转基因技术在玉米育种中的应用

1、仅供个人参考击处农林寺桃大学农业生物技术课程论文For personal use only in study andresearch; not for commercial use题 目转基因技术在玉米育种中的应用院（系）：专业 ：班级：姓名：学号：不得用于商业用途仅供个人参考成绩完成日期:转基因技术在玉米育种中的应用摘要：玉米转基因育种是基因工程中基因转移的方法创造玉米新种质、种质资源或新品种。将转基因技术与玉米常规育种的方法与技术相结合，能尽快地培育出符合育种目标与市场需求的新品种、 带来育种水平的提高、创新和突破、加快玉 米育种进程。随着转基因技术的飞速发展及其研究的日趋成熟， 转基因技

2、术在拓 宽玉米种质资源，提高杂交种的抗逆性、抗病虫性、提高产量和品质等方面将发 挥更大的作用，应用前景广阔。关键词：玉米、育种 转基因技术、基因工程植物转基因技术是指利用重组技术、细胞DN给养技术或种质系统转化技术将 目的基因导人植物基因组，并能在后代中稳定遗传，同时赋予植物新的农艺性状， 如抗虫、抗病、抗逆、高产、优质等。常规育种常常受有性杂交亲和性的制约， 而利用转基因技术可以打破物种界限、 克服有性杂交障碍，快速有效地创造遗传 变异，培育新品种、创造新类型，大大缩短新品种育成的时间。因此，随着现代 生物技术的迅速发展，植物转基因技术也蓬勃发展。玉米是重要的粮食作物，也是用基因工程方法进行

3、品种改良的作物。随着世 界首例转基因烟草于1983年培育成功，全球范围内开展了转基因玉米研究。育种者利用转基因技术可以对有益的基因进行有目的的操作，并且可以跨越天然物种屏障把来自其他生物的基因导入到与其毫无亲缘关系的新的寄主生物细胞中， 以获得所需要的理想性状，缩短选育周期，从而培育出高产、优质、多抗的作物 新品种。目前，转基因技术在玉米的遗传育种中得到广泛应用并取得了较好的成 效。玉米转基因已经建立了一套比较完整的理论和技术体系，具技术主要包括： 以农杆菌Ti质粒介导的载体转化技术、利用基因枪、 PE曲的DNAft接导人转 不得用于商业用途仅供个人参考化技术和通过花粉管通道、子房注射的转化技

4、术。转基因技术通过种属问基因的 流动弥补了玉米遗传资源的不足，与常规育种结合必将带来育种上的重大突破， 它是农业生物技术的核心领域，并将成为作物育种的一种重要手段。1转基因玉米产业发展现状从产业化情况来看，近十年来转基因玉米发展十分迅速，已成为全球推广面 积第二的转基因作物。19962007年全球转基因玉米种植面积增加117倍，与转 基因大豆种植面积的增幅基本相当（朱毅华，2008）。从相对地位来看，2007年转基因玉米占全球转基因作物播种面积的比例达到 31%居转基因作物种植面 积第二位，仅次于转基因大豆（占51%）（刘源霞等，2007）。转基因玉米是世界上最重要的转基因作物之一。从各主要种

5、植国来看，1999年，全球12个国家种植的4个主要转基因作物中，玉米占转基因作物总种植面 积的28%。美国种植的转基因玉米（抗虫基因Bt和耐除草剂基因）增加了 220 万hm2,从1998年的810万hm2增力口至U 1999年的1 030万hm2,相当于1999年 美国全国玉米种植面积3 140万hm2的33%。美国科学家还培育出能抗欧洲玉米 螟的转基因玉米，以防欧洲玉米螟威胁玉米种植。到1998年，这种转基因玉米 的种植面积已达到美国玉米种植面积的 20%止匕外，抗根瘤线虫病的玉米新品种 也已研制成功，2 3 年内即可大规模栽培。除美国外，欧盟的西班牙和法国也 已开始种植转基因Bt玉米，面

