第四章动物细胞工程制药

1、L o g o动物细胞工程制药动物细胞工程制药第一节第一节 概述概述 细胞的发现和细胞学说的创立细胞的发现和细胞学说的创立v1665年年 Robert Hook 发现软木塞中蜂窝发现软木塞中蜂窝状小室状小室（cell）v1667年荷兰科学家年荷兰科学家 Leeuwenhoek 观察到观察到真正的活细胞真正的活细胞v18381839年年 德国植物学家德国植物学家 Schleiden 和动物学家和动物学家 Schwann 提出提出细胞学说细胞学说“细胞学说”的基本内容v有机体是有机体是由细胞和细胞的产物所构成的，细胞是由细胞和细胞的产物所构成的，细胞是构成有机体的基本单位。构成有机体的基本单位。v

2、每个细胞作为一个相对独立的单位，既有它每个细胞作为一个相对独立的单位，既有它“自自己的己的”生命生命, ,又对与其它细胞共同组成的整体的生又对与其它细胞共同组成的整体的生命有所助益。命有所助益。 v新的细胞可以通过老的细胞繁殖产生。新的细胞可以通过老的细胞繁殖产生。组织培养或细胞培养组织培养或细胞培养是将组织或细胞从机体取出，是将组织或细胞从机体取出，在体外模拟机体体内生理条件进行培养，使之生存在体外模拟机体体内生理条件进行培养，使之生存和生长。和生长。细胞工程细胞工程是以细胞为单位，按人们的意志，应用生是以细胞为单位，按人们的意志，应用生物学、分子生物学等理论和技术，有目的地进行精物学、分子

3、生物学等理论和技术，有目的地进行精心设计，精心操作，使细胞的某些遗传特性发生改心设计，精心操作，使细胞的某些遗传特性发生改变，从而达到改良或产生新品种的目的，以及使变，从而达到改良或产生新品种的目的，以及使细胞增加或重新获得产生某种特定产物的能力，从细胞增加或重新获得产生某种特定产物的能力，从而在离体条件下进行大量培养、增殖，并提取出而在离体条件下进行大量培养、增殖，并提取出对人类有用的产品。对人类有用的产品。细胞工程包括：细胞工程包括：1. 真核细胞的基因重组、导入、扩增和表达的理论和技术；真核细胞的基因重组、导入、扩增和表达的理论和技术；2. 细胞融合的理论和技术；细胞融合的理论和技术；3

4、. 细胞器特别是细胞核移植的理论和技术；细胞器特别是细胞核移植的理论和技术；4. 染色体改造的理论和技术；染色体改造的理论和技术；5. 转基因动、植物的理论和技术；转基因动、植物的理论和技术；6. 细胞大量培养的理论和技术；细胞大量培养的理论和技术；7. 将有关产物提取纯化的理论和技术。将有关产物提取纯化的理论和技术。表表1 动物细胞培养的产物动物细胞培养的产物 疫苗疫苗人人小儿麻痹症疫苗、狂犬疫苗、风疹疫苗、脑炎疫苗、疱疹疫小儿麻痹症疫苗、狂犬疫苗、风疹疫苗、脑炎疫苗、疱疹疫苗等苗等动物动物牛病毒性腹泻疫苗、牛痢疾疫苗、犬传染性肝炎疫苗、猪霍牛病毒性腹泻疫苗、牛痢疾疫苗、犬传染性肝炎疫苗、猪

5、霍乱疫苗、狂犬疫苗、草鱼出血热疫苗乱疫苗、狂犬疫苗、草鱼出血热疫苗单克隆抗体单克隆抗体IgG、IgM、IgA等等免疫调节剂免疫调节剂-细胞生长因子、干扰素、白细胞活化因子、血清胸腺因子、细胞生长因子、干扰素、白细胞活化因子、血清胸腺因子、白细胞介素、胸腺素等白细胞介素、胸腺素等酶酶尿激酶、天门冬氨酰胺酶、胶原酶、细胞色素尿激酶、天门冬氨酰胺酶、胶原酶、细胞色素P450、纤维蛋纤维蛋白溶酶原激活剂、胃蛋白酶、胰蛋白酶等白溶酶原激活剂、胃蛋白酶、胰蛋白酶等激素激素绒膜促性腺激素、促红细胞生成素、促滤泡激素、生长激素、绒膜促性腺激素、促红细胞生成素、促滤泡激素、生长激素、促间质细胞激素、促黄体激素等

6、促间质细胞激素、促黄体激素等第二节第二节 动物细胞的形态和生理特征动物细胞的形态和生理特征 一、动物细胞的形态一、动物细胞的形态1、动物细胞的结构、动物细胞的结构细胞膜细胞膜细胞质细胞质细胞核细胞核2、离体培养的细胞生长特性、离体培养的细胞生长特性v贴壁细胞贴壁细胞如成纤维细胞，巨噬细胞，神经细胞如成纤维细胞，巨噬细胞，神经细胞v悬浮细胞悬浮细胞如血液白细胞，淋巴细胞等如血液白细胞，淋巴细胞等v兼性贴壁细胞兼性贴壁细胞 如中国仓鼠卵巢细胞如中国仓鼠卵巢细胞二、动物细胞的化学组成和代谢二、动物细胞的化学组成和代谢1、动物细胞的化学组成、动物细胞的化学组成细胞中具有细胞中具有24种元素：种元素：

