果树组织培养脱毒技术与检测方法

1、果树组织培养脱毒技术与检测方法王晓丹（化学与生命科学学院 110802 彭庆园）(浙江省缙云县农业局特产站 缙云323000摘要：果树组织培养有着十分广阔的应用前景，然而在果树组织培养过程中，果树容易受到病毒的侵染，一旦果树感染上了病毒，其产量和质量都会大大减少。为了提高农产品商品产出率和能够有效的保持优良品种的特性，介绍了几种果树脱除病毒的方法及其原理、方法和优缺点，并介绍了几种常用的病毒检测方法及其优缺点。关键词：果树组织培养；脱毒技术；检测技术果树是多年生植物，在长期无性繁殖过程中，大多感染和积累了多种病毒。1965年世界各国在落叶果树上共发现84种病毒病，到2003年增加到180种。目

2、前。我国各地调查鉴定明确的果树病毒及类病毒病害约60种，因而每年都必须更新母株。病原菌的侵染并不都会造成植物的死亡，很多病毒甚至可能不表现任何可见症状，然而，在果树中病毒的存在会减少其产品的产量和质量。果树病毒病与其他一年生的植物的病毒病相比，有很多不同之处，其发生特点具有全身侵染、嫁接侵染、混合侵染、潜伏侵染。然而果树病毒也是植物病毒的一部分，就病毒本质来讲。果树病毒与其他植物病毒是相同的，即病毒在植物体内的分布是不均匀的。利用这一特点，采取植物茎尖生长点等组织或器官进行组织培养，可以达到脱去病毒恢复和提高植物的优良品质和性状的目的。植物脱毒后，生长再浇回头水，以后注意保持苗床湿润。1 脱毒

3、技术11 热处理法将植物材料在高于正常温度的环境条件下处理定的时间，使植物病原失去活性或钝化病毒，而植物的生长受到较小的影响或在高温生长加快，这样植物的新生部分不带病毒，取该无病毒组织培育即可获取无病毒植株，是园艺植物病毒脱除处理中应用最早和最普遍的方法之一。现在更常用的方法是将病毒感染的植物用3538热空气处理24周或者更长时间进行脱毒然后要立即把茎尖切下来嫁接到无病的砧木上。此法尤其适合处理生理干旱的材料和处于休眠状态的果树。其原理是利用病毒和寄主植物对高温的忍耐性的差异，使植物的生长速度超过病毒的扩散速度得到一小部分不含病毒的植物分生组织，进行无毒个体培育31。热处理脱毒法已应用多年，被

4、世界多个国家利用。该项技术要求的设备条件比较简单，脱毒操作也比较容易。主要缺陷：热处理只对那些球状的病毒(如葡萄扇叶病毒41、苹果花叶病毒51或线状的病毒(如康乃馨病毒 有效果，而对杆状病毒(如牛蒡斑驳病毒 不起作用。很多不能由单独的热处理消除的病毒，可以通过茎尖培养和热处理相结合，或单独的茎 尖培养而消除。12 茎尖培养脱毒法茎尖培养脱毒原理：在顶端生长点的分生组织病毒浓度低，大部分细胞不带病毒，取顶端生长点培养可获得无病毒植株，越接近生长点，病毒含量越少。病毒的DNA 随细胞的分裂而复制，两者存在竞争，生长点分裂的速度比病毒快，一般来说不含病毒。现在茎尖培养脱毒法已经成为植物无毒苗生产中应

5、用最广泛的一种方法。茎尖培养方法：最主要的影响因素就是茎尖大小，一般要求茎尖长度小于1 mm 。技术上通常切取茎尖越小，脱毒效果越好，但是茎尖培养成活率变低。曹为玉等研究发现，葡萄茎尖长度与存活率成正相关，与脱毒率成反相关。当切取茎尖长度为0203 mm时，存活率为2138 ，脱毒率为91497；当切取O 5 mm以上时，存活率为7583 脱毒率仅为7067654对于不同的李属植物，脱毒效果主要取决去病毒的类型而不是植物种类。近来，Barlass 等(1982采用一种特殊的茎尖培养方法培育无病毒葡萄在无菌条件下，用解刀取大小为1 mm 的茎尖其结果是，不定芽发芽在叶原基的左边，脱毒株率取决于培

6、养时的温度同。13 热处理与茎尖培养相结合法茎尖培养脱毒法脱毒率高，但存在的缺点是植物的存活率低。为克服这一缺点，经常是将热处理与茎尖培养相结合来使用。热处理与茎尖培养相结合之所以能够提高脱毒效果。是由于热处理可使植物生长本身所具有的顶端免疫区得以扩大。有利于切取较大的茎尖(约1mm ，从而能够提高培养的成活率。14 抗病毒药剂法这是一种新的脱毒方法其作用原理是抗病毒药剂在三磷酸状态下会阻止病毒RNA 帽子结构17Schuser 和Hu2ber 研究认为抗病毒抑制剂能阻止马铃薯X 病毒的复制，在早期破坏RNA 聚合酶的形成，在后期破坏病毒外壳蛋白的形成。常用的抗病毒化学药物有三氮唑核苷(病毒唑

