TNF介绍讲解学习

1、1、 TNF的发现及发展历史目前普遍认为，TNF最早是1975年由Carswell发现的。Carswell在研究中观察到，经卡介苗致敏的小鼠被注射大肠杆菌内毒素后，血清中出现一种物质，该物质在体内可以使移植肿瘤发生出血、坏死，遂将该物质命名为肿瘤坏死因子（tumornecrosisfactor,TNF）1。其实早在十九世纪后期，Coley等就观察到，当肿瘤患者伴有感染时，其肿瘤偶尔可以消退甚至痊愈。基于这些发现，Coley等开始用一些灭活的G+和G-细菌混合物作为疫苗，来治疗恶性月中瘤，称为“Coley毒素”疗法2。Coley毒素的应用，大大提高了软组织肿瘤患者的生存率，这在当时获得了较高的评

2、价。1936年，随着Coley的去世，人们对Coley菌苗的兴趣被广泛应用的化疗和放疗所取代。100多年后的今天，当人们再次关注“Coley毒素”疗法的时候，发现该疗法的主要原理之一就是通过诱导体内产生大量的TNF来实现抗肿瘤作用的3。自Carswell发现TNF后，许多学者进行的其他研究均观察到TNF在体外和体内对多种月中瘤细胞有明显的细胞毒作用。1984年Pennica等首次克隆了人TNF-a的cDNA,并在大肠杆菌中表达成功4o随后，即有许多学者致力于将TNF应用于临床的研究5。自1987年起，在欧洲（德国、英国、法国、波兰、埃及等）、美国、日本等地陆续有进行TNFI期和II期临床试验的

3、报道6。但临床试验的结果给对TNF满怀希望的人们带来的是失望。TNF类似严重感染所致的不良反应令患者难以耐受，而患者可以耐受的剂量似乎达不到抗肿瘤的浓度7。一时间TNF的临床研究陷入了低谷，进一步的临床研究几乎停滞。由于TNF明确的抗肿瘤活性，使得不少学者不愿轻易放弃对其的研究。90年代中期以来，陆续有临床研究者报道了TNF局部用药的临床结果8。证明TNF局部用药（大剂量局部灌流、肿瘤内注射、腔内注射等）既可达到良好的抗肿瘤效果，又可避免全身用药的严重副作用，这一发现重新燃起了人们对TNF的热情。随着对TNF结构和作用机制的深入研究，一些高效、低毒的TNF变构体不断涌现，TNF的临床研究又有了

4、新的进展。2、 TNF的生物学活性TNF是一种真正的多效因子，具有多种生物学效应。它可直接作用于T细胞、B细胞、Md、NK细胞等效应细胞，在细胞水平上发挥作用。1. 与受体结合，引起细胞破坏、死亡TNF与相应的受体结合后可向细胞内转移，被靶细胞溶酶体摄取导致溶酶体稳定性降低，各种酶外泄，引起细胞溶解9。也有认为TNF通过激活磷脂酶A2,释放超氧化物而引起DNA断裂10。TNF尚可改变靶细胞糖代谢，使细胞内pH降低，导致细胞死亡11。2. 损伤内皮细胞，激活凝血系统TNF可作用于血管内皮细胞，使内皮细胞损伤或导致血管功能紊乱12；通过激活凝血系统的活性，导致血管内血栓形成，引起组织供血障碍13。

5、3. 引起机体发热TNF作为内源性致热原，引起发热的机制可能是通过直接刺激下丘脑体温调节中枢和刺激巨噬细胞释放IL-1而引起，还可通过IL-1、TNF-a刺激其它细胞产生IL-614。4. 促进细胞的增殖和分化，调节机体免疫功能TNF促进T细胞MHCI类抗原表达，增强IL-2依赖的胸月M细胞、T细胞增殖能力，促进IL-2、CSF和IFN-丫等淋巴因子产生，增强有丝分裂原或外来抗原刺激B细胞的增殖和Ig分泌15；它能促进T细胞及其它杀伤细胞对肿瘤细胞的杀伤，并增强CTL对病毒感染细胞的杀伤作用16。5. 抑制新骨生成、刺激骨吸收TNF在体外可刺激骨质破坏和再吸收，抑制新骨形成17。将重组TNF加

