促红细胞生成素类似结构对大鼠心肌缺血损伤的

1、促红细胞生成素类似结构对大鼠心肌缺血损伤的本文从网络收集而来，上传到平台为了帮到更多的人，如果您需要使用本文档，请点击下载按钮下载本文档（有偿下载），另外祝您生活愉快，工作顺利，万事如意！近年来随着药物溶栓冠状动脉介入术、冠状动脉旁路移植术等治疗方法的临床应用，使受损心肌得到及时再灌注，明显降低了急性心肌梗死的病死率。但缺血的心肌再灌注时也引起一系列心脏与血管的不良事件，有研究显示，促红细胞生成素（rhEPO）可能发挥潜在的抗心肌细胞凋亡和促进血管新生等作用，从而发挥对缺血再灌注心肌的保护作用。但由于促红细胞生成素同时具有促血小板聚集血栓形成的风险，难以应用于临床。在对促红细胞生成素三级结构研

2、究中发现，促红细胞生成素类似结构、促红细胞生成素B螺旋结构表面缩氨酸（pHBP）是红细胞生成素三级机构中的部分区域结构，分子量为1257,无促血小板聚集作用，保留组织保护结构区域，与组织保护的受体相结合。本实验拟探讨pHBP在心肌缺血损伤中是否具有心脏保护作用及可能机制。1材料与方法实验材料取10周左右雄性SD大鼠80只，体重（200±20）g,由南昌大学动物实验中心提供。乳酸脱氢酶（LDH）和肌酸激幅同工幅（CK-MB）检测试剂盒购自武汉亚法生物制品有限公司，重组人红细胞注射液购自沈阳三生有限制药公司，兔抗p44/42MAPK、辣根过氧化物幅标记的羊抗兔IgG均购自美国Santa生

3、物公司。pHBP由AraimPharmaceutical购得。动物分组及模型建立参考赵秀梅等的垫扎球囊法制作大鼠缺血再灌注（I/R）模型，实验动物分为4组。假手术组（n=20）,丝线穿过冠状动脉左室支但不结扎，经尾静脉注射生理盐水；I/R组（n=20）,建立动物模型后5min后通过尾静脉接受静脉注射注射生理盐水1mL/kg;I/R+pHBP组（n=20）,建立动物模型后5min后通过尾静脉接受静脉注射pHBP1wg/kgI/R+rhEPO组（n=20）,建立动物模型后5min后通过尾静脉接受静脉注射注射rhEPO3000U/kg。生化指标检测I/R120min后自腹主动脉取血6mL,静置30m

4、in,4c下，以离心半径5cm,3000r/min离心10min,分离血清。按照试剂盒说明采用化学比色法测定血清乳酸脱氢幅（LDH）、肌酸激幅同工幅（CK-MB）含心肌梗死面积测定存活大鼠在制模24h后处死，取新鲜大鼠心脏，用PBS缓冲液冲洗，滤纸吸干，-20C冰冻30min后将其横断面切成12mm切片，1%TTC37c染色25min,切片放4%甲醛中过夜以增强颜色对比，非心肌梗死区染色为红色，梗死区不染色。扫描仪扫描心脏切片，使用imageproplus软件测量相关区域面积，梗死面积（）=左心室组织切片梗死区面积/左心室组织切片总面积M00%。Westernblot法检测p44/42蛋白表达

5、手术处理后的存活大鼠在制模后3、24h进行处死。可以通过组织颜色改变鉴别心肌缺血组织和正常组织，进行组织切片放入液氮冷冻心肌梗死组织标本将通过Westernblot方法测定p44/42MAPK,分别取各组心肌组织，提取总蛋白，收集上清液，考马斯亮篮法进行担保定量。SDS-PAGE分离样品后电泳转移至硝酸纤维膜上，TBST常温下封闭过夜后，分别加入anti-NF-kB小鼠单抗（一抗）、室温下免疫沉淀1h,加入加入辣根幅标记兔抗山羊IgG（二抗）2ho洗膜，显色。具体实验方法参照文献，实验胶片扫描后用ImageJ软件进行图像分析，以&actin（1：1000稀释）本文为网络收集精选范文、公

6、文、论文、和其他应用文档，如需本文，请下载作为内参照对比，比值结果表示其蛋白的相对含量，用Gel-ProAnalyzer分析软件分析通道蛋白的灰度值。统计学方法采用SPSS统计软件处理。正态分布计量资料以均数曲准差（xis）表示，多组间比较采用方差分析，两两比较采用LSD-t检验。计数资料以率表示，采用X外佥验。以P）;与I/R组比较，差异均有统计学意义（P）。各组心肌组织p44/42MAPK蛋白表达Westernblot法检测各组p44/42MAPK蛋白水平，与I/R组比较，制模3hI/R+pHBP组心肌梗死组织p44/42MAPK蛋白表达明显升高，差异有统计学意义（P）。与I/R组比较，制

