ul,primer(2.0uM)1.0ul,DNA2.7ul(约40-60ng),Taq酶(5U/ul)0.3ul.ddH2O13.7uL10xbuffer2.5uLdNTPs2.0uLMgCl22.5uLPrimer2.0uLDNA2.7uL(40-60ng)Taq酶0.

4、3uL共25uL(2)反应程序为：94c预变性3min;94C变性30s,36C退火1min,72C延伸1min30s,40次循环；72c最终延伸10min;4C保存。预变性94C3min变性94C30s、退火36C1minA40个循环延伸72C1min30sJ继续延伸72C10min保存4C1.2.4PCR扩增产物检测取扩增产物与6xloadingbuffer混匀，在1.3%的琼脂糖凝胶上电泳，缓冲液为0.5xTBE,电压5V/cm,电泳1.5-2h.经澳化乙锭染色20min后，取出凝胶在成像系统中拍照并保存结果。1.3数据处理及RAP8析得出清晰，亮度较好的条带后，用laberworker

5、s软件分析所得条带，在同一位点重复出现条带的记为“1”(包括弱带)，不出现条带的记为“0”9,并分析扩增条带的长度。将生成的数据输入电子表格，用NTSYSpc21软件分析得出据类图和遗传相似系数和遗传距离。其中相似系数10为：s=2Mxy/(Mx+My)x100%(s表示相似系数，Mxy表示品种x、y共有片段总和,Mx表示x品种片段数,My表示y品种片段数)，遗传距离D=1-F。2结果与分析2.1基因组DNAM取提取的DNA经分光光度计测定，其OD260/280,DNA含量如下:表2基因组DNAO260/280,DNA含量。Table2ResultsofDNAextractionfromlea

6、vesof15Camelliasamples茶花品种OD260/280DNA含量ug/mlCamelliaspeciesDNAcontent杜鹃茶(Dujuancha)1.850.708凹脉(Ao'mai)1.452.618金丝玉蝶（Jinsiyudie)1.431.282连蕊茶(Lianruicha)1.455.837六角白(Liujiaobai)1.811.094玉美人（Yumeiren）1.341.124醉杨妃(Zuiyangfei)1.431.807凤仙(Fengxian)1.351.537酒中花(Jiuzhonghua)1.331.165孩儿面(Haiermian)1.595

7、.401墨光镜(Moguangjing)1.381.395红露珍(Hongluzhen)1.450.965秋牡丹（Qiumudan）1.412.792公正评奖团1.393.546星上星(Xingshangxing)1.320.857基因组DNAOD260/280在1.32-1.85之间，符合RAPD扩增的要求。附录2:所用试剂及配方4%CTAB（十二烷基三甲基澳化胺）1mol/LEDTA（乙二胺四乙酸二钠）1mol/LTris-HCl4.2mol/LNaCl3mol/LNaAC称取10gCTAB,加水定容至250ml.称取EDTA37.224g,用NaOH（固体）调PH至8.0，最后定容至100ml.称取12.114gTris-HCl,用80ml蒸储水溶解，加浓HCl,最后定容至100ml.称取NaCl61.362g,定容至250ml称取NaAC4.824g,定容至100ml5XTBETris-HCl：54g硼酸：27.5gEDTA:10mol/L定容带1L2%CTAB缓冲液4%CTA