6、入体外骨培养物可使多核的破骨细胞数增加，矿化的骨质质量下降，骨胶原(骨质的主要成分)合成抑制。TNF刺激骨吸收是通过诱导成骨细胞产生一种可溶性因子完成的18。6. 激活嗜中性粒细胞和巨噬细胞嗜中性粒细胞是一种特殊的白细胞，它可提供第一道防线，吞噬或杀伤入侵的微生物。在急性炎症反应阶段，它抗击入侵微生物的同时，也可使宿主组织发生损伤。TNF-a刺激嗜中性粒细胞可引起噬菌作用、脱颗粒作用和呼吸爆发活动的增加19。TNF可提高中性粒细胞的吞噬能力，增加过氧化物阴离子产生。同时TNF-a可提高中性粒细胞合成PAF的作用并可促进中性粒细胞粘附到内皮细胞上20。TNF-a也可促进单核巨噬细胞的活化，加速I

7、L-2受体的表达2103、 TNF抗肿瘤作用的机制TNF最明显的活性特征是可以在体内或体外特异性杀伤肿瘤细胞，而对正常细胞无明显的毒性作用，且抗肿瘤作用没有明显的种族特异性22。目前认为TNF的抗肿瘤机制主要有以下几个方面：1. 通过TNF受体介导的对肿瘤细胞的直接杀伤作用对TNF敏感的肿瘤细胞表面存在TNF受体(TNFR)，TNF通过与该受体结合，引发细胞的一系列变化，最终导致肿瘤细胞的死亡。研究发现，TNF经过TNFR的识别、结合、内吞，导致一系列的变化，膜蛋白特异性磷酸化，产生大量热能，溶酶体酶类高度活化，膜通透性增加，蛋白酶类溢出，导致细胞溶解；也有证据表明，TNF与受体结合后可使细胞

8、的线粒体产生的自由基增加，使质膜过氧化，引起细胞损伤23。2. 抑制细胞生长和诱导凋亡。TNF与受体结合后，可通过细胞内的一系列级联反应，诱导肿瘤细胞凋亡。TNF直接抑制细胞生长的作用也通过肿瘤细胞表面的特异性受体介导24。主要通过影响其蛋白质的代谢，导致肿瘤蛋白质合成减少，分解增加，从而抑制肿瘤生长25。3. 通过损伤肿瘤的血供系统而导致肿瘤的坏死月中瘤的血液供应丰富，对血液供应所减少较为敏感。TNF-a除了对月中瘤细胞具有细胞毒性作用之外，更重要是它能摧毁实体瘤周围的血管上皮组织，并且通过血栓的形成，阻断肿瘤的血液营养供应，最终导致肿瘤的出血性坏死、消退和消失26。另外，一般肿瘤周围血管组

9、织是没有规则和不完善的，它们表现为血管的多曲折性和多结性等。而且有些实体瘤本身发生就是缺氧下选择性克隆产生的，远离血管，因此化疗药物很难预期达到这些肿瘤周围并发挥作用27，而TNF-a能明显降低实体瘤周围间隙组织的压力，扩大月中瘤周围上皮组织的间隙，并改变肿瘤周围血管的通透性，使联用的化疗药物到达这些靶组织周围,而且TNF-a能延长药物在月中瘤周围的持续时间，发挥抗月中瘤作用28oTNF还可有促凝作用，可引起肿瘤部位血管内的血栓形成，从而阻断肿瘤的血液供应。超过一定浓度的TNF-a具有明显的抗新生血管形成作用。有报道显示TNF-a对形成不超过9天的新生血管组织抑制作用更强烈29。有新的实验证据