7、对生命起着特别重要的作用对生命起着特别重要的作用C、H、O、N、P、S 细胞中少，但是必需的细胞中少，但是必需的Ca、K、Na、Cl、Mg、Fe 其它其它Mn、I、Mo、Co、Zn、Se、Cu、Cr、Sn、V、Si、F微量元素微量元素细胞中的化合物分为：细胞中的化合物分为：无机物：如水、无机盐无机物：如水、无机盐有机物：如蛋白质、核酸、脂质、糖类有机物：如蛋白质、核酸、脂质、糖类三个阶段三个阶段（书（书P83页图）页图）v 第一阶段：第一阶段：大分子降解为小分子。多糖大分子降解为小分子。多糖单糖；单糖；脂肪脂肪甘油、脂肪酸；蛋白质甘油、脂肪酸；蛋白质氨基酸氨基酸v 第二阶段：第二阶段：小分子代

8、谢产生乙酰辅酶小分子代谢产生乙酰辅酶A、酮戊二酮戊二酸、草酰乙酸酸、草酰乙酸v 第三阶段：第三阶段：三个中间产物进入三个中间产物进入“三羧酸循环三羧酸循环”，产，产生生命活动必需的能量生生命活动必需的能量2、动物细胞的代谢、动物细胞的代谢1、细胞的分裂周期长、细胞的分裂周期长G1期：期：合成合成DNA聚合酶和聚合酶和RNA，为为DNA合成做准备。合成做准备。S期：期：DNA合成合成G2期：期：DNA量加倍，量加倍，RNA合成，合成，染色体螺旋化。染色体螺旋化。M期：期：0.5-1 h，分裂形成子细胞。，分裂形成子细胞。细胞分裂周期图细胞分裂周期图三、动物细胞的生理特点三、动物细胞的生理特点2、

9、细胞生长需贴附于基质，并有接触抑制现象。、细胞生长需贴附于基质，并有接触抑制现象。 接触抑制：接触抑制：当细胞在基质上分裂增殖，逐渐汇合成片时，当细胞在基质上分裂增殖，逐渐汇合成片时，即每个细胞与周围细胞互相接触时，细胞就停止增殖。即每个细胞与周围细胞互相接触时，细胞就停止增殖。若细胞转化成异倍体后，该抑制可解除若细胞转化成异倍体后，该抑制可解除肿瘤细胞在生长过程中丧失接触抑制细胞细胞悬浮悬浮液液1010代代细胞细胞5050代代细胞细胞无限无限传代传代原代培养原代培养传代培养传代培养有限细胞系有限细胞系无限细胞系无限细胞系多数组织细胞固定在表面多数组织细胞固定在表面生长和分裂。生长和分裂。遗传

10、物质改变遗传物质改变3、正常二倍体细胞的寿命是有限的、正常二倍体细胞的寿命是有限的 。 4 4、动物细胞对周围环境十分敏感、动物细胞对周围环境十分敏感物理化学因素，如物理化学因素，如渗透压、酸度、离子浓度、剪切力、微量渗透压、酸度、离子浓度、剪切力、微量元素等元素等的变化都会影响其生长，这是由于动物细胞没有的变化都会影响其生长，这是由于动物细胞没有细胞细胞壁壁的保护，所以更敏感。的保护，所以更敏感。5 5、动物细胞对培养基要求很高、动物细胞对培养基要求很高 原核生物：原核生物：只要有碳源、氮源和无机盐就可以生长只要有碳源、氮源和无机盐就可以生长动物细胞：动物细胞：12 种必需氨基酸、种必需氨基

11、酸、8 种以上维生素、多种无机种以上维生素、多种无机盐和微量元素、葡萄糖、多种细胞生长因子和贴壁因子。盐和微量元素、葡萄糖、多种细胞生长因子和贴壁因子。6 6、动物细胞蛋白质的合成途径和修饰功能与细菌不同、动物细胞蛋白质的合成途径和修饰功能与细菌不同 原核生物原核生物动物细胞蛋白质的合成动物细胞蛋白质的合成游离的核糖体：游离的核糖体：粗面内质网的核糖体粗面内质网的核糖体：糖基化及：糖基化及一系列翻译后修饰一系列翻译后修饰无粗面内质网结构，因此没有糖基化无粗面内质网结构，因此没有糖基化及一系列翻译后修饰。及一系列翻译后修饰。 四、每代贴附生长细胞的生长过程四、每代贴附生长细胞的生长过程v 游离期

