【课件】2.2.2动物细胞融合技术与单克隆抗体（人教版2019选择性必修3）

1、2.2 动物细胞工程 动物细胞融合技术与单克隆抗体新教材人教版选择性必修三【教学过程】Teaching Process1.概念图3.教学总结、综合2.课堂教 学内容4.课堂练习巩固典型习题规律总结单克隆抗体建立模型动物细胞融合 人体血液中的树突状细胞是一种具有很强的抗原呈递功能的淋巴细胞。近年来的研究发现，树突状细胞与肿瘤细胞融合形成的杂交瘤细胞，既能表达肿瘤抗原，又能合成激活T细胞的相关刺激分子。用此方法制成的肿瘤疫苗可以诱导机体产生较强的特异性免疫反应，这为癌症的治疗提供了新的方法。讨论： 1.但如何才能让两个不同的细胞融合? 2.细胞融合技术在生产实践中有哪些应用? 到社会中去时间成果1

2、9世纪30年代观察到肺结核、天花、水痘、麻疹等疾病患者的病理组织中有多核细胞1858年观察到正常组织、发炎组织以及肿瘤组织中的多核细胞现象。1875年第一个观察到脊椎动物（蛙类）的血液细胞发生融合的过程。1876年在无脊椎动物中发现了细胞合并现象。1962年日本学者冈田发现仙台病毒具有触发动物细胞融合的效应。1965年英国科学家证实了灭活的病毒可诱发动物细胞融合1974年华裔加拿大学者高国楠创立了聚乙二醇（PEG）化学融合法。1975年Kohler和Milstein成功地融合了小鼠B-淋巴细胞和骨髓瘤细胞而产生能分泌稳定单克隆抗体的杂交瘤细胞。20世纪80年代发展出了电融合技术(1985年酵母

3、原生质体电融合)动物细胞融合技术的发展历史2.动物细胞融合一.动物细胞工程19世纪30年代，科学家曾在惠肺结核、天花和麻疹等疾病的病人的病理组织中观察到多核细胞。如何解释这一现象?旁栏思考P49病人体内的病毒等诱导多个体细胞融合形成了多核细胞。2.动物细胞融合一.动物细胞工程（1）动物细胞融合技术：指两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的技术诱导原生质体融合 物理方法：电融合法、离心法 化学方法：聚乙二醇融合法、 高Ca2+-高pH融合法（2）原理：细胞膜具有流动性 诱导动物细胞融合 物理方法：电融合法 化学方法：聚乙二醇（PEG）融合法 生物方法：灭活的病毒诱导法2.动物细胞融合一.动物细胞工

4、程正在融合的淋巴细胞与骨髓瘤细胞正在融合的淋巴细胞与骨髓瘤细胞（2）原理：细胞膜具有流动性 2.动物细胞融合一.动物细胞工程19651965年，研究证实了灭活的病毒在适当条件下确实可以诱导动物细胞融合。年，研究证实了灭活的病毒在适当条件下确实可以诱导动物细胞融合。2.动物细胞融合一.动物细胞工程病毒的灭活 ：灭活是指用物理或化学手段使病毒失去感染能力，但是并不破坏病毒的抗原结构。紫外线紫外线灭活灭活灭活病毒诱导细胞融合的原理 病毒表面含有的糖蛋白和一些酶能够与细胞膜上的糖蛋白发生作用，使细胞互相凝聚，细胞膜上的蛋白质分子和脂质分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合。2.动物细胞融合一.动物细胞

5、工程（3）过程两亲本细胞的细两亲本细胞的细胞核逐渐融合胞核逐渐融合病毒吸附在细胞表病毒吸附在细胞表面并使细胞凝集面并使细胞凝集两亲本细胞膜上两亲本细胞膜上磷脂和蛋白质重磷脂和蛋白质重新排布形成通道新排布形成通道通道扩大，病通道扩大，病毒流入细胞质毒流入细胞质灭活的病毒诱导细胞融合的过程示意图灭活的病毒诱导细胞融合的过程示意图2.动物细胞融合一.动物细胞工程动物细胞A动物细胞B杂交细胞AB诱导、融合、筛选诱导、融合、筛选膜融合膜融合 质融合质融合核融合核融合杂种细胞经第一次有丝分裂两个核才融合杂种细胞经第一次有丝分裂两个核才融合细胞融合完成的标志细胞融合完成的标志: :细胞核融合成一个核细胞核融