10、显示30,TNF-a联合其他药物能在分子水平上明显抑制整合素（integrin）av03的活性（这种整合素在肿瘤的新血管形成中起重要作用），进而在动物模型中引发肿瘤血管上皮细胞的解体和凋亡，而这种作用不伤害周围正常血管上皮组织。这个实验为TNF-a有选择性的抑制月中瘤血管上皮组织的作用提供了分子基础。4. 通过引起肿瘤局部的炎症反应和机体的免疫系统发挥抗肿瘤作用TNF-a是一种细胞因子，它对人体免疫系统具有很重要的调节作用31o例如，TNF-a对免疫细胞树突状细胞具有催熟作用，具有激活和刺激T细胞作用32 oTNF-a可导致月中瘤局部的炎症反应，增强单核细胞、巨噬细胞和中性粒细胞的杀伤作用，增

11、强T细胞的增殖和杀伤作用，还可诱导产生其他细胞因子如IL-2、IFN等，通过“级联作用”发挥更强的杀月中瘤活性。另外，TNF-a通过对核内基因的调控，促进肿瘤抑制基因P53的表达33，从而加强机体自身的抗肿瘤作用34。5. 逆转肿瘤细胞的多药耐药，增加对化疗药物的敏感性TNF可以逆转肿瘤细胞的多药耐药，增加对化疗药物的敏感性，因而与化疗药物有较好的协同作用。用对阿霉素耐药的K562细胞株进行研究的结果显示，TNF-a可使K562细胞的耐药性有明显的逆转34。局部灌流治疗时观察到，TNF可使美法伦在肿瘤局部的浓度提高，从而提高美法伦的抗肿瘤活性35。总之，TNF在整体的抗肿瘤机制较为复杂，目前仍

12、有未完全清楚的地方。但普遍的观点认为，除了直接的对肿瘤细胞的杀伤作用外，机体的免疫状况、肿瘤的特性等均在其中起着较为重要的作用。四、TNF-a诱导的针对肿瘤细胞的细胞毒性作用的途径和机制TNF-a对月中瘤细胞直接的细胞毒作用主要是通过TNF特异性的受体完成的360细胞膜上的TNF-a受体是跨膜蛋白，其N端位于胞外，C端位于胞内。受体有两种亚型37，即TNFR1和TNFR2。这两类受体蛋白质的相对分子质量分别为55kDa和75kDa,故又将其称为P55R（即TNFRi）和P75R（即TNFR2）。两种受体在细胞类型的分布上没有特异性38。这两种受体的胞外部分有部分的同源性，但是在胞内部分几乎没有

13、同源性39。TNFR1介导了TNF的主要生物活性反应，在细胞损伤、诱导SOD及抗病毒活性、成纤维细胞增殖、诱导细胞凋亡、激活NK-kB等多种生物活性的信号传递方面起重要的作用；而TNFR2主要传递胸腺细胞和NK细胞等的淋巴细胞的增殖信号40图1.显示了TNFRi与受体结合后所引发的一系列细胞内信号传导及反应0005DOSTNFRi的C端含有一段由90个氨基酸组成的死亡结构域(deathdomain,DD)。TNF-a信号的起始是TNF-a三聚体与TNFRi的胞外部分结合。TNFRi的胞内部分在非活性状态下它的死亡结构域上结合了一种被称SODD(silencerofdeathdomai。的蛋白质

14、，起到抑制TNFRi三聚体化的作用。当TNF-a与TNFRi结合后，SODD就从TNFRi的死亡结构域上释放出来，通过细胞中的一系列接头蛋白(adaptorprotein)来实现TNFRi的活性。第一个连接上去的接头蛋白是TNF-a受体相关死亡结构域蛋白(TNFreceptor-associateddeathdomain,TRADD)。它通过自身的死亡结构域与TNF-aRi的死亡结构域结合4i。TRADD随后又活化另外三个接头蛋白：FADD(Fas-associateddeathdomain),TRAF2(TNF-Rassociatedfactor2及RIP(receptor-interact