12、游离期v 贴壁期贴壁期v 潜伏期潜伏期v 对数生长期对数生长期v 停止期（平台期）停止期（平台期）游离期：游离期： 细胞接种后在培养液中呈悬浮状态也称悬浮期。细胞接种后在培养液中呈悬浮状态也称悬浮期。此时细胞质回缩，胞体呈圆球形。此时细胞质回缩，胞体呈圆球形。贴壁期：贴壁期： 细胞附着于底物上，游离期结束。细胞株平均在细胞附着于底物上，游离期结束。细胞株平均在10分钟分钟4小时贴壁。小时贴壁。 底物：底物：胶原、玻璃、塑料、其它细胞等胶原、玻璃、塑料、其它细胞等 进口塑料培养瓶涂有进口塑料培养瓶涂有生长基质生长基质潜伏期潜伏期 此时细胞有生长此时细胞有生长活动，而无细胞分裂。活动，而无细胞分裂

13、。细胞株潜伏期一般为细胞株潜伏期一般为624小时。小时。对数生长期：对数生长期： 细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳，最适合进行细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳，最适合进行实验研究。实验研究。停止期（平台期）停止期（平台期）： 细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再分裂细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再分裂 机制：接触抑制机制：接触抑制第三节第三节 生产用动物细胞的要求和获得生产用动物细胞的要求和获得 一、要求一、要求原代细胞原代细胞二倍体细胞二倍体细胞50代以内代以内异倍体细胞异倍体细胞无限传代无限传代二、获得二、获得1、原代细胞、原代细胞细胞原代培养过程细胞原代培养过程2、二倍体细胞系、二倍

14、体细胞系原代细胞经过传代、筛选和克隆，从而从多种细胞成分的原代细胞经过传代、筛选和克隆，从而从多种细胞成分的组织中挑选并纯化出某种具有一定特征的细胞株。组织中挑选并纯化出某种具有一定特征的细胞株。特点：特点：（1）二倍体；）二倍体；（2）有明显的贴壁和接触抑制特性；）有明显的贴壁和接触抑制特性；（3）有限的增殖能力；）有限的增殖能力；（4）无致瘤性。）无致瘤性。3、转化细胞系、转化细胞系通过转化形成，变成了异倍体，有无限增殖能力。通过转化形成，变成了异倍体，有无限增殖能力。自发的转化：自发的转化：在传代过程中自己转变成可无限增殖的细胞在传代过程中自己转变成可无限增殖的细胞人为的转化：人为的转化

15、：采用某些试剂处理，或从动物的肿瘤组织中建采用某些试剂处理，或从动物的肿瘤组织中建立的细胞系立的细胞系优点：优点：（1）无限传代；）无限传代；（2）倍增时间短；）倍增时间短；（3）对培养条件和生长因子的要求低；）对培养条件和生长因子的要求低；（4）适合于大规模工业化生产。）适合于大规模工业化生产。4、融合细胞系、融合细胞系细胞融合细胞融合是指通过两个或两个以上的细胞合并成一个细胞是指通过两个或两个以上的细胞合并成一个细胞的过程。的过程。（1）概念）概念（2）动物细胞融合技术的发展简史：）动物细胞融合技术的发展简史：19世纪世纪30年代年代病理组织中发现多核细胞病理组织中发现多核细胞19世纪世纪

16、70年代年代蛙血细胞多核细胞蛙血细胞多核细胞1958年年灭活的仙台病毒诱导人的腹水癌细胞融合成功灭活的仙台病毒诱导人的腹水癌细胞融合成功后来后来诱导了不同种动物的体细胞融合，并且能将杂种诱导了不同种动物的体细胞融合，并且能将杂种细胞培养成活细胞培养成活a. 仙台病毒融合法仙台病毒融合法（3）细胞融合的方法：）细胞融合的方法：b. 聚乙二醇融合法聚乙二醇融合法 主要用于单克隆抗体主要用于单克隆抗体的杂交瘤细胞技术。的杂交瘤细胞技术。 c. 电融合法电融合法 利用细胞在短时间的强电场作用下，细胞膜发生可逆性电击穿，利用细胞在短时间的强电场作用下，细胞膜发生可逆性电击穿，而使相邻的细胞膜相互发生继发

17、性融合而使相邻的细胞膜相互发生继发性融合.v 操作简便操作简便v 无化学毒性无化学毒性v 对细胞损伤小对细胞损伤小v 融合同步，融合率高融合同步，融合率高v 可在显微镜下直接观察可在显微镜下直接观察优点：优点：5、重组工程细胞系、重组工程细胞系采用基因工程方法构建工程细胞采用基因工程方法构建工程细胞三、常用生产用动物细胞的特性三、常用生产用动物细胞的特性v BHK21BHK21：从地鼠幼鼠的肾脏中：从地鼠幼鼠的肾脏中分离。成纤维样细胞，用于分离。成纤维样细胞，用于构建工程菌，可生产疫苗。构建工程菌，可生产疫苗。举例：举例：v CHO-K1CHO-K1（中国仓鼠卵巢细（中国仓鼠卵巢细胞）：从中国