6、积分别为3万hm2和1 000hm2,而葡萄牙首次在 1999年种植转基因Bt玉米1 000 hm2以上，此外，德国也有小面积的Bt玉米种 植。转基因玉米种植面积迅速增长的一个重要原因是能有效提高玉米单产水平。 就玉米单产水平而言，世界各国之间存在着很大差异，玉米主产国之间单产增长 幅度差异明显。在发达国家，如美国、法国和加拿大，玉米单产均在 8吨/公顷以 上的较高水平。与发达国家相比，我国玉米单产尚有较大差距，200阿仅为5.37 吨/公顷，与阿根廷相近；而巴西、墨西哥、印度等国的玉米单产则处于较低水 平（白云凤等，2003）。2.转基因技术在玉米育种上的应用2. 1抗虫转基因玉米虫害是制约

7、玉米产量的重要因素，目前，在玉米上解决虫害的主要方法 是在玉米植株生长过程中使用化学杀虫剂。但是化学杀虫剂不但杀死害虫，也杀 死害虫的天敌.长此以往会造成生态平衡的破坏和环境污染的日益严重。种植转基因玉米是替代使用杀虫剂的有效方法。目前，抗虫转基因玉米主要应用的是BT 毒蛋白的基因和植物来源的抗虫基因(蛋白酶抑制剂，苏元菌，芽抱杆菌剂基 因、淀粉酶抑制剂基因和凝集素基因等)。BT在芽抱形成的过程中产生杀虫晶体蛋白(ICP) , BT 毒 蛋白在体抱晶体内以原毒素的形式存在。 被昆虫摄取后，在昆虫幼虫的肠道内的 微碱性条件下经蛋白酶水解转变为毒性多肽分子，可与昆虫肠道上敏感的表面 特异受体相互作

8、用，抗乱细胞的渗透平衡，从而导致幼虫停止进食，最终死亡。 王国英等成功地利用基因枪法把BT基因转移到玉米幼胚中，再生植株中 (rylACb) 基因得到表达。美国孟山都公司和Ciba-Geigy公司分别改造合成了 BT杀虫毒蛋白基因，并转入玉米，1996年美国正式批准BT转基因玉米进入商 品化生产,当年推广面积达320万hm2目前，转BT抗虫玉米在美国等国家已经 得到广泛应用。目前，中国转基因抗虫玉米尚处于田间释放阶段。2. 2抗除草剂玉米抗除草剂基因工程是指将抗除草剂耐性基因引人玉米，这是一种高效、无公害 的控制杂草的手段.在抗除草剂基因中，来源于吸水链霉素(Str ep tomyces hy

9、groscop icus) 的bar基因被广泛用作玉米基因转化中的选择标记基因，除 草剂抗性基因的利用不仅可作选择标记，同时使带有抗除草剂抗性的转基因玉 米不受除草剂伤害而显著提高产量，节省大量人力。IMI玉米是美国一家公司开发的抗除草剂玉米，它对除草剂具有高度耐受 性，允许在植物上喷洒除草剂，以控制一年生杂草和宽叶杂草，该产品于1996 年已实现商品化。SR玉米是BASF公司开发的抗除草剂玉米，对除草剂具有高度 耐受性，在出芽后喷施，可防治大多数禾本科杂草。抗病转基因玉米包括转抗细菌、真菌和病毒病基因 3类。其中转抗病毒病的 研究初见报道。由于细菌和真菌病害存在多变的生理小种问题，目前研究较

10、少。 Grimsly等20首次以玉米为材料，用胭脂碱型根癌农杆菌C58将玉米条纹病毒 的cDNA导入玉米幼苗中，使植株表现出病毒感染的症状。杨利国等利用花粉管 通道法将广谱无毒抗病基因PYH157专入玉米自交系。张志燕开展了玉米转化 2-5ARNaseffl水稻黑条矮缩病毒原核表达的初步研究。Murry等21首次将玉米矮 花叶病毒的外壳蛋白基因导入玉米，获得了抗MDMV勺转基因玉米。刘小红等22 利用基因枪法将玉米矮花叶病毒外壳蛋白基因 MDMVCP入玉米优良自交系，后 代对玉米矮花叶病呈现不同程度的抗性。2.4高品质育种玉米虽然高产但品质相对较差，蛋白质、赖氨酸含量较低，其中赖氨酸含量只占种

