微生物的培养

1、实验一常用培养基的制备、灭菌与消毒实验二土壤中微生物别离纯化培养实验三菌种保藏实验四细菌形态观察及单染色实验五放线菌及霉菌形态观察实验六革兰氏染色及芽孢染色实验七酵母菌的形态观察及死活细胞的鉴定实验八微生物直接计数法及测微技术实验九大肠杆菌生长曲线的测定实验十水中细菌总数的测定实验十一细菌细胞的生化反响实验实验十二噬菌体的别离、纯化及效价测定实验一常用培养基的制备、灭菌与消毒一、实验目的了解培养基的配制原理；掌握配制培养基的一般方法和步骤；了解常见灭菌、清毒根本原理及方法；掌握干热天菌、高压蒸汽灭菌及过滤除菌的操作方法。二、实验原理培养基是人工按一定比例配制的供微生物生长繁殖和合成代谢产物 所

2、需要的营养物质的混合物。培养基的原材料可分为碳源、氮源、无机盐、生长因素和水。根据微生物的种类和实 验目的不同，培养基也有不同的种类和配制方法。牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌根底培养基，有时又称为普通培养基。由于这种培养基中含有一般细胞生长繁殖所需要的最根本的营养物质， 所以可供微生物 生长繁殖之用。三、试剂与器材1器材 试管、三角瓶、烧杯、 量筒、玻璃棒、培养基、分装器、天平、牛角匙、高压蒸汽灭菌锅、pH度纸、棉花、牛皮纸、 记号笔、麻绳、纱布、吸管、 培养皿、电烘箱、注射器、 微孔滤膜过滤器、镊子等。2试剂牛肉膏、蛋白胨、NaCI、琼脂四、实验内容1. 称量t溶化t调p

3、H过滤t分装t加塞t包扎t火菌t无菌检查2. 干热灭菌：装入待灭菌物品 T升温T恒温T降温T开箱取物3. 高压蒸汽灭菌：加水T装物品T加盖T加热T排冷空气T加压T恒压T降压回零T排汽t 取物T无菌检查4. 过滤除菌：组装灭菌 T连接T压滤T无菌检查T清洗灭菌五、关键步骤及考前须知1. 要严格按配方配制。2. 调pH不要过头。3. 干热灭菌要注意物品不要堆放过紧，注意温度的时间控制，70oC以下放物、取物。4. 高压灭菌要注意物品不要过多，加热后排除冷空气，至U时降压回零取物。5. 过滤除菌要注意各部件灭菌，压滤时，压力要适当，不可太猛太快，滤膜要注意清洗保存。实验二 土壤中微生物别离纯化培养一

4、、实验目的掌握倒平板的方法和几种常用的别离纯化微生物的根本操作技术；了解不同的微生物菌落在斜面上、半固体培养基和液体培养基中的生长特征； 进一步熟练和掌握微生物 无菌操作 技术； 掌握微生物培养方法。二、实验原理从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的别离与纯化。常用的别离、纯化方法：单细胞挑取法，稀释涂布平板法，稀释混合平板法，平板划线法 稀 释涂布平板法步骤：倒平板-制备土壤污水稀释液-涂布-培养-挑菌落； 平板划线法步骤： 倒平板-标记培养基名称-划线。三、试剂与器材1器材盛9m1无菌水的试管、盛 90m1无菌水并带有玻璃珠的三角 烧瓶、无菌玻璃涂棒、 无菌吸

5、管、接种环、酒精灯、无菌培养皿、显微镜、血细胞计数板等。2试剂 牛肉膏蛋白胨培养基，高氏1号培养基，查氏培养基 四、实验内容2. 微生物别离纯化：稀释涂平板法，平皿划线别离法，微生物培养技术五、关键步骤及考前须知1掌握含菌培养基的配制，严格控制温度。2. 平板划线应防止染菌，同时应注意划线深度及密度。实验三菌种保藏一、实验目的菌种保藏的根本原理。2掌握常用的几种不同的菌种保藏方法。二、实验原理微生物个体微小、代谢旺盛、生长繁殖快，如果保存不妥容易发生变异和杂菌污染，甚至导致细胞死亡等现象。因此，保存好菌种是非常必要和重要的。常用的菌种保藏方法包括传代培养法、载体法、悬液法、冷冻法和真空枯燥法三