18、地鼠卵巢中分胞）：从中国地鼠卵巢中分离的上皮样细胞，用于构建离的上皮样细胞，用于构建工程菌。工程菌。v MRC-5(MRC-5(人胎肺成纤维细胞人胎肺成纤维细胞)：人二倍体细胞系，成纤维细人二倍体细胞系，成纤维细胞，有限寿命胞，有限寿命42-4642-46代，用代，用于制备疫苗。于制备疫苗。v WI38WI38：人二倍体细胞系，成纤维细胞，能产生胶原，倍增：人二倍体细胞系，成纤维细胞，能产生胶原，倍增时间为时间为 24 24 小时，有限寿命小时，有限寿命 50 50 代，用于制备疫苗。代，用于制备疫苗。四、细胞库的建立四、细胞库的建立用于生产的工程细胞建立：用于生产的工程细胞建立：生产所需的细

19、胞生产所需的细胞生产用细胞库（生产用细胞库（MWCB）原始细胞库（原始细胞库（MCB）第四节第四节 动物细胞的培养条件和培养基动物细胞的培养条件和培养基1、所有的与细胞接触的设备、器材和溶液都必须保持绝对无菌，、所有的与细胞接触的设备、器材和溶液都必须保持绝对无菌，避免污染；避免污染；2、必须有足够的营养保证，绝对不可有有害的物质，避免有害、必须有足够的营养保证，绝对不可有有害的物质，避免有害离子；离子；3、保证有适量的氧气供应；、保证有适量的氧气供应；4、需随时清除细胞代谢中的有害产物；、需随时清除细胞代谢中的有害产物；5、有良好的适于生存的外界环境，渗透压、离子浓度和酸度；、有良好的适于生

20、存的外界环境，渗透压、离子浓度和酸度；6、及时分种，保持合适的细胞密度。、及时分种，保持合适的细胞密度。动物细胞在体外培养所需基本条件动物细胞在体外培养所需基本条件v 玻璃器皿：玻璃器皿：培养瓶、滴管等培养瓶、滴管等 浸泡（自来水或稀酸）、刷洗（洗衣粉）、冲水、烘干、浸泡（自来水或稀酸）、刷洗（洗衣粉）、冲水、烘干、酸泡（酸泡（1212小时）、流水冲洗、蒸溜水冲洗、三蒸水冲洗，小时）、流水冲洗、蒸溜水冲洗、三蒸水冲洗，5050烘干烘干v 塑料器皿：塑料器皿：培养板、培养瓶、培养皿等。培养板、培养瓶、培养皿等。 自来水冲洗、洗衣粉超声波清洗、冲水、晾干、酸泡（自来水冲洗、洗衣粉超声波清洗、冲水、

21、晾干、酸泡（1212小时）、流水冲洗、蒸溜水冲洗、双蒸水冲洗，晾干小时）、流水冲洗、蒸溜水冲洗、双蒸水冲洗，晾干一、动物细胞的培养条件一、动物细胞的培养条件1. 器材的清洗和消毒器材的清洗和消毒（1）器材的清洗）器材的清洗（2）器材的消毒灭菌）器材的消毒灭菌a. 干热消毒干热消毒 电热干燥箱电热干燥箱: 160，60-120 min, 用于玻璃器皿用于玻璃器皿的消毒的消毒b. 湿热消毒湿热消毒 高压蒸汽灭菌器高压蒸汽灭菌器: 用于布类、用于布类、金属器材、玻璃器皿、液金属器材、玻璃器皿、液体、橡胶物品的消毒。体、橡胶物品的消毒。c. 紫外线消毒紫外线消毒 紫外灯：紫外灯：主要用于培养室空气、操

22、作台、塑料培养皿主要用于培养室空气、操作台、塑料培养皿和培养板等表面消毒和培养板等表面消毒 缺点缺点: 产生臭氧，影响身体健康。产生臭氧，影响身体健康。d. 过滤除菌消毒过滤除菌消毒 滤器：滤器：用于大多数培养用液，如人工合成培养基、血用于大多数培养用液，如人工合成培养基、血清、清、 酶液等均采用滤过法除菌。酶液等均采用滤过法除菌。 滤 器正压不锈钢过滤装置示意图正压不锈钢过滤装置示意图 e. 消毒剂和抗生素消毒剂和抗生素 消毒剂：消毒剂：75%酒精、过氧乙酸、新洁尔灭酒精、过氧乙酸、新洁尔灭 用于操作人员的皮肤、实验台、器械、器皿的操用于操作人员的皮肤、实验台、器械、器皿的操作表面、实验室的

23、椅、桌、墙、地面等的消毒。作表面、实验室的椅、桌、墙、地面等的消毒。 抗生素：抗生素：青霉素、链霉素等青霉素、链霉素等 用于预防培养用液的染菌用于预防培养用液的染菌n超净工作台的工作原理：超净工作台的工作原理：利用鼓风机驱动空气通过高利用鼓风机驱动空气通过高效滤器除去空气中的尘埃颗效滤器除去空气中的尘埃颗粒，使空气得到净化。净化粒，使空气得到净化。净化空气徐空气徐徐通过工作台面，使徐通过工作台面，使工作台内构成无菌环境。工作台内构成无菌环境。 超净台超净台超净工作台：超净工作台： 为细胞操作提供无菌环境为细胞操作提供无菌环境自动双重纯水蒸馏器自动双重纯水蒸馏器纯水仪纯水仪水质的好坏直接影响细胞