11、子干重的0.27%左右，不论是作为粮食还是作为饲料，都不能满足高品质的要求。为此各国科学家在玉米品质改良中做了大量卓有成效的工作。Torrent等27将富含赖氨酸基因转入玉米改良醇溶蛋白；张秀君等将富含赖氨酸的马铃 薯花粉特异水溶性蛋白的cDNA转入玉米，使种子干重中赖氨酸含量提高到10% 以上。Sun等29采用同样的方法使转基因玉米种子中赖氨酸含量提高了16%丁明忠等利用花粉管通道法和减压渗透法将大豆总 DNA导入玉米自交系中，筛选 出的高蛋白变异材料其蛋白质含量 比受体高20姒上。2.5创造雄性不育植株利用基因工程创造雄性不育的研究工作已取得初步成效。 Mariani等31将 来自烟草花药

12、绒毡层特异启动子TA29与核酸酶（Barnase）基因融合后转化玉 米，已成功获得雄性不育植株。刘大文等32利用玉米花粉特异启动子ZM13启 动核酸酶（Barnase）基因在玉米花粉中表达，产生了部分不育植株 。3玉米转基因技术3.1 DNA直接转入技术不得用于商业用途仅供个人参考不需依赖生物媒体，将特殊处理的裸露DNAft接导入玉米细胞，实现基因的转化。3.1.1 基因枪法基因枪法又称微弹轰击法(microproject ile bombardment)其基本原理是： 将外援DNA包被在微小的金粒或鸨粒表面，然后在高压的作用下微粒被高速射 入受体细月fi或组织，微粒上的DNAS入细胞后，整合

13、到植物染色体上，得到表达, 从而实现基因的转化。1989年Klein首次用基因枪法将GUS和Pat基因倒入玉米悬浮细胞系获得 转基因玉米；Gordon-Koziel 等用基因枪法将构建的CryI A ( b)基因转入玉米幼 胚，培育出抗虫玉米，Vain等将胚性细胞进行高渗透压处理，显著提高了转化 效率。1994年赵天永、王国英、谢友菊用基因枪将 GUS基因导入玉米的茎尖组 织；1995年王国英用基因枪法将防御素基因转入玉米并再生植株。原亚萍以玉 米愈伤组织为受体，用基因枪轰击将防御素基因装入玉米细胞，经卡那霉索筛 选及分化培养获彳# 一再生植株。1999年报道了中国农业科学院生物技术中心董 云

14、洲等用基因枪法转化花粉获得转基因谷子和玉米，所用基因为GUS。转玉米频率为0. 5% 0. 21% ,主要技术过程为收集花粉，用JQ-700型基因枪将PBII21 质粒DNA射入花粉，经人工授粉得到大量的种子，种子在加卡那霉素的培养液 中萌发生长，筛选到抗生苗，经GUS组织化学和分子杂交证明外援基因已整合 与表达。随着对金属粒子的理化特性、DNA与金属粒子的结合和靶组织特性、轰 击前后的培养条件等深入研究和技术优化。 基因枪法在玉米遗传转化中得到了广 泛的应用，已经成为玉米基因转化的主要方法之一。其优点是不用进行原生质体再生培养，受体材料、靶细胞可以有广泛的来源， 如包括细胞悬浮培养物、愈伤组

15、织、分生组织、未成熟胚等等；不受基因型的限 制，可适用于不同的物种以及同一物种的不同品种。3.1.2 PEG 法PEG是细胞融合剂，能促进细胞膜间融合，利于外源DNA进入原生质体。PEG法建立较早，它随原生质体的发展而发展。这种方法成本低，结果比较稳定，存在的问题是建立可靠高效的原生质体再生系统比较困难。它和电激法结合使用会提高转化效率3.1.3 电击法用高压电脉冲作用对细胞“电击穿孔”，形成可逆的瞬间通道，促进外源 DNA的摄取。电激法可以用于原生质体，还可以用于胚性悬浮细胞系、愈伤组 织和幼胚等。操作比较简单，但转化效率低。3.2 载体转化技术农杆菌是一种天然的植物基因转化系统，具含有的T