7、 、5一二氢尿嘧啶(DHT和双乙酰一二氢一5一氮尿嘧啶(DADHT 。这些药物常通过直接注射到带病毒的植株上，或加到植株生的培养基上。经过抗病毒药剂处理的嫩茎，切取茎尖，再进行组织培养，就会提高脱毒率和成活率。采用病毒抑制剂与茎尖培养相结合的脱毒方法，可以较容易的脱除多种病毒，而且这种方法对取材要求不严，接种茎尖可大于1 mm，易于分化出苗，提高存活率。但是有些病毒比较难去除。单独使用其中某一个方法很难获得成功，所以有人将热处理、抗病毒药剂和茎尖培养相结合使用，效果更好。如Deigratias 等(1989把这3种方法结合起来，成功地脱除了甜樱桃上的樱桃矮化病毒、樱桃坏死环斑病毒和苹果褪绿叶斑

8、病毒 ；Chen 等(1991利用这种方法去除了花生斑驳病毒81。15 微芽嫁接脱病毒组织培养与嫁接相结合，是获得无病毒苗木的一种技术。这种技术首先成功应用于柑橘脱病毒，以后逐渐应用到其他多种果树病毒的脱除。微芽嫁接已成为柑橘脱病毒良种培养的常规方法，得以广泛一三 的应用。在西班牙，Navaho 等(1997采用该技术脱除柑橘病毒获得了脱毒率达80以上的令人满意的结果 。有人实验。从试管培养1014 d的桃树新梢，切取0510 mm 带有34个叶原基的茎尖进行嫁接。成活率4O 70 获得脱除李属坏死环斑病毒(PNRSV、李矮缩病毒(PDV和苹果褪绿叶斑病毒(ACLSV的桃苗。微芽嫁接不仅是获得

9、无病毒苗木的方法之一。同时还可解决某些植物营养繁殖生根难的问题。16 抗病毒果树基因工程近些年来分子生物学的发展，特别是基因工程的兴起为防治病毒病带来了希望。现已有多种病毒基因被导入到植物的基因组中而产生了不同程度的抗病效果。目前果树上采用的的抗病毒策略主要有以下3种：(1外蛋白基因策略；(2病毒卫星RNA 基因策略；(3运动蛋白基因策略2 脱毒效果检测方法经过脱毒处理的植株是否还存在病毒须经过病毒学检测才能确定可靠的病毒检测方法与建立有效的脱毒方法同等重要。传统上一直沿用的检测方法是目测法，但是这种方法无法剔除潜隐性病毒。后来出现的指示植物法。扩大了检测范围。近年来随着生物科学的迅猛发展。免

10、疫学方法、分子生物学方法等许多先进的理化技术的应用，促进了病毒检测技术的改进与发展。下面简要介绍几种检测脱毒苗的方法。21 性状鉴定脱毒苗叶色浓绿，均匀一致，长势好。带毒株长势弱，叶片表现褪绿条斑，扭曲、植株矮化(大蒜 ，花叶或明脉坏死。卷叶、植株矮缩等(马铃薯 ，花叶褪绿斑点(甘薯、康乃馨等 ，表现出病毒病症状的植株可初步定位病株。根据症状诊断要注意区分病毒病症状与植物的机械损伤、虫害及药害等表现。22 指示植物法当原始寄主的症状不明显时，就可用指示植物法，因为指示植物比原始寄主更容易表现症状。具体做法是将病叶研磨，把汁液接种到寄主植物上。指示植物法简便易行，但其灵敏性差，所需时间长，难以区

11、分病毒种类【砌。例如：百合体内的一些病毒可以采用汁液接种法，接种到其他草本植物上，然后根据指示植物的感病表现研究病毒的生物属性特征并进行种类鉴定。此外，有些草本植物病毒可采用嫁接法进行接种鉴定如草莓病毒鉴定常用小叶嫁接接种法【ll 】。23 血清学方法抗血清鉴定法要进行抗原的制备、抗血清的采收、分离等。血清可分装到小玻璃瓶中，贮存在一15一25的冰冻条件下。测定时。把稀释的抗血清与未知的病毒植物在小试管内混合，这一反应导致形成可见的沉淀然后根据沉淀反应来鉴定病毒。此法灵敏度高，获得检测结果迅速。24 电子显微镜检测采用电子显微镜既可以直接观察病毒，检查出有无病毒存在，了解病毒颗粒的大小、形状和

12、结构，又可鉴定病毒的种类，但需一定的设备和技术。由于电子的穿透力很低，制品必须薄到10100 m，通常制成厚20 m左右的薄片，置于铜载网上，才能在电子显微镜下观察到。近代发展使电镜结合血清检测病毒，称为免疫吸附电镜(ISEM。25 酶联免疫法方法是将抗原固定在支持物上，加入待检血清，然后加入酶(过氧化物酶或碱性磷酸酶 标记的抗体，使待检血清与对应抗原的特异性抗体结合，最后用分光光度计进行诊断。26 RT-PCR检测RT PCR 技术灵敏而且用途广可用于检测病毒DNA 的转录产物及分析表达的水平。该方法已用于大蒜脱毒苗检测。3 小结综上所述，现有的脱毒技术多种多样，各有优缺点。常用的脱毒技术是热处理法、茎尖培养法、抗病毒药剂法 目前应用的趋势是将不同的方法结合起来应用。随着脱毒苗的大量生产脱毒苗的检测技术也越来越重要。现在广泛应用的检测技术有两种，即ELISA 方法和RT_PCR方法。但是ELISA 方法需要制备抗体，而且一次只能检测一种病毒。