6、、试剂与器材1.材料大肠杆菌、青霉菌、放线菌液体石蜡、甘油、五氧化二磷、95 %乙醇、10 %盐酸、无水氯化钙、食盐、干冰3.器材 尢菌吸管、尢菌滴管、尢菌培养皿；安额管、冻十、十燥器、真泵器、真空泵、真空压力表、喷灯、L形五通管、冰箱、低温冰箱 一30 C 、超低温冰箱和液氮罐等。四、实验内容五、关键步骤及考前须知1. 清楚各种保藏方法的优缺点，针对不同要求选择适宜的保藏方法。 安瓶时防止封闭不严。3. 液氮冻存操作应防止冻伤。实验四细菌形态观察及单染色一、实验目的1. 了解简单染色法的原理，并掌握其操作方法。2. 学习并掌握微生物涂片、染色的根本技术和无菌操作技术。3. 稳固显微镜油镜的使

7、用方法。4. 初步认识细菌的形态特征。二、实验原理细菌个体微小，且较透明，必须借助染色法使菌体着色，与背景形成鲜明的比照，以便在显微镜下进行观察。根据实验目的不同，可分为简单染色法、鉴别染色法和特殊染色法等。 简单染色法是最根本的染色方法，是利用单一染料对细菌进行染色。此法操作简便，适用于菌体一般形状和细菌排列的观察。常用碱性染料进行简单染色。三、试剂与器材1. 材料 大肠杆菌，枯草芽孢杆菌2试剂 吕氏碱性美蓝染液或草酸铵 结晶紫染液、齐氏石炭酸复红染液。3器材显微镜、酒精灯、载玻片、接种环、双层瓶内装香柏油和二甲苯等。四、实验内容简单染色法：涂片 t枯燥t固定t染色t水洗t枯燥t镜检五、关键

8、步骤及考前须知1. 涂片时，生理盐水及取菌不宜过多，涂片应尽可能均匀，2水洗步骤水流不宜过大，过急，以免涂片薄膜脱落。实验五放线菌及霉菌形态观察一、实验目的放线菌、霉菌形态观察的原理。2. 学习并掌握观察放线菌、霉菌形态的操作方法。3. 初步了解放线菌、霉菌的形态特征。二、实验原理放线菌是指能形成分枝 丝状体或菌丝体的一类革兰氏阳性细菌。常见放线菌大多能形成菌丝体，紧贴培养基外表或深入培养基内生长的叫基内菌丝简称 基丝，基丝生长到一定阶段还能向空气中生长出 气生菌丝简称 气丝，并进一步分化产生 孢子丝及孢子。有的放 线菌只产生基丝而无气丝。在显微镜下直接观察时，气丝在上层、基丝在下层，气丝色暗

9、， 基丝较透明。孢子丝依种类的不同，有直、波曲、各种螺旋形或轮生。霉菌可产生复合分枝的菌丝体，分基内菌丝和气生菌丝，气生菌丝生长到一定阶段分化产生 繁殖菌丝，由繁殖菌丝产生孢子。霉菌菌丝体尤其是繁殖菌丝及孢子的形态特征是识别不同种类霉菌的重要依据。霉菌菌丝和孢子的宽度通常比细菌和放线菌粗得多，常是细菌菌体宽度的几倍至几十倍，因此，用低倍显微镜即可观察。人们设计了各种培养和观察方法，这 些方法的主要目的是为了尽可能保持放线菌自然生长状态下的形态特征。本实验采用插片 法。插片法：将放线菌接种在琼脂平板上， 插上灭菌盖玻片后培养，使放线菌菌丝沿着培养基外 表与盖玻片的交接处生长而附着在盖玻上。 观察

10、时，轻轻取出盖玻片，置于载玻片上直接镜 检。这种方法可观察到放线菌自然生长状态下的特征，而且便于观察不同生长期的形态。三、试剂与器材黑曲霉、青霉和根霉，细黄链霉菌或青色链霉菌，灭菌的高氏I号琼脂和灭菌的查氏培养基。2. 实验器材 经灭菌的：平皿、玻璃纸、无菌吸管、盖玻片、玻璃涂棒，以及载玻片、接种 环、接种铲、镊子、显微镜等。四、实验内容 倒平板t接种t插片t培养t镜检五、关键步骤及考前须知1. 倒平板要厚一些，接种时划线要密。2. 插片时要有一定角度并与划线垂直。3. 观察时，宜用略暗光线；先用低倍镜找到适当视野，更换高倍镜观察。4. 如果用0.1%美蓝对培养后的盖玻片进行染色后观察，效果会

11、更好。实验六革兰氏染色及芽孢染色一、实验目的革兰氏染色法和芽孢染色法的原理，并掌握其操作方法。2. 了解革兰氏染色法在细菌分类鉴定中的重要性。3. 学习并掌握微生物涂片、染色的根本技术和无菌操作技术。4. 学习显微镜油镜的使用方法。5. 初步认识细菌的形态特征。、实验原理革兰氏染色法的根本步骤是：先用初染剂结晶紫进行染色，再用碘液媒染，然后用乙醇或丙酮脱色，最后用复染剂如番红复染。经此方法染色后，细胞保存初染剂蓝紫色的细菌为革兰氏阳性菌；如果细胞中初染剂被 脱色剂洗脱而使细菌染上复染剂的颜色 红色，该菌属 于革兰氏阴性菌。革兰氏染色反响是细菌重要的鉴别特征， 为保证染色结果的正确性， 采用 标