16、i或Ri质粒具有携带外源 基因的功能。经过遗传工程的方法对农杆菌及质粒加以改造，并装入外源基因， 借助农杆菌对植物的感染特性，将外源基因带入植物细胞内。Ti质粒的研究较详细而且应用广泛。T i质粒根癌农杆菌在感染植物时，能将其环状Ti质粒上 的一段DNA插入至被感染植物基因组中，并能稳定地遗传给后代，但细菌本身 不进入被感植物细胞，由此发展出以农杆菌Ti质粒为载体的植物遗传转化系 统。该转化系统是目前研究最多、理论机理最清楚、技术方法最成熟的基因转化 途彳全。Grimsley等通过农杆菌介导将玉米条纹病毒cDNA导入玉米幼苗,第一次 证实农杆菌能够侵染玉米。Ishida等报道用玉米幼胚与根癌农

17、杆菌共培养获得了高效转基因植株，共 通过对菌株、菌液浓度、幼胚基因型等因素的优化，使转化效率高达30%,也成 为玉米遗传转化的一个里程碑。目前已分离出大量的根癌农杆菌菌株，能有效转 化玉米的常用菌株为LBA4404,常用的载体有PSB131和PTOK233匀为超双元载 体，对转化玉米是非常有效的。3.3 种质转化技术种质转化技术指外源DNA 昔助生物自身的种质系统或细胞结构功能实现的 转化，进展比较大的是花粉管通道法和子房注射法。不得用于商业用途仅供个人参考花粉管通道法是授粉后使外源基因能沿花粉管渗入，经过珠心通道进入胚 囊，转化尚不具备正常细胞壁的卵、 合子或早期胚胎细胞。花粉管通道法无需建

18、 立愈伤组织等组织培养体系，同时不受植株基因型的限制，既可向玉米导入目的 基因，也可转移含有目的基因性状的供体总 DNA同时，该技术具有操作简单、 方便、育种时间短、任何基因源都可用来基因转化并可直接运用到常规育种。这对于目前玉米大多数农艺性状基因还没有完全分离出来的现状具有重要的现实 意义。花粉管通道法是我国科学家周光宇先生于1978年首创并推广的。他首先应用 花粉管通道法在棉花基因转移上取得成功。杨利国等经过探索创造出一套较好的 操作方法并获得成功，以外源总DNA为供体处理一批试材，其后代在株高、成熟度和抗病性上均表现出不同程度的变异。祁永红等陆续报道了利用花粉管通道 等技术成功地将外源总

19、DNA（包括大豆DNA等）导入玉米自交系，不仅建立了成 熟的导入技术，同时获得了具有广泛变异的不同类型的自交系， 包括与玉米品质 有关的氨基酸含量的变化等。但由于玉米花丝较长，一般操作难以成功，而且受 授粉时间的局限且不能转化大片段的外源 DNA因此花粉通道法的应用也受到一 定局限。3.3.2子房注射法使用显微注射仪或微注射针将含有目的基因载体的外源DNA溶液直接注入处于减数分裂时期的子房利中，靠子房产生的压力及卵细胞的吸收使外源DNA进入受精的卵细胞中，实现基因的转化。丁群星等首次报道用子房注射法将Bt抗虫毒蛋白基因导入玉米自交系，获得了正常的转化体。沈世华等利用离体子房 注射法转化普通玉米

20、获得成功，获得种子。该方法避开了组织培养过程，利用植 物本身的有性繁殖过程进行繁殖， 避免了转化体早期天亡、不孕和不育等，比较 容易得到种子，但转化后代群体大，需要有简便可靠的筛选方法。5玉米转基因育种中存在的问题及应对策略转基因育种就是将目的基因转入整合到受体细胞，并在后代种稳定的遗传和 表达，通过选择鉴定，得到目的植株。也就是说不是所有的转基因植株都是目的 不得用于商业用途仅供个人参考植株，还得需要多种程序的进一步鉴定， 才能确定它的价值。在转基因玉米的研 究方面，首先是生物技术研究费用昂贵。 主要是表达量太低，转化体系还不是特 别稳定，玉米的基因型限制还仍然是一个难题。 第二个限制因素是