6、合成一个核（3）过程2.动物细胞融合一.动物细胞工程(4)动物细胞融合结果：形成单核细胞，具有原来两个或多个细胞的遗传信息，可表现出两个或多个亲本的特点。思考：诱导融合后的细胞一定具有双方的遗传信息吗？为什么？不一定，诱导A、B两种细胞融合，融合后可能有A、B未融合细胞及AA、AB、BB等多种细胞，因此细胞融合后需要进行筛选。2.动物细胞融合一.动物细胞工程突破了有性杂交方法的局限，使远缘杂交成为可能。成为研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和生物新品种培育等的重要手段。利用细胞融合技术而发展起来的杂交瘤技术，为制造单克隆抗体开辟了新途径。 (5)意义：2.动物细胞融合一.动物细胞工程植物体细胞杂交和

7、动物细胞融合的比较2.动物细胞融合一.动物细胞工程动物细胞融合过程植物体细胞杂交过程 去去壁壁融融合合植植物物组组织织培培养养植物体细胞杂交和动物细胞融合的比较比较项目植物体细胞杂交动物细胞融合原理融合前处理诱导融合的方法意义和用途克服远源杂交的障碍，获得杂种植株细胞膜的流动性细胞膜的流动性植物细胞的全能性去除细胞壁后诱导原生质体融合使细胞分散后诱导细胞融合物理（电融合法、离心法）化学（聚乙二醇融合法、高Ca2+-高pH融合法）物理（电融合法）化学（聚乙二醇（PEG）2融合法）生物方法：灭活的病毒诱导法制备单克隆抗体2.动物细胞融合一.动物细胞工程3.单克隆抗体及其应用抗原不纯抗体不纯缺陷：产

8、量低、纯度低， 且抗体的特异性差、灵敏度低。不能无限增殖产生大量抗体动物体内抗原 刺激浆细胞抗体 筛选单一B细胞增殖分化抗原抗原免疫过程免疫过程传统抗体传统抗体多种混合多种混合一.动物细胞工程（1）早期获得抗体的方法（2）一个大胆的设想 将能够产生特定抗体的B淋巴细胞和具有无限增殖能量的骨髓瘤细胞融合在一起，形成杂交瘤细胞。那这样就能够提高抗体的产量、同时提高纯度和灵敏性。杰尼 丹麦科勒 德国米尔斯坦 英国 创立抗原选择抗体学说，发明了单克隆抗体技术，因此获得了创立抗原选择抗体学说，发明了单克隆抗体技术，因此获得了19841984年的诺年的诺贝尔生理或医学奖。贝尔生理或医学奖。3.单克隆抗体及

9、其应用一.动物细胞工程怎样才能得到纯的抗体？想要获得单一的纯抗体，就必须从一个想要获得单一的纯抗体，就必须从一个B B细胞出发。细胞出发。光纯还不行，还要大量，怎么办？让让B B细胞大量繁殖（克隆）就可以产生大量抗体了。细胞大量繁殖（克隆）就可以产生大量抗体了。但，有问题：找，什么细胞能无限增殖呢？B细胞是不能无限增殖的，怎么办？癌细胞，只有癌细胞。但它不能产生抗体。癌细胞，只有癌细胞。但它不能产生抗体。（2）一个大胆的设想3.单克隆抗体及其应用一.动物细胞工程思路就出来了：（2）一个大胆的设想3.单克隆抗体及其应用一.动物细胞工程一种B淋巴细胞（只产生一种特定抗体）能在体外大量增殖的骨髓瘤细