7、模24hI/R+rhEPO组心肌梗死组织p44/42MAPK蛋白表达明显升高，差异有统计学意义（P）。见表2。表2各组p44/42MAPK蛋白表达（ng/L,xis）注：与假手术组比较，*P<与I/R组比较，#P<I/R:缺血再灌注；rhEPO促红细胞生成素；pHBP:促红细胞生成素类似结构；p44/42MAPK:蛋白激幅丝氨酸/苏氨酸激幅3讨论心肌细胞凋亡在持续缺血或再灌注期间均可出现，且与缺血程度、缺血时间长短等有关。心肌细胞凋亡在缺血再灌注损伤中所起作用越来越引起人们的重视，但确切机制还不清楚，可能与细胞在受到刺激后产生大量氧自由基、细胞内钙超载、线粒体损伤、炎症细胞浸润和基

8、因调控等有关。缺血再灌注损伤引起的心肌细胞死亡有两种机制，即坏死和凋亡，并且凋亡是引起心血管系统疾病的重要原因心肌再灌注虽然恢复了血流，但同时也可能加速了受损心肌细胞的凋亡过程，故细胞凋亡在心肌缺血再灌注损伤的病理过程中发挥着重要的作用。不同时间的心肌缺血/再灌注均有心肌细胞凋亡，而且心肌损伤加重与心肌细胞凋亡增加同时并存，推断细胞凋亡是缺血/再灌注损伤的重要机制。大量实验研究和临床观察日益显示出心肌细胞凋亡，主要是由再灌注启动的现象，但亦有研究表明心肌缺血性损伤也可以诱导心肌细胞凋亡的发生。寻找有效减少心肌细胞凋亡药物，恢复缺血区心肌细胞正常功能，已成为心肌缺血再灌注药物研究的重要方面。研究

9、发现pHBP可以减少肾脏缺血再灌注过程中肾小管细胞凋亡抑制冠状动脉粥样硬化病变过程，并且通过激活Akt抑制冠状动脉上皮细胞凋亡。本次实验发现在注射pHBP后LDH、CK-MB含量减少，减少心肌损伤，心肌梗死面积下降，与I/R组比较，差异均有统计学意义（P<）,说明其具有促红细胞生成素相似的心脏保护特性，可以改善大鼠心肌缺血再灌注损伤。丝裂素活化蛋白激幅（MAPK）是一种介导细胞内信号的丝氨酸-苏氨酸激幅，目前，在MAPK超家族中已有3个亚家族被描述，分别为p44/42MAPK、应激激活的蛋白激幅（JNK）和高渗透性廿油反应激幅（p38MAPK）。其中p44/42MAPK为脯氨酸导向的丝氨

10、酸/苏氨酸激幅，是最重要的MAPK家族成员，参与调节细胞的有丝分裂和分化，是将信号从细胞膜表面受体转导至核的关键，是细胞因子、生长因子介导细胞增殖效应中重要的途径之一，其活性受到蛋白激酶的磷酸化及蛋白磷酸幅的去磷酸化调节。p44/42MAPK接受上游分子MAPKK（MAPKKinase,MAPK激酶,又称MEK2/MEK1）的磷酸化调控信号后，相邻的酪氨酸和苏氨酸均被磷酸化，从而成为活化形式的p44/42MAPK。被激活的p44/42MAPK使胞浆中其他一些酶磷酸化而直接发挥生物学效应；或者转移至细胞核内，并激活一些核内转录因子，使一些转录因子磷酸化从而调节细胞内的基因表达状态，改变基因表达状

11、态从而减少细胞凋亡参与细胞的增殖分化。p44/42MAPK具有促进细胞增殖）抗凋亡的作用。Westernblot结果发现pHBP和rhEPO组激活了抗凋亡途径，p44/42MAPK蛋白表达增加。rhEPO组制模处理后24hp44/42MAPK蛋白被激活，pHBP制模3h后激活p44/42MAPK蛋白被激活，激活效应在24h内消退。激活时间差异与药物血浆半衰期不同有关。pHBP可以在更短的时间内激活抗凋亡蛋白p44/42MAPK,减少心肌缺血再灌注损伤。本研究发现，pHBP具有rhEPO相似的心肌缺血再灌注损伤的保护作用，由于其没有抗血小板聚集增加血液流变学及血栓形成的风险，故可以考虑更安全地应

12、用于临床，值得进一步的研究。RuizMM,GarcaDA.Pathophysiologyofischemia-reperfusioninjury:newtherapeuticoptionsforacutemyocardialinfarction.RevEspCardiol2009,62(2):199-209.LishmanovYB,NaryzhnayaNV,MaslovLN,etal.Functionalstateofmyocardialmitochondriainischemiareperfusionoftheheartinratsadaptedtohypoxia.ExpBiolMed,20

13、14,156(5):645-658.UebaH,ShiomiM,BrinesMetal.SuppressionofcoronaryatherosclerosisbyhelixBsurfacePeptide,anonerythropoietic,tissue-protectivecompoundderivedfromerythropoietin.MolMed,2013,19(1):195-202.IsmayilA,HyunJ,MagdalenaJ,etal.asmallnonerythropoietichelixbsurfacepeptidebaseduponerythropoietinstructureiscardioprotectiveagainstischemicmyocardialdamage.MolMed,2011,17(3-4):194-200.AhmetI,TaeHJ,BrinesM,etal.Chronicadministrationofsmallnonerythropoieticpeptidesequ