蛋白质等电点测定

1、蛋白质等电点测定 及性质实验、目的：了解等电点的意义及其与蛋白质分子聚沉能力的关系。初步学会测定蛋白质等电点的基本方法，了解蛋白质的性质。、原理：固体颗粒在液体中为什么能够带电?当固体与液体接触时，固体可以从溶液中选择性吸附某种离子，也可以是固体分子本身发生电离作用而使离子进入溶液，以致使固液两相分别带有不同符号的电荷，由于电中性的要求，带电外表附近的液体中必有与固体外表电荷数量相等但符号相反的多余的反离子。在界面上 带电外表和反离子 形成了双电层的结构。在两种不同物质的 界面上，正负电荷分别排列成的面层。对于双电层的具体结构，一百多年来不同学者提出了不同的看法。最早于1879年Helmhol

2、z提出平板型模型；1910年Gouy和1913年Chap man修正了平板型模型， 提出了扩 散双电层模型；后来 Stern又提出了 Stern模型。根据O.斯特恩的观点，一部分反离子由于电性吸引或非电性的特性吸引作用例如范德华力而和外表紧密结合，构成吸附层或称紧密层、斯特恩层。其余的离子则扩散地 分布在溶液中，构成双电层的 扩散层或称滑移面。由于带电外表的吸引作用，在 扩散层中反离子的浓度远大于同号离子。离外表越远，过剩的反离子越少， 直至在溶液内部反离子的浓度与同号离子相等。滑移界而（SU1Q®）紧巒层（St«rn层SfEFIl扩歆 双电层模型反号离子溶列分子扩散层紧密

3、层：溶液中反离子及溶剂分子受到足够大的静电力，范德华力或特性吸附力， 而紧密吸附在固体外表上。其余反离子则构成扩散层。滑动面：指固液两相发生相对移动的界面，是凹凸不平的曲面。滑动面至溶液本体间的电势差称为Z电势。固体颗粒带电量的大小及测量方式？Z电势只有在固液两相发生相对移动时才能呈现出来。Z电势的大小由Zeta电位表示，其数值的大小反映了胶粒带电的程度，其数值越高说明胶粒带电越多，扩散层越厚。一般来说，以pH值为横坐标，Zeta电位为纵坐标作图，Zeta电位为零对应的pH值即为等电点。对于蛋白质分子来说：蛋白质分子的大小在胶粒范围内，约1100微米。大部分蛋白质分子的外表都有很多亲水集团，这

4、些集团以氢键形式与水分子进行水合作用，使水分子吸附在蛋白质分子外表而形成一层水合膜，具有亲水性；又由于蛋白质分子外表的亲水集团都带有电荷，会与极性水分子中的异性电荷吸引形成双电层。而水合膜和双电层的存在， 使蛋白质的分子与分子之间不会相互凝聚，成为比较稳定的胶体溶液。如果消除水合膜或双电层其中一个因素，蛋白质溶液就会变得不稳定， 两种因素都消除时，蛋白质分子就会互相凝聚成较大的分子而产生沉 淀。在生活实践中，常利用蛋白质的胶体性质沉淀或别离蛋白质。如做豆腐、肉皮冻就是利用蛋白质的胶凝作用。蛋白质分子所带的电荷与溶液的pH值有很大关系，蛋白质是两性电解质，在酸性溶液中的氨基酸分子氨基形成-NH3

5、+而带正电，在碱性溶液中羧基形成 -CO 0-而带负电：C00-C00COOH/JH* H一卩 *+ 0H-px+ OH'、pH>plpH = plpH <龟场中：不c动蛋白质分子所带净电荷为零时的pH值称为蛋白质的等电点PI。其定义为：在某一pH的溶液中，蛋白质解离成阳离子和阴离子的趋势或程度相等时，呈电中性，此时溶液的 pH称为该蛋白质的等电点。等电点的应用：主要用于蛋白质等两性电解质的别离、提纯和电泳。在等电点时，蛋白质分子在电场中不向任何一极移动，而且分子与分子间因碰撞而引 起聚沉的倾向增加，所以这时可以使蛋白质溶液的粘度、渗透压均减到最低，且溶液变混浊。蛋白质在等

6、电点时溶解度最小，最容易沉淀析出。蛋白质等电点的测定各种蛋白质的等电点都不相同，但偏酸性的较多，如牛乳中的酪蛋白的等电点是，血红蛋白等电点为，胰岛素是，鱼精蛋白是一个典型的碱性蛋白，其等电点在。本实验采用蛋白质在不同 pH溶液中形成的混浊度来确定，即混浊度最大时的pH值即为该种蛋白质的等电点值， 这个方法虽然不很准确， 但在一般实验条件下都能进行， 操作也 简便。蛋白质的等电点比较准确的方法是采用等电聚焦技术加以准确测定，但需一定的实验条件。等电聚焦电泳IEF， isoelectric focusing electrophoresis 利用特殊的一种缓冲液两性电解质在凝胶常用聚丙烯酰胺凝胶内制

