技术包含引物设计

1、聚合酶链式反应（PCR）原理：DNA的半保留复制时，双链DNA在多种酶的作用下可以变性解链成单链，在DNA聚合酶与启动子的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子挎贝。在实验条件下，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，并设计引物做启动子，加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。PCR类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性 - 退火(复性）- 延伸三个基本反应步骤构成：模板DNA的变性：模板DNA经加热至94左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形

2、成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至4060左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；引物的延伸：DNA模板 - 引物结合物在DNA聚合酶的作用下，于72左右，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链，重复循环就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需24分钟，23小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。PCR技术分类（常用）（1）反向PCR技术(Inverse PCR, IPC

3、R)：反向PCR是克隆已知序列旁侧序列的一种方法主要原理是用一种在已知序列中无切点的限制性内切酶消化基因组DNA后酶切片段自身环化以环化的DNA作为模板，用一对与已知序列两端特异性结合的引物，扩增夹在中间的未知序列。该扩增产物是线性的DNA片段，大小取决于上述限制性内切酶在已知基闲侧翼DNA序列内部的酶切位点分布情况。用不同的限制性内切酶消化，可以得到大小不同的模板DNA，再通过反向PCR获得未知片段 。（2）锚定PCR技术(Anchored PCR, APCR)：用酶法在一通用引物反转录cDNA3-末端加上一段已知序列, 然后以此序列为引物结合位点对该cDNA进行扩增, 称为APCR。（3）

4、不对称PCR技术(asymmetric PCR)：两种引物浓度比例相差较大的PCR技术称不对称PCR。在扩增循环中引入不同的引物浓度, 常用50100÷1比例。在最初的1015个循环中主要产物还是双链DNA, 但当低浓度引物被消耗尽后, 高浓度引物介导的PCR反应就会产生大量单链DNA。（4）反转录PCR技术(reverse transcription PCR, RT-PCR)：当扩增模板为RNA时, 需先通过反转录酶将其反转录为cDNA才能进行扩增。应用非常广泛, 无论是分子生物学还是临床检验等都经常采用。（5）巢式PCR技术(NEST-PCR)：先用一对靶序列的外引物扩增以提高模

5、板量, 然后再用一对内引物扩增以得到特异的PCR带, 此为巢式PCR。若用一条外引物作内引物则称之为半巢式PCR。为减少巢式PCR的操作步骤可将外引物设计得比内引物长些, 且用量较少, 同时在第一次PCR时采用较高的退火温度而第二次采用较低的退火温度, 这样在第一次PCR时, 由于较高退火温度下内引物不能与模板结合, 故只有外引物扩增产物, 经过若干次循环, 待外引物基本消耗尽, 无需取出第一次PCR产物, 只需降低退火即可直接进行PCR扩增。这不仅减少操作步骤, 同时也降低了交叉污染的机会。这种PCR称中途进退式PCR，主要用于极少量DNA模板的扩增。（6）多重PCR技术(multiplex

6、 PCR)：在同一反应中用多组引物同时扩增几种基因片段,如果基因的某一区段有缺失,则相应的电泳谱上这一区带就会消失。主要用于同一病原体的分型及同时检测多种病原体、多个点突变的分子病的诊断。（7）重组PCR技术：重组PCR技术是在两个PCR扩增体系中, 两对引物分别由其中之一在其5-端和3-端引物上带上一段互补的序列,混合两种PCR扩增产物,经变性和复性,两组PCR产物互补序列发生粘连,其中一条重组杂合链能在PCR 条件下发生聚合延伸反应,产生一个包含两个不同基因的杂合基因。（8）原位PCR技术：利用完整的细胞作为一个微小的反应体系来扩增细胞内的目的片段,在不破坏细胞的前提下,利用一些特定的检测