15、ingprotein)结合，后者又各自汇集起始不同信号途径的蛋白，产生不同的效应42。TNFRi与TNF结合后的信号传导主要有以下几个途径。1.FADDcaspase-腌径FADD43的C端含有死亡结构域，N端含有一段起调节作用的功能区，是介导凋亡信号传导所必需的，称为死亡效应结构域(deatheffectordomain，DED)44。当TRADD结合到TNFR1后，FADD通过自身的死亡结构域与TNFR1-TRADD结合，激活了FADD。细胞内caspase-M体中的死亡效应结构域与FADD的死亡效应结构域结合，从而使caspase-81F体寡聚化，caspasesl一种存在于细胞质中的和

16、细胞凋亡有关的蛋白酶45o寡聚化的caspase-M体发生自剪接作用产生有活性的caspase-8后者又激活caspase-3fficaspase-7接下去caspase-双激活caspase-6如此启动caspase勺级联反应，最后导致细胞凋亡。2 .TRAF2JNK途径第二个接头蛋白是TRAF2。TRAF2又激活MAPKKK(mitogen-activatedproteinkinasekinasekinase)，即MEKK(1extracellularsignal-regulatedkinasekinasekinasei)或ASKi(apoptosis-stimulatedkinasei)

17、。MEKK1或ASKi又激活MKK7或JNKK246，后者又激活JNK。一旦JNK被激活，JNK蛋白就进入到细胞核内，磷酸化激活c-Jun,增进基因的表达，从而促进细胞凋亡的发生。3 .TRAF2NF-kB途径TRAF2还激活NIK(NF-kBinducingkinase),NIK又去激活IKKs47。IKK复合体包含两个催化亚单位IKKa、IKKB和一个调控亚单位IKK丫/NEMO(NF-kBessentialmodulator')48,还包含一个由Cdc37和Hsp90组成的激酶特异性分子伴侣。它们负责在细胞质和细胞膜之间运输这个复合体49。没有活性的核内调控因子NF-kB是存在在

18、细胞质中的50。TNF-a处理几分钟后，IKK被激活，IKK丫使NF-kB上的抑制因子IkB基团磷酸化51。磷酸化的IrB又发生多泛素化(polyubiquitinated)并迅速被蛋白酶体(proteasomR降解，因此活化的NF-kB分子量变小，进而能穿过核膜进入核内调控各种基因52o其结果是抑制细胞凋亡和促进炎症反应以及各种免疫反应53。4 .TRAF2cIAPs途径TRAF2可以汇集抑制细胞凋亡的蛋白cIAP-i和cIAP-2(cellularinhibitorofapoptosisprotein-1/-2）54。cIAP-1和cIAP-2是存在在细胞质中的抗凋亡蛋白，有泛素蛋白连接酶

19、活性，可抑制细胞的凋亡。5 .RIPNF-kB途径结合在TRADD上的第三种接头蛋白是RIP（receptor-interactingprotein）。它主要通过IKK复合体来诱导NF-kB途径。基因剔除实验证明：TNF-a受体1是主导的受体反应55;而TNF-a受体2则活化一种接头蛋白TRAF2的反应56。近期的研究还发现，一条途径的减弱会增强另一条途径的效应叼。例如：缺少NF-kB活性时，细胞对TNF-a诱导的凋亡敏感性增加58,同样nf-kB活性增强，细胞就不容易发生凋亡59。另外，缺少NF-kB时，细胞由TNF-a诱导的JNK活性会增强60,而由NF-kB激活的几个基因产物（gadd4

20、5B和XIAP）则会抑制JNK活性61。而且，NF-kB的激活促进屋B和其它抑制细胞凋亡的因子（cIAPs）的重新合成62,从而增加了对TNF-a信号调控的持续性63。五、野生型TNF-a和TNF-a变构体的结构体内有多种细胞可释放具有TNF活性的细胞因子，人们把由活化的巨噬细胞释放的TNF,命名为TNF-a,而将源于淋巴细胞，具有TNF样抗月中瘤作用的淋巴毒素称为TNF-B64,新近又将自然杀伤细胞NK产生的NK细胞因子称为TNF-T65。成熟的人TNF-a蛋白由157个氨基酸残基组成，3个相同的TNF-a单体亚单位以边对面的形式形成三聚体结构。图2.为TNF-a的结构示意图。由于野生型的T