7、造一个pH梯度，电泳时每种蛋白质就将迁移到等于其等电点pl丨的pH处此时此蛋白质不再带有净的正或负电荷，形成一个很窄的区带。IEF的基本原理在IEF的电泳中，具有 pH梯度的介质其分布是从阳极到阴极，pH值逐渐增大。如前所述，蛋白质分子具有两性解离及等电点的特征，这样在碱性区域蛋白质分子带负电荷向阳极移动，直至某一 pH位点时失去电荷而停止移动，此处介质的pH恰好等于聚焦蛋白质分子的等电点pl。同理，位于酸性区域的蛋白质分子带正电荷向阴极移动，直到它们的等 电点上聚焦为止。可见在该方法中，等电点是蛋白质组分的特性量度，将等电点不同的蛋白质混合物加入有pH梯度的凝胶介质中，在电场内经过一定时间后

8、，各组分将分别聚焦在各 自等电点相应的pH位置上，形成别离的蛋白质区带。沉淀反应：蛋白质在某种理化条件下，蛋白胶体溶液的水化层或者电荷层破坏，蛋白胶体相互聚集的现象。主要的沉淀现象有1盐析：在蛋白质水溶液中加入足量的盐类如硫酸铵，可析出沉淀，稀释后能溶解并仍保持原来的性质，不影响蛋白质的活性。这是一 个可逆的过程，可用于蛋白质的别离与初级提纯。2变性：在重金属盐、强酸、强碱、加热、紫外线等作用下，引起蛋白质某些理性质改变和生物学功能丧失。这是一个不可逆过程。3加入一定量的溶剂如乙醇、丙酮，它们与蛋白质分子争夺水分子，破坏水化膜，短时 间内是可逆反应；4加入生物碱试剂含氮的碱性物质：能使生物碱沉

9、淀或作用产生颜色反应的物质，称为生物碱试剂。当溶液的pH小于PI时，蛋白质为阳离子，能与生物碱试剂的阴离子结合而生成沉淀。酪蛋白是牛奶蛋白质的主要成分，常温下在水中可溶解 0.81.2% ,微溶于25度水和有机溶剂，溶于稀碱和浓酸中，能吸收水分。当浸入水中则迅速膨胀。在牛奶中以磷酸二钙、 三钙或两者的复合物形式存在。构造极为复杂，没有确定的分子式。分子量约为57000375000，在牛奶中约含 3%,占牛奶蛋白质的 80%。三、器材及试剂：1 .器材： 试管x厘米X 9。 吸管1毫升X 2，2毫升X 2，10毫升X 2。 容量瓶50毫升X 2，500毫升X 1。 试管架。2. 试剂： L-1醋

10、酸溶液。 L-1醋酸溶液。 1 mol L-1醋酸溶液。 1 mol L-1氢氧化钠溶液氢氧化钠和醋酸溶液的浓度要标定。 酪蛋白。四、操作步骤：1 .制备蛋白质胶液1称取酪蛋白3克，放在烧杯中，加入 40C的蒸馏水。2加入50毫升1 mol L-1氢氧化钠溶液，微热搅拌直到蛋白质完全溶解为止。将溶解好的蛋白溶液转移到 500毫升容量瓶中，并用少量蒸馏水洗净烧杯，一并倒入容量瓶。3在容量瓶中再加入 1 mol L-1醋酸溶液50毫升，摇匀。4加入蒸馏水定容至 500毫升，得到略现浑浊的，在0.1 mol L-1NaAC溶液中的酪蛋白胶体。2. 等电点测定按下表顺序在各管中加入蛋白质胶液，并准确地

11、加入蒸馏水和各种浓度的醋酸溶液， 加入后立即摇匀。管 蛋白质出0mol L-1 mol L-1 1mol L-1pH观 察号胶液（毫升）（毫升）HAC（毫升）HAC毫升HAC毫升0分钟10分钟20分钟112131415161718191观察各管产生的混浊并根据混浊度来判断酪蛋白的等电点。观察时可用+, +, +,表示浑浊度。3. 蛋白质性质实验1蛋白质的盐析在试管里加入12毫升蛋白质的水溶液，然后逐滴加入硫酸铵饱和溶液，观察现象，有无白色浑浊产生。滴加过程中不要摇动试管，现象不明显时，多加几滴硫酸铵饱和溶液。2蛋白质的变性在试管里加入 2毫升蛋白质的水溶液，沸水浴加热5分钟，观察现象。把试管里的下层物质取出一些放在水里，观察现象。在试管里加入3毫升蛋白质的水溶液，加入 1毫升硫酸铜溶液，观察现象。有无淡蓝色絮状浑浊沉淀产生。把少量沉淀放入盛有蒸馏水的试管里，观察沉淀是否溶解。五、思考 题1、在等电点时蛋白质的溶解度为什么最低？请结合你的实验结果和蛋白质的胶体性质加以说明。在等电点时，蛋白质分子以两性离子形式存在，其分子净电荷为零（即正负电荷相等），此时蛋白质分子颗粒在溶液中因没有相同电荷的相互排斥，分子相互之间的作用力减弱， 其颗粒极易碰撞、凝聚而产生沉淀，所以蛋白质在等电点时，其溶解度最小，最易形成沉淀物。2、本实验中，酪蛋白质在等电点时从溶