复幼提高核桃不定根发生能力的多基因作用机制

1、复幼提高核桃不定根发生能力的多基因作用机制核桃 (Juglans L.)为难生根木本植物。通过连续嫁接、埋干黄化等措施, 成功地实现了成龄品种的复幼, 并得到大于 98%的生根率。这项技术解决了核桃扦插无性繁殖的难题, 推动了良种整株无性系化进程,也为深入探讨树木器官的发生机制提供了理论依据和研究平台。本研究在前人工作的基础上 , 采用 RNA-seq技术和生物信息学分析的方法, 着眼于多基因转录调控网络 , 探索复幼提高核桃不定根发生能力及调控不定根发生、发育过程中的分子机制 , 获得如下结果： 1. 建立了高频、同步的核桃复幼嫩枝扦插不定根发生体系。(1) 插穗的制备：成龄品种通过连续 1

2、0 次以上嫁接 , 结合埋干黄化技术 , 可获得同步性高、 生根率稳定和生根速度快的复幼嫩枝插穗, 扦插后 9d 生根率达 98%以上； (2) 插穗的最佳表型特征：半木质化、长度14 cm18 cm、46 节位、复叶与嫩茎夹角 4560°； (3) 插穗的扦插前处理：实验表明生长调节剂IBA+NAA(4:1) 组合 5 mg·L-1 速蘸插穗基部 , 较单一 IB A 5 mg · L-1 速蘸插穗基部更高效更经济。 2. 确立了以插穗表型特征和组织学观察为标准的精准取样方法：诱导期：插后 1 d-2d, 插穗基部无明显表型变化。组织学观察发现形成层细胞开始活动

3、、核仁变大、细胞质变浓、染色加深；形成层细胞旺盛分裂期： 插后 3d-5d, 插穗基部增粗 , 表面出现不规则点状突起。组织学观察可见到形成层细胞进入旺盛分裂, 细胞层数明显增多；根原基形成期：插后 6d-8d, 插穗基部继续增粗 , 表面出现纵向裂缝并随扦插时间的延长而加宽；组织学观察发现 , 特定位置的束间形成层细胞继续分裂, 并开始不对称的平周和垂周分裂 , 逐渐形成轮廓近圆形的根原基；根原基伸长期：扦插9d 后, 插穗基部的裂口处可见到类似不定根的乳白色突起。根原基外侧细胞分裂速度加快, 细胞群体积持续增大、 伸长 , 并逐渐分化出维管组织。3. 利用 RNA-seq技术获得不定根发生

4、、 发育过程中的基因时序表达数据,得到如下结果： (1) 原始数据经质控过滤 , 收获了 290.0 G 高质的 clean reads。经 de novo 组装 , 共得到 58920 条 unigenes, 对应 99 375 条转录本 (N50=1485)；(2) 依据现有数据 , 参照 Nr 蛋白数据库中筛选出的前 21位植物物种的基因组和转录组注释信息 , 经 Blast 比对 , 其中 14670 条 Unigenes 获得功能注释。 4. 复幼提高核桃不定根发生能力的差异网络分析结果如下： (1) 基于模型的表达模式聚类及组内差异分析 , 筛选出复幼前后嫩枝插穗在不定根诱导发生过

5、程中的差异表达基因 962 条。经 GO功能富集分析和 KEGG代谢通路分析 , 这些差异基因主要参与植物激素信号转导、植物生物节律及 - 亚麻酸和亚油酸代谢等生物学过程； (2) 复幼处理前后 ARF、 MYB、 MYB、NAC、WRKY以及 WOX等一些转录因子家族成员及其靶基因间调控关系在不定根发生过程中发生显著变化 , 推测这些变化就是复幼提高不定根能发生能力的重要原因； 5. 复幼嫩枝插穗不定根发生过程中内参基因的筛选及测序结果验证。采用qRT-PCR技术 , 对 5 个候选内参基因在不定根发生过程中5个时期的表达进行分析 , 并通过 geNorm软件确定了最佳内参基因为GAPDH和ACT2;选择 10 条 Unigenes, 以 GAPDH为内参基因 , 对 RNA-seq结果进行验证。结果显示 RNA-seq计算的表达量结果与qRT-PCR分析结果高度吻合 , 从而证明 RNA-seq测序结果的准确性。 6. 建立了木本植物 RNA-seq数据中 lncRNA 鉴定及功能预测分析流程。以公共数据库 (NCBI) 中桑树 (Morus notabilis)的 RNA-seq数据为例。共鉴定出 1133 条新的 lncRNAs, 其中 106 条分别在根、树皮、叶片、雄花和芽中特异表达。结合特异表达和基因组定位信息