21、NF-a在临床试用后出现了较为严重的毒性作用，曾使TNF全身用药的临床试验陷入停顿。但TNF-a明确的杀伤月中瘤细胞的活性使得科研人员不愿轻易放弃对其的研究。除了不断探索其不同的给药途径外，人们试图通过对其结构进行改造，以期获得高效低毒的TNF变构体。八十年代中期，研究人员用“随机突变法”和“定位突变法”把TNF-a的157个氨基酸上的每一段，甚至每一个氨基酸通过缺失和更换的手段来检测它对TNF-a功能的影响66。TNF-a是由17KD的多肽，它的活性状态是三聚体52KD的形式，三聚体间沟是由近N端和C端的极性基团及中部的疏水基团所组成的，而这些亚单位之间的沟是TNF-a与其受体结合的部位67

22、。总的来讲，完整的C端对保持TNF的生物学活性是必需的，缺失任何一个氨基酸都会对TNF-a的抗肿瘤活性造成损害68。但是，C末端的的最后一个氨基酸Leu157改变成Phamet或者Glu,都能使其活性有较大的提高，有证据显示这种改变使疏水性的TNF-a亚基之间的结构变得更紧凑，从而提高了TNF-a同受体结合的效率69。与此相反，N端的氨基酸的丢失对TNF-a活性的影响不大，而且丢失1-7个N端的氨基酸，增加了其碱性度，提高了TNF-a和受体的亲和度，使TNF-a的活性增加70。不仅如此，N端的8、9、10和17个氨基酸变成碱性氨基酸，使某些对野生型TNF-a不敏感的月中瘤细胞变得敏感了，扩大了

23、TNF-a的疗效范围，而且还增强了其抗月中瘤的活性°。这些结果给研究和开发更高效、低毒的TNF变构体提供了空问。自90年代初，不断有学者对野生型TNF进行结构改造的报道，他们利用减少N-端的氨基酸数、将一些氨基酸残基进行置换等方法，陆续获得了一些较野生型TNF与受体结合能力更强、抗月中瘤活性更高、且毒副作用更小的新型TNF变构体72（如突变体471、M3、F4616、TNF-B等），使得TNF的临床应用价值重新引起重视。六、新型重组人TNF-民的药理活性特点目前我们公司生产的新型人TNF-a突变体与天然人TNF-a比较，N末端缺失了7个氨基酸的编码序列，天然人TNF基因中编码为Pro

24、8Sei9Asp10的编码序列由ArgLysArg的编码取代，157位的Leu被Phe取代。实验证明，这样经过改造后的TNF-a变构体，较野生型的TNF-a与受体的亲和力更强，因而明显提高了其抗月中瘤的疗效，扩大了应用范围；同时新型TNF的毒副作用较野生型明显减轻，提高了月中瘤患者全身用药的耐受性。图2.为TNF-a的示意图，黄色部分为突变部分。图2.1 .细胞水平上的抗肿瘤活性用L-M细胞作为试验对象，比较471突变体和野生型TNF-a的抗月中瘤活性73。结果显示，471突变体比野生型TNF-a能更有效的杀死L-M细胞，其有效活性分别为2.00X07U/mg和3.03106U/mg。2 .受

25、体结合活性表1.总结了471突变体和野生型TNF-a的受体结合活性74。每个L-M细胞表面471突变体和野生型TNF-a的受体数量都为5000个左右，没有明显的差异，这说明471突变体和野生型TNF-a结合于同一受体上。两者的Kd值分别为4.08109M和1.65109M。因而，突变体与受体的结合活性比野生型TNF-a要表1.野生型和突变体471对L-M细胞的作用TNF受体数量Kd值（M）野生型TNF_35.04X103一_-91.65X10突变体4715.06X103-94.08X1093 .体内抗肿瘤活性将MethA-HM细胞移植BALB/c小鼠体内（5X105i.d.注入侧腹壁）进行47