10、胞动物细动物细胞融合胞融合杂交瘤细胞动物细动物细胞培养胞培养大量的特定抗体（3）单克隆抗体的制备过程注射特定蛋白免疫小鼠培养小鼠骨髓瘤细胞B淋巴细胞骨髓瘤细胞多种细胞多种杂交瘤细胞能分泌所需抗体的杂交瘤细胞选择培养基筛选选择培养基筛选克隆化培养克隆化培养专一抗体检测专一抗体检测注射到小鼠腹腔内增殖体外培养单克隆抗体融合融合3.单克隆抗体及其应用一.动物细胞工程用特定的抗原对小鼠进行免疫，并从该小鼠的脾中得到能产生特定抗体的B淋巴细胞。用特定的选择培养基进行筛选在该培养基上，未融合的亲本细胞和融合的具有同种核的细胞都会死亡，只有融合的杂交瘤细胞才能生长。（3）单克隆抗体的制备过程3.单克隆抗体及

11、其应用一.动物细胞工程对上述经选择培养的杂交瘤细胞进行克隆化培养和抗体检测，经多次筛选，就可获得足够数量的能分泌所需抗体的细胞。将抗体检测呈阳性的杂交瘤细胞在体外条件下大规模培养，或注射到小鼠腹腔内增殖。从细胞培养液或小鼠腹水中获取大量的单克隆抗体。（3）单克隆抗体的制备过程3.单克隆抗体及其应用一.动物细胞工程单克隆抗体的制备过程第一次筛选资料：细胞合成细胞合成DNADNA有有D D和和S S两条途径，其中两条途径，其中D D途径能被氨基途径能被氨基喋呤阻断。人淋巴细胞中有这两种喋呤阻断。人淋巴细胞中有这两种DNADNA的合成途径，但一般的合成途径，但一般不分裂增殖。鼠骨髓瘤细胞中只有不分裂

12、增殖。鼠骨髓瘤细胞中只有D D途径，没有途径，没有S S途径。途径。B淋巴细胞骨髓瘤细胞（A）合成DNAD途径S途径D途径氨基喋呤A、B、AA、BB、AB1、AB2、AB3骨髓瘤细胞与B淋巴细胞融合多种杂交细胞既能迅速大量增殖既能迅速大量增殖又能产生抗体又能产生抗体筛选杂交瘤细胞（3）单克隆抗体的制备过程一.动物细胞工程AB1、AB2、AB3 专一抗体检验阳性：有限稀释法、抗原-抗体杂交法单克隆抗体的制备过程第二次筛选【原理】将杂交瘤细胞培养液稀释后滴入多孔板，如果稀释度足够高，多孔板的一个孔将杂交瘤细胞培养液稀释后滴入多孔板，如果稀释度足够高，多孔板的一个孔里就可能只有里就可能只有1 1个杂

13、交瘤细胞，培养之后个杂交瘤细胞，培养之后( (即即克隆化培养克隆化培养) )，用，用标记的抗原标记的抗原检测每个小孔检测每个小孔上清液里是否含有我们需要的特异性的抗体（抗原抗体能结合即为阳性孔）。这样经过上清液里是否含有我们需要的特异性的抗体（抗原抗体能结合即为阳性孔）。这样经过多次克隆化培养多次克隆化培养以及以及有限稀释法有限稀释法的筛选，就能选出需要的那种杂交瘤细胞（的筛选，就能选出需要的那种杂交瘤细胞（ABAB3 3）。）。多孔细胞培养板抗体检测板（3）单克隆抗体的制备过程一.动物细胞工程（3）单克隆抗体的制备过程一.动物细胞工程单克隆抗体的制备过程第二次筛选3.单克隆抗体及其应用（3）

14、单克隆抗体的制备过程一.动物细胞工程（4）单克隆抗体的应用资料1.用用抗人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体抗人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体做成的做成的 早早孕诊断试剂盒早早孕诊断试剂盒 ，在妊娠，在妊娠第第8 8天就可以作出诊断，这比原来的诊断方法提前了天就可以作出诊断，这比原来的诊断方法提前了10 d10 d左右，可以避免孕妇在不左右，可以避免孕妇在不知道妊娠的情况下因服用药物而对胎儿造成不利影响。该方法检测的准确率在知道妊娠的情况下因服用药物而对胎儿造成不利影响。该方法检测的准确率在90%90%以上。以上。单克隆抗体能准确地识别抗原的细微差异，与特定抗原发生特异性结合，并且可以大量制备。用于多种疾