24、培养的成功与否水质的好坏直接影响细胞培养的成功与否有毒元素、金属离子、微生物污染。有毒元素、金属离子、微生物污染。2. 水质水质v pH 7.27.4，最适，最适v pH 7.6，不利于细胞的生长，不利于细胞的生长3. pH pH的高低对细胞各种酶的活性，细胞的通透性、及许的高低对细胞各种酶的活性，细胞的通透性、及许多蛋白的功能有重要影响。水质的好坏直接影响细胞多蛋白的功能有重要影响。水质的好坏直接影响细胞培养的成功与否培养的成功与否 pH缓冲系统：如缓冲系统：如Na2HPO4/ NaH2PO4缓冲系统缓冲系统 pH缓冲剂：缓冲剂：HEPES4. 渗透压渗透压 使用平衡盐溶液（使用平衡盐溶液（

25、BSS）保持细胞内外渗透压的平衡。）保持细胞内外渗透压的平衡。 成分主要为：无机盐和葡萄糖，如成分主要为：无机盐和葡萄糖，如Hanks平衡盐。平衡盐。5. 温度温度 动物细胞最佳培养温度：动物细胞最佳培养温度：37 昆虫细胞最佳培养温度：昆虫细胞最佳培养温度：276. 空气空气 氧气：氧气：采用培养瓶等培养，不需专门通气采用培养瓶等培养，不需专门通气 采用生物反应器大量培养生产，要专门通气采用生物反应器大量培养生产，要专门通气 CO2：细胞生长需要，又是细胞代谢的产物。细胞生长需要，又是细胞代谢的产物。 与维持培养基的与维持培养基的pH有关。有关。nCO2培养箱设定的条件为培养箱设定的条件为3

26、7，5CO2n使用使用CO2培养箱培养细胞时应注意的培养箱培养细胞时应注意的问题：问题：用螺旋口瓶培养细胞时，需将瓶盖微松，以用螺旋口瓶培养细胞时，需将瓶盖微松，以保证通气。保证通气。保持培养箱内空气干净。定期消毒。保持培养箱内空气干净。定期消毒。箱内箱内蒸馏水槽中蒸馏水槽中加入灭菌蒸馏水加入灭菌蒸馏水3000ml以保以保持箱内湿度，避兔培养液蒸发。持箱内湿度，避兔培养液蒸发。CO2培养箱培养箱二、动物细胞培养基的种类和组成二、动物细胞培养基的种类和组成1. 天然培养基天然培养基生物性液体（如血清）生物性液体（如血清）组织浸液（如胚胎浸液）组织浸液（如胚胎浸液）凝固剂（如血浆）凝固剂（如血浆）

27、2. 合成培养基合成培养基BME, MEM, DMEM, HAM F12, RPMI1640等产品等产品合成培养基的成分合成培养基的成分（1）氨基酸）氨基酸 细胞合成蛋白质的原料细胞合成蛋白质的原料 至少含至少含12种必需氨基酸种必需氨基酸+谷氨酰胺谷氨酰胺（2）维生素）维生素 维持细胞生命活动的低分子活性物质，形成酶的辅维持细胞生命活动的低分子活性物质，形成酶的辅基或辅酶基或辅酶 如维生素如维生素A、维生素、维生素D、维生素、维生素B2等。等。（3）糖类）糖类 碳源，如葡萄糖。碳源，如葡萄糖。（4）无机盐）无机盐 保持细胞的渗透压并，缓冲保持细胞的渗透压并，缓冲pH的变化，并参与代谢。的变化

28、，并参与代谢。 如如 NaCl, KCl, MgSO4, Na2HPO4等。等。（5）其他成分）其他成分 核酸前体，如腺苷、鸟苷等。核酸前体，如腺苷、鸟苷等。 氧化还原剂，如谷胱甘肽等。氧化还原剂，如谷胱甘肽等。 动物血清，如小牛血清、胎牛血清。动物血清，如小牛血清、胎牛血清。添加小牛血清的作用：添加小牛血清的作用：1、提供有利于细胞生长增殖所需的各种、提供有利于细胞生长增殖所需的各种生长因子生长因子和和激素激素； 如，胰岛素、表皮生长因子等；皮质醇、雌二醇等。如，胰岛素、表皮生长因子等；皮质醇、雌二醇等。2、提供有利于细胞贴壁所需的、提供有利于细胞贴壁所需的贴附因子贴附因子和和伸展因子伸展因

29、子； 如，纤维结合蛋白、胶原等。如，纤维结合蛋白、胶原等。3、提供可识别金属、激素、维生素和脂类的、提供可识别金属、激素、维生素和脂类的结合蛋白结合蛋白； 如，白蛋白等。如，白蛋白等。4、提供细胞生长所必需的、提供细胞生长所必需的脂肪酸脂肪酸和和微量元素微量元素。 如，胆固醇、前列腺素如，胆固醇、前列腺素E等。铜、锌、硒等。等。铜、锌、硒等。3. 无血清培养基无血清培养基1. 提高了细胞培养的可重复性，避免了血清差异所带来的细胞差异；提高了细胞培养的可重复性，避免了血清差异所带来的细胞差异；2. 减少了由血清带来的病毒、真菌和支原体等微生物污染的危险；减少了由血清带来的病毒、真菌和支原体等微生