21、缺少有用的基 因。随着分子遗传学研究的发展，现在育种家能够鉴定任何有用的基因， 并进行 定位和分离。第三个限制因素是所谓的基因沉默现象， 即新插入的基因常常是关 闭的。现在许多科学家正在研究植物基因开关原理， 并试图对这一过程进行操作。关于表达量低的问题，可以对基因进行修饰，使用强启动子、增强子、内 含子等，现已取得了比较好的效果。基因的表达需要特定的内环境，包括插入的 位点、拷贝数等，目前来说这些都还不精确，所以最有效的方法就是加大转化群 体、选择淘汰。如果只限于特定的几个基因型，再好的基因也将很难应用于实际 生产，这也将成为转基因育种无法逾越的障碍， 基于现在还没有很好的办法解决 这一难题

22、，所以应该考虑 DNA专入时不同方法放交叉使用。病虫的适应性很强，在农药的选择压力下，玉米的抗性会逐渐消除。这就需 要设高门槛，让病虫无法逾越，达到杀虫抗病的目的。单价杀虫基因可以考虑换 成双价或多价的基因，也可以同时使用两种或两种以上不同机理的抗病杀虫基 因，是玉米的抗性水平提高。在获得抗性植株后，其他一些重要的农艺性状也可能退化，针对这种情况， 可以使该植株与同群体为转化姊妹株侧交，有可能得到除了整合目的基因之外， 染色体其他部位都正常的植株。6玉米转基因育种的应用前景在玉米育种技术不断更新的今天，转基因技术在拓宽玉米自交系种质素材， 提高杂交种抗逆、抗病、产量等方面将扮演越来越重要的角色

23、，为育种工作者将 科技转化为现实生产力提供重要的理论依据。我们应该加强遗传工程的基础研究 和应用基础研究，特别是做好有用基因的分离，载体系统的寻找、选择和构建， 建立和逐步完善应用技术研究，进一步提高玉米转基因的转化率，完善玉米转基 因的技术体系。目前大多数分子标记仍停留在实验室理论研究阶段， 分子标记技 术很少能用于育种实践，分子标记技术用于大规模育种和种质鉴定还有一段距 离。我们应把分子标记技术同常规玉米育种的实践相结合，充分利用国外研究成 果，不做重复研究，结合我国实际情况，充分发掘我国特有玉米种质资源中高产、 优质和高抗的有关新基因并进行相关标记的定位和精细定位，拥有自己的知识产权并尽

24、快地应用到育种实践中，为我国玉米育种事业做出贡献。目前高油玉米和 高直链淀粉玉米的研究已为很多玉米育种家所重视，如何加快这两个性状的精细 定位、利用分子标记进行选择将是玉米育种研究的重点。在分子生物学飞速发展 的今天，分子标记技术在玉米育种中发挥越来越大的作用。可以预料，在不久的将来，玉米的很多重要的性状如抗虫抗病、抗旱、高油、高淀粉等性状都能像玉 米QPMt种一样，通过某个紧密连锁的标记来进行选择，大大缩短玉米品种的育 种年限。1罗振铎，李晓辉.玉米科学，2006, 14 (4) : 46.21罗振铎.李晓辉.我国转基因玉米研究进展和产业化分析口.玉米科学，2006, 14(4) : 4-6 .6王关，方宏筠植物基目工程M .北京：科学出版牡，2002.【3】丁明忠，潘光堂，荣廷昭，等.21世纪玉米遗传育种展望.玉米遗传育种国 际学术讨论会文集，2000.4 Jeli TO. Agrobaeterium tumefaeiem-Madiated Transformation of Pants： emerging factors that influence efficiency . Biotechnology and Molecular Biology Review , 2006, 1(1): 12-20.【5】王罡，杜鹃，等.用花粉管通道法将Bt杀虫基因导入玉米自交系的研究