7、手段来检测细胞内的扩增产物。直接用细胞涂片或石蜡包埋组织切片在单个细胞中进行扩增，可进行细胞内定位，适用于检测病理切片中含量较少的靶序列。（9）荧光定量实时PCR技术反应动力学PCR的三个反应步骤反复进行，使DNA扩增量呈指数上升，最终DNA扩增量可用Y=(1+X)n计算，Y代表DNA片段扩增后的拷贝数，X表示平均每次的扩增效率，n表示循环次数。平均扩增效率理论值为100%，但实际情况达不到，反应初期靶序列DNA片段的增加呈指数形式，随着PCR产物的逐渐积累，被扩增的DNA片段不再呈指数增加，而进入线性增长期或静止期，即出现“停滞效应”，此效应称平台期，与DNA聚合酶数量和活性、PCR扩增效率

8、、非特异性产物的竞争等因素有关。PCR扩增产物 可分为长产物片段和短产物片段两部分，短产物片段的长度严格地限定在两个引物链5端之间，是需要扩增的特定片段。短、长产物片段是由于引物所结合的模板不同而形成的，以一个原始模板为例，在第一个反应周期中，以两条互补的DNA为模板，引物是从3端开始延伸，其5端是固定的，3端则没有固定的止点，长短不一，这就是长产物片段。进入第二个反应周期后，引物除与原始模板结合外，还要同新合成的链（长产物片段）结合引物在与新链结合时，由于新链模板的5端序列是固定的，故这次延伸的片段3端被固定了止点，保证了新片段的起点、止点都限定于引物扩增的序列以内，形成长短一致的短产物片段

9、。由于短产物片段是按指数倍数增加，而长产物片段则以算术倍数增加，故可忽略不计，使得PCR的反应产物不需再纯化既可以保证足够纯的DNA片段供分析、监测。反应五要素-引物、模板、DNA聚合酶、四种dNTP、Mg2+（1）引物设计引物长度：15-30bp，常用为20bp左右。 引物扩增跨度：以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。 引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，引物自身连续互补碱基不能超过3个，一对引物间也不易多于四个连续碱基的互补性。 【引物的GC含量和Tm值应该协调：Tm=4（G+C）+2（

10、A+T）】避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3'端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。 引物3端为关键碱基，是PCR延伸的起始端，不能进行任何修饰，也不能形成二级结构的可能，一般3端也不能发生错配，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。 5端无严格限制，只起限定PCR产物长度的作用，对扩增特异性影响不大，因此常用来引进修饰位点或标记物。引物中有或能加上合适的酶切位点， 被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处。 引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。引物量： 每条引物的浓度0.11umo

11、l或10100pmol，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。（2）DNA聚合酶：目前有两种Taq DNA聚合酶供应，一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶，另一种为大肠菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反应约需酶量0.5-2.5 U/50 ml，浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。 （3）dNTP的质量与浓度：dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以1M NaOH或1M Tris-HCL的缓冲液将其PH调节到7.07.5，小量分装， -20冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解。在PCR反应中，dNTP应为

12、50200umol/L，尤其是注意4种dNTP的浓度要相等( 等摩尔配制)，如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低)，就会引起错配。浓度过低又会降低PCR产物的产量。 （4）模板(靶基因)核酸：模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败与否的关键环节之一，传统的DNA纯化方法通常采用SDS和蛋白酶K来消化处理标本。SDS的主要功能是： 溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白，SDS 还能与蛋白质结合而沉淀； 蛋白酶K能水解消化蛋白质，特别是与DNA结合的组蛋白，再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份，用乙醇或异丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作为模板

13、用于PCR反应。（5）Mg2+浓度：Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响，在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为200umol/L时，Mg2+浓度为1.52.0mmol/L为宜。Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物减少。RT-PCR - 是将RNA的反转录（RT）和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。总RNA提取（-70保存）Trizol法：1、取组织100于玻璃匀浆器中，加入1ml Trizol 冰上抽打匀浆（边匀浆边暂停）2、移入1.5mlEP管中，颠倒混匀，室温保存5min3、加氯仿0.2ml（总体