30、物污染的危险；3. 供应充足、稳定；供应充足、稳定；4. 细胞产品易于纯化；细胞产品易于纯化；5. 避免了血清中某些因素对有些细胞的毒性；避免了血清中某些因素对有些细胞的毒性；*6. 减少了血清中蛋白对某些生物测定的干扰，便于结果分析。减少了血清中蛋白对某些生物测定的干扰，便于结果分析。优点：优点：合成培养基合成培养基 + 激素、生长因子、结合蛋白、贴附和伸展因激素、生长因子、结合蛋白、贴附和伸展因子及其他元素子及其他元素第五节第五节 动物细胞培养的基本方法动物细胞培养的基本方法一、细胞分离一、细胞分离1. 离心分离法离心分离法 从含有细胞的体液中分离细胞。从含有细胞的体液中分离细胞。如血液、

31、羊水、腹水等。如血液、羊水、腹水等。 8001000 r/min, 510 min2. 消化分离法消化分离法 生物体生物体组织块组织块剪碎剪碎消化消化终止消化终止消化200目滤目滤网过滤网过滤单细胞悬液单细胞悬液常用的几种消化液：常用的几种消化液： （1）1%胰蛋白酶溶液胰蛋白酶溶液 （2）0.02%EDTA溶液溶液 （3）胰酶）胰酶-柠檬酸盐柠檬酸盐 （4）胰酶）胰酶-EDTA溶液溶液二、细胞计数二、细胞计数1. 自动细胞计数器计数：自动细胞计数器计数：Coulter计数仪计数仪2. 血球计数板计数：血球计数板计数：区分死活细胞：区分死活细胞：台盼蓝染色、苯胺黑染色台盼蓝染色、苯胺黑染色计算

32、：计算：（细胞悬液的细胞数）（细胞悬液的细胞数）/ml（四个大格子细胞数（四个大格子细胞数/4) 1104 稀释倍数稀释倍数公式中乘以公式中乘以104因为计数板中每一个大格的体积为：因为计数板中每一个大格的体积为：1.0mm（长）（长）1.0mm（宽）（宽）0.1mm（高）（高）0.1mm3 而而 1ml1000mm33. 结晶紫染色细胞核计数法：结晶紫染色细胞核计数法： 细胞分散解离、破碎，细胞核蓝色。血球计数板计数。细胞分散解离、破碎，细胞核蓝色。血球计数板计数。4. MTT染色计数法：细胞存活率检测染色计数法：细胞存活率检测 四甲基偶唑盐（四甲基偶唑盐（MTT）商品名为噻唑蓝。）商品名为

33、噻唑蓝。 MTT 比色法的原理：活细胞中琥珀酸脱氢酶能将比色法的原理：活细胞中琥珀酸脱氢酶能将MTT还还原成不溶干水的紫色产物，并沉淀在细胞中，而死细胞没有原成不溶干水的紫色产物，并沉淀在细胞中，而死细胞没有这种功能。二甲亚砜（这种功能。二甲亚砜（DMSO）能溶解沉积在细胞中紫色结）能溶解沉积在细胞中紫色结晶物，溶液颜色深浅与所含的紫色结晶量成正比。再用酶标晶物，溶液颜色深浅与所含的紫色结晶量成正比。再用酶标仪测定仪测定OD值。值。 操作步骤操作步骤: :（1 1）单细胞悬液接种于）单细胞悬液接种于9696孔培养板；孔培养板；3737、5 5COCO2 2培养箱中培养一段时间培养箱中培养一段时

34、间（根据实验目的决定培养时间）根据实验目的决定培养时间）（2 2）加入）加入MTTMTT液继续培养液继续培养3-43-4小时。小时。（3 3）吸出孔内培养液后，加入）吸出孔内培养液后，加入DMSODMSO液，液，将培养板置于微孔板振荡器上振荡将培养板置于微孔板振荡器上振荡1010分钟，使结晶物溶解。分钟，使结晶物溶解。（4 4）酶标仪检测各孔）酶标仪检测各孔ODOD值（检测波长值（检测波长490 nm490 nm）。）。培养板培养板孔板振荡器孔板振荡器酶标仪酶标仪根据细胞生长的恃点，传代方法有根据细胞生长的恃点，传代方法有3种种1.悬浮生长细胞传代悬浮生长细胞传代加入培养液，分瓶培养。加入培养