26、1突变体和野生型TNF-a的抗癌月中瘤活性检验75。当月中瘤长到直径为68mm时（0天）i.v.给药（用PBS溶解50仙g的471突变体或野生型TNF-a）。随后，在2、6、8、10天继续给同样剂量的TNF-a,实验中对照小鼠只给PBS。结果显示，同样剂量的471突变体比野生型TNF-a有更好月中瘤抑制效果。由471突变体引发的平均坏死反应是+,而野生型的是+。采用471突变体处理的小鼠与对照小鼠相比生存时间明显延长，但用野生型TNF-a处理的小鼠生存时间则没有明显延长。471突变体处理组的5只小鼠中有2只在15天月中瘤完全消退76o4 .急性毒性采用B-D-半乳糖胺-激活的C3H/Hej鼠来

27、检测471突变体和野生型TNF-a的急性致死毒性"。表2.显示了两类TNF-a不同剂量的作用结果。野生型TNF-a以浓度为16pg/k给药后，小鼠出现100%致死率。但同样剂量的471突变体只有20%致死率。471突变体和野生型TNF-a的LD50值分别为35仙g/kg和2仙g/kg由此可见，471突变体的致死毒性比野生型的要低很多表2.TNF的急性毒性试验死亡率（死亡数/总数）TNFg/kg141664128356TNF0/55/55/55/55/55/5突变体4710/50/51/54/54/55/5总之，无论是采用体外杀伤细胞实验还是采用动物体内生长抑制及坏死反应来比较471突

28、变体和野生型TNF-a的抗月中瘤活性，均显示471突变体的抗月中瘤活性比野生型TNF-a要高。受体结合实验结果也表明，471突变体较高的对月中瘤细胞的杀伤毒性可能由于它是有高的受体结合活性。整体动物研究中，还观察到了一些小鼠月中瘤的完全消退。另一方面，471突变体比野生型TNF-a有较低的LD50,因此471突变体比野生型TNF-a更有效且毒性更低。七、TNF抗肿瘤作用的临床研究概况自TNF发现以来，其抗月中瘤效果一直是得到公认的。自从1984年TNF的cDNA克隆成功，很多研究者就将其基因工程产品试用于临床。但I期和R期临床研究的结果颇为令人失望，全身用药带来的严重的毒性反应让临床研究一度陷

29、入停滞。八十年代末，著名的Eggerment78和Lejeune为首的两个临床研究小组分别对不能手术切除的HIV级软组织肉瘤病人和转移性黑色瘤病人，用TNF-a联合抗月中瘤药物美法伦或者丫-干扰素，进行隔离性肢体灌流法治疗。治疗效果达到了（CR+PR）90%和70%。如此满意的效果在月中瘤生物治疗史上是前罕见的82。于是，人们重新开始审视原先对TNF的认识。在1999年第35届美国临床月中瘤年会上专家们达成共识80:（1）TNF-a被重新确认，肯定它对月中瘤治疗具有明显的疗效。（2）TNF-a是具有潜力的抗月中瘤药物，今后对TNF-a的研究和治疗应给予更多支持。同时，欧洲药物审评委员会（EME

30、A）亦重新登记和接纳了TNF-a作为抗月中瘤药物81。另外，美国的FDA批准了美国国立月中瘤研究院（NCI）牵头的TNF-a治疗转移性黑色素瘤的田期临床研究方案83oTNF作为抗月中瘤药的临床研究进入了柳暗花明的新阶段。1. 局部用药的临床研究大量的临床研究结果表明，TNF单独或配合其他抗肿瘤药，用于肿瘤的局部给药，可在肿瘤局部获得较高的TNF浓度，达到较好的治疗效果，而不出现全身大剂量用药所引起的严重不良反应。（1）直接瘤内注射有报道对各种类型癌症病人，将TNF直接注入肿瘤局部缓解率可达4084。国内解放军第88医院完成了B超引导下局部注射TNF治疗肝癌30例临床研究85，取得了良好的效果。