12、准的染色方法是十分必要的。芽孢染色法的根本原理，用着色力强的染色剂 孔雀绿或石炭酸复红，在加热条件下染色， 使染料不仅进入菌体也可进入芽孢内，进入菌体的染料经水洗后被脱色，而芽孢一经着色难以被水洗脱，当用比照度大的复染剂染色后，芽孢仍保存初染剂的颜色，而菌体和芽孢囊被染成复染剂的颜色，使芽孢和菌体更易于区分。三、试剂与器材1. 材料：枯草芽孢杆菌 1218h营养琼脂斜面培养物，大肠杆菌约24h营养琼脂斜面培养物2试剂革兰氏染色液结晶紫液、碘液、95 %乙醇、番红液。5%孔雀绿水溶液3. 实验器材 小试管、滴管、烧杯、试管架、滤纸、木夹子、载玻片、盖玻片、凹载玻片、无菌水、显微镜等、接种环、双层

13、瓶内装香柏油和二甲苯、擦镜纸、生理盐水等。四、实验内容1. 革兰氏染色法制片t初染t媒染t脱色t复染t镜检。2.Schaefer-Fulton 氏染色法 制片t染色t水洗t复染t水洗t镜检。五、关键步骤及考前须知1. 涂片时，生理盐水及取菌不宜过多，涂片应尽可能均匀，2. 乙醇脱色是革兰氏染色操作的关键环节，严格掌握脱色时间。实验七酵母菌的形态观察及死活细胞的鉴定一、实验目的1. 观察酵母菌的形态特征、出芽生殖方式，并掌握酵母菌与细菌形态特征的区别。2. 学习鉴别死活细胞的实验方法。二、实验原理酵母菌是单细胞的真核微生物，菌体比细菌大而且不运动。酵母菌的繁殖方式分为无性繁殖和有性繁殖两种，以无

14、性繁殖为主。芽殖是酵母菌普遍的无性繁殖方式，少数为裂殖；有性繁殖是产生子囊和子囊孢子。本实验是通过美蓝染液水浸片和水一碘液水浸片来观察酵母的形态和芽殖方式。美蓝是一种无毒性的染料，它的氧化型呈蓝色，复原型无色。用美蓝对酵母活细胞染色 时，由于细胞的新陈代谢作用，细胞内具有较强的复原能力，能使美蓝由蓝色的氧化型变为 无色的复原型，而对代谢作用微弱或 死细胞，无此复原能力或复原能力极弱，而被美蓝染成蓝色或淡蓝色。因此，不仅用此法可观察酵母细胞形态，也可用来鉴别酵母菌的死细胞和活细胞。三、试剂与器材1. 材料 酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae 或卡尔酵母Saccharomyc

15、es calsbergensis 培养2天左右的麦芽汁或豆芽汁液体培养物。2试剂0.05 %和0.1 %吕氏碱性美蓝染色液、革兰氏染色用的碘液。3器材显微镜、载玻片、盖玻片、接种环、洒精灯等。四、实验内容1. 美蓝浸片观察酵母培养t制片t染色t镜检t 30分钟后再镜检五、关键步骤及考前须知1. 染液不宜过多或过少，否那么，在盖上盖玻片时，菌液溢出或出现大量气泡。2. 用镊子取一块盖玻片，先将一侧与菌液接触，然后慢慢将盖玻片放下，使其盖在菌液上， 盖玻片不宜平着放下，防止气泡产生。实验八微生物直接计数法及测微技术一、实验目的1. 了解血球计数板计数原理，并掌握计数方法。2. 掌握用测微尺测定微生

16、物大小的方法。二、实验原理显微镜直接计数法是将一定稀释的菌体或孢子悬液注入血球计数板的计数室中，于显微镜下直接计数的一种简便、快速、直观的方法。因为计数板是一块特别的载玻片。其上由四条槽构成三个平台；中间较宽的平台又被一短横槽隔成两半，每一边的平台上各刻有一个方格网，每个方格网共分为九个大方格，一种是一个大方格分成25个中方格，而每个中方格又分成16个小方格见图2 344;另一种是一个大方格分成 16个中方格，每个中方格 又分成25个小方格，无论哪种每个大方格中的小方格都是400个。每一个大方格边长为0. 1mm，所以计数室的容积为 0. 1mm3。计数时，通常只用 5个中格内的菌体孢子数 即