35、液，分瓶培养。2.半悬浮生长细胞传代（半悬浮生长细胞传代（Hela细胞）细胞）此类细胞部分呈现贴壁生长现象，但贴壁不牢，可用直接此类细胞部分呈现贴壁生长现象，但贴壁不牢，可用直接吹打法使细胞从瓶壁脱落下来，进行传代。吹打法使细胞从瓶壁脱落下来，进行传代。3.贴壁生长细胞传代贴壁生长细胞传代采用酶消化法传代。常用的消化液有采用酶消化法传代。常用的消化液有0.25的胰蛋白酶液。的胰蛋白酶液。三、细胞传代三、细胞传代贴壁生长细胞传代方法：贴壁生长细胞传代方法：v 吸光培养瓶中的培养液吸光培养瓶中的培养液v 加入加入1-2ml0.25的胰蛋白酶液的胰蛋白酶液(以消化液能覆盖整个瓶底以消化液能覆盖整个瓶

36、底为准）静置为准）静置2-10min（显微镜下动态监测）。显微镜下动态监测）。v 吸吸去去胰蛋白酶液，加入培养液。胰蛋白酶液，加入培养液。v 用吸管吸取瓶内培养液，反复吹打瓶壁细胞，形成细胞悬用吸管吸取瓶内培养液，反复吹打瓶壁细胞，形成细胞悬液。液。v 吸取细胞悬液，接种于新的培养瓶内，吸取细胞悬液，接种于新的培养瓶内，1传传2或或1传传3。v 加适量新鲜培养液于接种了细胞悬液的新培养瓶内。加适量新鲜培养液于接种了细胞悬液的新培养瓶内。v 将后者放入培养箱中培养。将后者放入培养箱中培养。 细胞低温冷冻贮存是细胞室的常规工作。细胞细胞低温冷冻贮存是细胞室的常规工作。细胞冻存与细胞传代保存相比可以

37、减少人力、经费，减冻存与细胞传代保存相比可以减少人力、经费，减少污染，减少细胞生物学特性变化。少污染，减少细胞生物学特性变化。四、细胞冻存和复苏四、细胞冻存和复苏1、冻存和复苏的原则：慢冻快融、冻存和复苏的原则：慢冻快融 当细胞冷到零度以下，可以产生以下变化：细胞器脱水，当细胞冷到零度以下，可以产生以下变化：细胞器脱水，细胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞内形成冰晶。细胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞内形成冰晶。 缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不致产生大的冰晶。缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不致产生大的冰晶。 复苏过程应快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶复苏过程应快融，目的是防止小

38、冰晶形成大冰晶，即冰晶的重结晶。的重结晶。（1）慢冻程序：）慢冻程序：程序降温盒程序降温盒： 1/min降温降温4 4-20-20-80-80液氮液氮（2）低温保护剂的应用：）低温保护剂的应用：2、细胞的冻存、细胞的冻存v 在细胞冻存时加入低温保护剂，能大大提高冻存效果。在细胞冻存时加入低温保护剂，能大大提高冻存效果。v 常用的低温保护剂是常用的低温保护剂是DMSO，它是一种渗透性保护剂，它是一种渗透性保护剂，可迅速透入细胞，提高胞膜对水的通透性，降低冰点，延可迅速透入细胞，提高胞膜对水的通透性，降低冰点，延缓冻结过程，能使细胞内水分在冻结前透出细胞外，在胞缓冻结过程，能使细胞内水分在冻结前透

39、出细胞外，在胞外形成冰晶，减少胞内冰晶，从而减少冰晶对细胞的损伤。外形成冰晶，减少胞内冰晶，从而减少冰晶对细胞的损伤。（3）细胞冻存方法）细胞冻存方法v 预先配制冻存液：预先配制冻存液：含血清培养基，含血清培养基，10%DMSO。v 取对数生长期细胞，经胰酶消化后，加入适量冻存液取对数生长期细胞，经胰酶消化后，加入适量冻存液,用用吸管吹打制成细胞悬液。吸管吹打制成细胞悬液。v 加入加入1ml细胞于冻存管中，密封后标记冷冻细胞名称和冷细胞于冻存管中，密封后标记冷冻细胞名称和冷冻日期。冻日期。v 从液氮中取出冷冻管，迅速投入从液氮中取出冷冻管，迅速投入3738水浴中，摇动水浴中，摇动使其融化（使其

40、融化（1分钟左右）。分钟左右）。v 用培养液稀释至原体积的用培养液稀释至原体积的10倍以上。倍以上。v 低速离心低速离心5分钟。分钟。v 去上清，加新鲜培养液培养刚复苏的细胞。去上清，加新鲜培养液培养刚复苏的细胞。v 隔天观察细胞生长情况，并换液。隔天观察细胞生长情况，并换液。3、细胞的复苏、细胞的复苏第六节第六节 动物细胞大量培养的方法动物细胞大量培养的方法和操作方式和操作方式一、动物细胞大规模培养的方法一、动物细胞大规模培养的方法实际生产可分为悬浮培养、贴壁培养和贴壁悬浮培养。实际生产可分为悬浮培养、贴壁培养和贴壁悬浮培养。1、悬浮培养、悬浮培养优点：优点：操作简单、培养条件均一、传质和传