31、（2）腔内注射胸、腹腔内注射对于恶性胸腹水的治疗有较好的疗效86;膀胱内灌注，治疗膀胱癌也可见明显疗效87；心包腔内注射治疗恶性心包积液88，可获得CR40.0%（8/20）,PR40.0%（8/20）的疗效。（3）隔离肢体灌流LejuneF89和Eggermont90率先将TNF用于肢体灌流，治疗肢体软组织肉瘤和骨肿瘤，其疗效高达到90和70，替代了截肢，提高了病人的生活质量91。另有报道，TNF与美法仑联合应用隔离肢体灌注治疗肢体黑色素瘤和软组织肉瘤，有效率高达70-10092。在高温隔离灌注化疗的同时加用肿瘤坏死因子，可提高对肢体肿瘤局部控制作用93明显改善患者的生活质量94。（4）隔离

32、肝脏灌注（isolatedhepaticperfusio，nIHP）有研究显示，将肝脏血液循环与体循环系统隔离，利用心肺机进行体外循环，将TNF-a联合美法伦或阿霉素肝脏灌注，可取得较好的治疗效果95o目前以TNF-a为主联合用药隔离肝脏灌注法（IHP）已进入II期临床研究。日本的NakamototT等应用此法治疗肝癌有效率已超过75%;应用于转移性肝脏月中瘤60例，有效率亦高达60%96。除了隔离灌流外，亦有应用介入疗法经肝动脉插管，注入TNF治疗肝脏肿瘤的研究报道97。除肝脏之外，隔离灌注法还可以用于肺98、肾99等器官，也取得了较为满意的结果。总之，TNF的局部用药，解决了全身用药难以达

33、到有效浓度，或用药量过大病人难以耐受的问题，使得肿瘤局部的TNF浓度和维持时间能达到有效抗肿瘤的效果，为肿瘤的治疗提供了一条有效的途径。2. TNF全身用药的抗肿瘤效果由于TNF早期的临床研究应用的是野生型的TNF,因毒副作用较大而难以给予较大的剂量，故临床效果并不如体外实验和动物实验的结果那么令人鼓舞。随着基因工程技术的应用，出现了多种高效低毒的突变体，这些突变体进行临床试验的结果也不断有所报道。（ 1） TNF单用于肿瘤的治疗日本学者1001998年前将其研制出的TNF突变体TNF-SAM2用于治疗结直肠癌肺转移，得出结论：TNF-SAM2毒副作用轻，抗肿瘤治疗效果明显优于TNF-a101

34、。我国于20世纪90年代下半叶起，即有不少关于TNF治疗肿瘤的报道。文献显示，单用TNF治疗晚期肺癌，可获得42.6的有效率（PR+CR），若与化疗药物合用，则有效率可达77.2（PR+CR）102。单用TNF治疗晚期肿瘤患者的恶性胸腹水，也有明显的疗效103。由于恶性肿瘤的治疗多采用综合疗法，除少数晚期患者，经各种治疗方法无效时方采用TNF单独治疗，因此，全身性单用TNF治疗肿瘤的报道不多，多数为与其他疗法合用的报道。（ 2） TNF与其他抗肿瘤药物合用大量国内外临床研究资料表明，TNF-a与许多化疗药物或细胞因子联合使用，抗肿瘤作用增强。在局部用药治疗肢体软组织肉瘤、黑色素瘤、骨肿瘤和肝癌

35、时，多以TNF-a为主，联合应用美法仑104及干扰素-丫105、阿霉素106等，可显著提高疗效。一般认为其作用机理为：TNF-a摧毁了月中瘤周围的血管上皮组织，使瘤体暴露在药物的攻击之下，瘤体周围药物浓度可增加3-6倍107。因而，抗癌效果明显增强。其他学者108的研究也证明TNF-a同TGF-B、1干扰素、美法伦、阿霉素和各种抗炎药物的联合使用，有协同抗月中瘤作用。Inagawa等研究发现，TNF与烷化剂如环磷酰胺合用时，疗效可提高4-5倍，认为与改变了宿主的免疫状态有关109。YamasaliK等对结直肠癌转移患者使用内源性和外源性TNF联合其它抗癌药物，如5-氟尿嘧啶（5-Fu）、丝裂霉