17、可。然后求出每个中方格的平均值，再乘上25或16，得出一个大方格中的总茵数，再换25个中方格计数板，那么计算方法为：lml菌液中的总菌数=平均每个中格中菌的个数 X25X104 W=50000NM个微生物细胞的大小是微生物根本的形态特征，也是分类鉴定的依据之一。微生物大小的测定，需要在显微镜下，借助于特殊的测量工具 一一测微尺，包括目镜测微尺和镜台测微尺。镜台测微尺是中央局部刻有精确等分线的载玻片，一般是将 1mm等分为100格，每格长 0. 01mm即10pm。镜台测微尺并不直接用来测量细胞的大小，而是用于校正目镜测微尺 每格的相对长度。三、试剂与器材1. 材料酿酒酵母、藤黄微球菌和大肠杆菌

18、的染色标本片、酿酒酵母24h马铃薯斜面培养物。2. 实验器材 细胞计数板、显微镜、盖玻片、无菌毛细滴管、目镜测微尺、镜台测微尺、载 玻片、盖玻片、显微镜等。四、实验内容1. 微生物直接计数法菌悬液制备t镜检计数室t加样品t显微镜计数t清洗血细胞计数板2. 微生物测微技术装目镜测微尺t校正t菌体大小测定五、关键步骤及考前须知1. 防止加样空气泡产生。2调节显微镜光线的强弱适当。实验九大肠杆菌生长曲线的测定一、实验目的生长曲线特征和繁殖规律，并学会绘制生长曲线。2. 复习光电比浊法测量细菌数量的方法。二、实验原理将一定量的细菌转入新鲜液体培养基中，在适宜的条件下培养细胞要经历延迟期、对数期、稳定期

19、和衰亡期四个阶段。以培养时间为横坐标，以细菌数目的对数或生长速率为纵坐 标作图所绘制的曲线称为该细菌的生长曲线。 不同的细菌在相同的培养条件下其生长曲线不 同，同样的细菌在不同的培养条件下所绘制的生长曲线也不相同。三、试剂与器材1.材料与试剂 大肠杆菌、LB液体培养基70ml、分装2支大试管5ml /支、剩余60ml装 入250ml的三角瓶。2器材722型分光光度计、恒温振荡摇床、无菌试管、无菌吸管等。四、实验内容编号t接种t培养t比浊测定五、关键步骤及考前须知1.测定0D值时，要求从低浓度到高浓度测定实验十水中细菌总数的测定一、实验目的细菌总数测定的方法。2. 了解水源水的平板菌落计数的原理

20、。二、实验原理本实验应用平板计数技术测定水中细菌总数。由于水中细菌种类繁多，它们对营养和其他生长条件的要求差异很大， 不可能找到一种培养基在一种条件下，使水中所有的细菌均能生长繁殖，因此，以一定的培养基平板上生长出来的菌落，计算出来的水中细菌总数仅是一种近似值。目前一般是采用普通牛肉膏蛋白胨琼脂培养基。三、试剂与器材1. 试剂 牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，火菌水2. 器材 灭菌三角瓶，灭菌的带玻璃塞瓶，灭菌培养皿，灭菌吸管，灭菌试管等。四、实验内容五、关键步骤及考前须知实验十一细菌细胞的生化反响实验一、实验目的了解并掌握细菌鉴定中常用生理生化反响的原理和方法。二、实验原理各种细菌由于具有不同的酶系

21、统，致使它们能利用不同的底物，或虽然可以利用相同的底物，却产生不同的代谢产物，因此可以利用各种生理生化反响来鉴别细菌。糖发酵是最常用的生化反响，存在于大多数细菌中。不同的细菌在糖的分解能力上存在很大的差异。有些细菌能分解某种糖并产生酸性物质如乳酸、丙酸、醋酸等和气体如二氧化碳、氢、甲烷等，而有些细菌只产生酸不产生气体。例如大肠杆菌分解乳糖和葡萄糖产 酸并产气，普通变形杆菌分解葡萄糖产酸产气，但不能分解乳糖。酸的产生可利用指示剂来判断。在培养基中参加溴甲酚紫 pH5 . 2为黄色，pH6 . 8为紫色，当发酵产酸时，使培养 基由紫色变为黄色。气体的产生可由发酵试管中倒置的德汉氏小管中有无气泡的出现来验证.三、试剂与器材1.材料大肠杆菌、普通变性杆菌、产气杆菌、糖发酵培养基、蛋白胨水培养基、葡萄糖蛋白 胨水培养基。2试剂甲基红试剂、40 % K