41、氧比较好，操作简单、培养条件均一、传质和传氧比较好，容易扩大培养规模，可借鉴细菌发酵的经验。容易扩大培养规模，可借鉴细菌发酵的经验。缺点：缺点：由于细胞体积小，较难采用灌流培养。由于细胞体积小，较难采用灌流培养。*2、贴壁培养、贴壁培养优点：优点：适用的细胞种类多，较容易采用灌流培养，达到高适用的细胞种类多，较容易采用灌流培养，达到高密度细胞。密度细胞。缺点：缺点：操作比较复杂，需要合适的贴附材料和足够的面积，操作比较复杂，需要合适的贴附材料和足够的面积，培养条件不易均一，传质和传氧较差。培养条件不易均一，传质和传氧较差。3、贴壁、贴壁-悬浮培养悬浮培养（1）微载体培养）微载体培养v 将对细胞

42、无害的颗粒将对细胞无害的颗粒-微载体加入到培养容器的培养微载体加入到培养容器的培养液中，作为载体，使细胞在微载体表面附着生长，同时通液中，作为载体，使细胞在微载体表面附着生长，同时通过持续搅动使微载体始终保持悬浮状态。过持续搅动使微载体始终保持悬浮状态。优点：优点：1、可创造相当大的贴附面积，、可创造相当大的贴附面积， 2、载体体积较小，比重较轻，轻度搅拌即可携带、载体体积较小，比重较轻，轻度搅拌即可携带细胞悬浮于培养基内，发挥悬浮培养的特长。细胞悬浮于培养基内，发挥悬浮培养的特长。微载体的条件微载体的条件. .表面性质与细胞有良好的相容性表面性质与细胞有良好的相容性. .微载体的材料无毒性微

43、载体的材料无毒性. .微载体的材料是惰性的微载体的材料是惰性的. .微载体的比重在微载体的比重在1.0301.0301.045 g/ml1.045 g/ml. .粒径在粒径在6060250m250m之间，且均一之间，且均一. .具良好的光学透明性具良好的光学透明性. .基质软基质软. .耐高温耐高温. .可反复使用可反复使用10.10.原料充分，制作简便，廉价原料充分，制作简便，廉价（2）包埋和微曩培养）包埋和微曩培养优点：优点：1. 包埋或包裹在凝胶载体和微曩内的细胞可获得保护，包埋或包裹在凝胶载体和微曩内的细胞可获得保护，避免了剪切力的损害；避免了剪切力的损害；2. 可以获得较高的细胞密度

44、；可以获得较高的细胞密度；3. 通过控制微曩膜的孔径，可使产品浓缩在微曩内，有通过控制微曩膜的孔径，可使产品浓缩在微曩内，有利于下游产物的纯化处理；利于下游产物的纯化处理；4. 可采用多种生物反应器进行大规模培养可采用多种生物反应器进行大规模培养将细胞包埋或包裹在凝胶载体或微囊内。将细胞包埋或包裹在凝胶载体或微囊内。（3）结团培养）结团培养利用细胞本身作为基质，相互贴附后，再用悬浮的方利用细胞本身作为基质，相互贴附后，再用悬浮的方法进行培养。法进行培养。优点：优点：操作简单、节省微载体成本。操作简单、节省微载体成本。二、动物细胞培养的操作方式二、动物细胞培养的操作方式1.分批式操作分批式操作

45、分批式培养中，细胞接种于固定体积的培养基中，分批式培养中，细胞接种于固定体积的培养基中，随着细胞的增殖，营养物质消耗，代谢产物累积。最随着细胞的增殖，营养物质消耗，代谢产物累积。最后，营养耗尽，细胞增殖停止。后，营养耗尽，细胞增殖停止。 改进：改进：通过培养基的各种补加方式，提高产量。通过培养基的各种补加方式，提高产量。2.半连续式操作半连续式操作 间断以新鲜培养基（或连同新鲜载体一起）更换间断以新鲜培养基（或连同新鲜载体一起）更换固定体积培养基（或连同细胞载体一起），继续培养。固定体积培养基（或连同细胞载体一起），继续培养。.灌流式操作灌流式操作 通过不断向培养系统中加入新鲜培养基并且从反应

46、通过不断向培养系统中加入新鲜培养基并且从反应器中打出已经使用过的培养液（器中打出已经使用过的培养液（无细胞无细胞）。）。工业化细胞培养的发展趋势工业化细胞培养的发展趋势v以高密度连续灌流培养代替间歇批式培养以高密度连续灌流培养代替间歇批式培养v以生物反应器系统代替手工操作的转瓶或方瓶以生物反应器系统代替手工操作的转瓶或方瓶培养系统培养系统v以悬浮培养技术代替贴壁培养技术以悬浮培养技术代替贴壁培养技术v以无血清培养代替有血清培养以无血清培养代替有血清培养第七节第七节 动物细胞制药的前景与展望动物细胞制药的前景与展望一、改进表达载体，提高表达水平和产量一、改进表达载体，提高表达水平和产量提高细胞表达的水平，主要靠对表达系统的改造。提高细胞表达的水平，主要靠对表达系统的改造。包括：包