15、病的诊断和病原体鉴定。作为诊断试剂最广泛应用一.动物细胞工程甲胎蛋白（AFP）是一种特异性较强的肿瘤标志物，用甲胎蛋白作为_免疫小鼠，制备_，并与含有放射性同位素的标记物连接，单克隆抗体携带放射性标记物通过血液可到达全身几乎所有组织。由于肿瘤细胞表面的_会和单克隆抗体特异性的结合，所以放射性同位素标记物就不断积累在_上。通过一定的显影技术就可以发现肿瘤所在。抗原抗AFP单克隆抗体AFP肿瘤用于疾病检测（4）单克隆抗体的应用一.动物细胞工程3.单克隆抗体及其应用资料2.使用高效的细胞毒素类药物进行化疗可以有效杀伤肿瘤细胞。但细胞毒素使用高效的细胞毒素类药物进行化疗可以有效杀伤肿瘤细胞。但细胞毒素

16、没有特异性，在杀伤肿瘤细胞的同时还会对健康细胞造成伤害，这限制了它在临没有特异性，在杀伤肿瘤细胞的同时还会对健康细胞造成伤害，这限制了它在临床上的应用。抗体床上的应用。抗体药物偶联物（药物偶联物（ADCADC）通过将细胞毒素与能特异性识别肿瘤抗原）通过将细胞毒素与能特异性识别肿瘤抗原的单克隆抗体结合，实现了对肿瘤细胞的选择性杀伤。的单克隆抗体结合，实现了对肿瘤细胞的选择性杀伤。ADCADC通常由抗体、接头和药通常由抗体、接头和药物（如细胞毒素）三部分组成，它的作用机制如下图所示。物（如细胞毒素）三部分组成，它的作用机制如下图所示。用于治疗疾病和运载药物 （4）单克隆抗体的应用一.动物细胞工程3

17、.单克隆抗体及其应用A.特异性强、灵敏度高生物导弹单克隆抗体抗癌药物B.疗效高、毒副作用小 （4）单克隆抗体的应用一.动物细胞工程3.单克隆抗体及其应用用于治疗疾病和运载药物 例1.核苷酸合成有两个途径，物质A可以阻断其中的全合成途径(如下图)。正常细胞内含有补救合成途径所必需的转化酶和激酶，制备单克隆抗体时选用的骨髓瘤细胞中缺乏转化酶。现用加入H、A、T三种物质的“HAT培养基”来筛选特定的杂交瘤细胞。关于筛选原理的叙述，正确的是()A.免疫B细胞及其互相融合细胞因全合成途径被A阻断而在HAT培养基上不能增殖B.骨髓瘤细胞及其互相融合细胞因无法进行上述两个途径而在HAT培养基上不能增殖C.杂

18、交瘤细胞因为可以进行上述两个途径所以能在HAT培养基上大量增殖D.HAT培养基上筛选出的所有杂交瘤细胞既能大量增殖又能产生高纯度目标抗体B一.动物细胞工程本堂小结一.动物细胞工程一、概念检测1.下列有关动物细胞融合与植物体细胞杂交比较的叙述，错误的是（ ）A.它们的原理都涉及细胞膜的流动性B.都可以用电融合法或PEG融合法诱导融合C.融合前都需用纤维素酶或果胶酶处理细胞D.前者主要是为了获得细胞产品，后者主要是为了获得杂种植株2.科学家以SARS病毒的核衣壳蛋白为抗原，制备出了单克隆抗体。下列相关叙述正确的是（ ）A. 利用该单克隆抗体可以诊断是否感染SARS病毒B.体外培养单个B淋巴细胞可以获得针对SARS