14、积的1/5），振荡混合，室温放置5min4、4，离心12000 rpm，15min 5、取上层液相（约400l）移入一新1.5ml EP管中，加等体积异丙醇（约400l）,振荡混合，室温保存10min6、4，离心12000 rpm，10min7、弃上清液，加1ml 75%无水乙醇（4保存），振荡混合8、4，离心7500 rpm，5min9、弃上清液，室温放置20min(EP管倒置在滤纸上)使RNA沉淀干燥（不能完全干燥）10、加20ul DEPC水至EP管中，在60孵育3-5min(或手握3-5min),使RNA充分溶解（ 可保存在液氮或低温冰箱-70）测RNA浓度：走RNA变性电泳观察18s

15、、28s条带，分光光度计检测260/280吸光度比值调零：750ul DEPC水测量：745ul DEPC水 + 5ul RNA总RNA浓度= OD260×40×稀释倍数（150倍）ug/ml = OD260×40×150 ug/ml = OD260×6 ug/ulA1/A2应在1.8-2.0之间注意：提取RNA的质量主要是要通过260/280的比值看是不是在2.0左右，当OD260/OD280<1.8时提示有蛋白或酚的污染，需要进一步纯化RNA；还要跑胶看看28s、18s、5s的三条带是不是清晰，一般质量好的RNA，28s:18s的亮度

16、比例在2:1左右，最后一条5s的应该比较淡。逆转录RT（cDNA：一周内-20保存，长期-70保存）RT反应体系：20ul体系第一步：约20分钟RNA抽提物 5lRadome引物 2lRNAsin 0.5l1、65 15分钟 2、立即放入冰浴 第二步：约2小时RNAsin 0.5l10mM dNTP 1l5× RT缓冲液 4l25mM MgCl2 4l AMV 3l1、37 1.5小时 2、94 5-10分钟 3、反应物保存于-20或进行PCR聚合酶链反应PCR(产物-20保存)PCR反应体系：100l体系 约4.5小时 约5小时25mM MgCl2 2l 3l10×PCR

17、缓冲液 5l 5l10mM dNTP 1l 1l10pmol/l上游引物 2.5l 2.5l10pmol/l下游引物 2.5l 2.5lcDNA模板 2.5l 5lddH2O 34l 30lTaq酶 0.5l 1l轻质石蜡油 50l 50l1、94 2分钟，55 1分钟，72 2分钟 为第一个步1个循环 2、94 45秒，55 40秒，72 1分钟 为第二步30/40个循环 3、72 10分钟 4、取出后4保存，5分钟后-20保存或走电泳琼脂糖凝胶电泳：约1.25小时1、配制0.5× TBE电泳缓冲液300 ml 2、配制凝胶浓度1.7%（40ml 0.5×TBE加0.68

18、g胶），微波炉中火2分钟溶解胶，冷却至60加入溴乙锭2l（10mg/ml的终浓度0.5g/ml），充分混匀3、将温热的凝胶倒入已置好梳子的胶膜中，在室温下放置30-45min后现进行电泳4、加样8l PCR反应产物+2l溴酚兰 ，空一格加DNA marker5、电泳50-80V ，电场强度不宜高于5V/cm6、在紫外灯下观察,DNA 存在则显示出红色荧光条带,采用凝胶成像系 统拍照保存。电泳缓冲液(5×TBE贮存液)：Tris 54g、硼酸27.5g、0.5M EDTA 20ml pH8.0、加蒸溜水至1000ml。使用时，将5×TBE稀释10倍成0.5×TBE就可以在电泳时使用(工作浓度)。上样缓冲液(6×缓冲液，4保存)：0.25%溴酚蓝、0.25%二甲苯青FF、30%甘油琼脂糖凝胶配制：（1.0%）1.0g琼脂糖+100ml电泳缓冲液，微波炉加热至沸腾(如果首次煮胶，一定要煮透，以不出现泡沫为标志)，熔化的琼脂物冷却至60时加入10mg/ml溴化乙锭5l，充分混匀，将温热的凝胶倒入已置好梳子的胶膜中，在室温下放置30-45min(可以放入4