36、素C（MMC），疗效提高，患者耐受性增强110。波兰学者ChcialowskiA等进行的I、II期临床研究表明，TNF-a与其它细胞因子（如INF-丫、IL-2）及细胞增殖抑制药物（如足叶乙花、环磷酰胺）有协同作用111。国内这方面的研究报道也较多。如以新型肿瘤坏死因子与顺铂联合腹腔灌注治疗恶性腹腔积液112，联合组有效率93.94（31/33）明显高于单药（顺铂）组的66.67（20/30），且联合用药未增加顺铂的副作用，而TNF副作用轻微。TNF与IL-2联合应用胸腔内注射治疗恶性胸水的临床研究也显示了两者的协同作用113。本公司与第四军医大学生物技术中心联合研制的新型重组人肿瘤坏死因子（

37、rmhTNF）,经H、m期临床试验证实，rmhTNF联合化疗药物在治疗肺癌、消化道癌、头颈部癌、黑色素瘤等恶性肿瘤中，具有协同作用和化疗增敏作用，能明显提高临床疗效，改善患者的一般状况和生活质量，提高患者的抗病能力，减少化疗中感染的发生率和抗生素的使用率。rmhTNF单用对放化疗失败，而又无其他治疗方法的晚期恶性肿瘤亦有一定的疗效。rmhTNF的毒副作用少，患者均能耐受。H、m期临床试验结果表明，rmhTNF临床应用安全、有效（资料待发表）。八、TNF的耐受性和药代动力学研究1耐受性研究早期对野生型TNF的大量临床研究显示，人体对TNF的耐受性较差，其主要的毒副作用的表现与急性全身性感染的症状

38、很相似，其严重程度并非总是与用药剂量相关，也未观察到药物积蓄作用114，且并不引起致死性器官功能障碍115。这主要是由于TNF本身的致炎作用的结果116。全身应用（包括儿童117）的毒副作用主要为118：（1）心血管系统：低血压、心律失常；（2）血液系统：中性粒细胞、血小板、淋巴细胞、白细胞、血红蛋白减少，停药后恢复；（3）神经系统：头痛、发热、寒颤、疲倦、嗜睡、感觉异常、骨肌肉疼痛、定向障碍、癫痫样发作、行为异常；（4）消化系统：肝损伤：胆红素、转氨酶、碱性磷酸酶升高，停药后恢复；胃肠道：恶心、呕吐、腹泻、消化不良、胃出血；（5）泌尿系统：尿少、肌酐清除率下降；（6）呼吸系统：可出现致命的A

39、RDS症状、过敏样支气管痉挛；（7）皮肤系统：注射局部疼痛、红肿、硬结、瘙痒、过敏反应、脱发；（8）代谢系统：体重下降、甘油三酯升高。经过结构改造后的TNF变构体的上述毒副作用较野生型明显减轻，临床研究显示119,月中瘤患者可接受静脉注射的TNF衍生物rmhTNFaDa4X106IU/dX5d的剂量，其主要的毒性反应为发热、寒战，其他的不良反应如头痛、恶心、呕吐、血压改变等均轻，无需特殊处理。我公司的rmhTNF亦有较好的耐受性。由于是肌肉注射给药，月中瘤患者可接受400万u/m2/dX7的剂量，主要的不良反应为轻到中度的发热、注射局部的疼痛、硬结，少数患者出现骨肌肉疼痛和感冒样症状，这些不良

40、反应均较轻，一般无需特殊处理，不影响继续治疗。（研究资料待发表）。2.药代动力学研究（1）动物的药代动力学研究小鼠静脉给药后，TNF在体内的消除半衰期（ti/2）为0.51h120,肌肉注射的达峰时间（Tmax）为0.5h,在体内的分布情况以肾脏最高，血液其次，其后为肺、肝，脑组织浓度最低121。小鼠注射TNF后主要经肾脏排泄，24h尿放射性总回收率为87%122。恒河猴肌注rmhTNF后Tmax为1.7h,t1/2为1.42.4h,血液中的消除符合一室模型123。（2）人体的药代动力学研究静脉注射rhTNFaDa后，药时曲线符合二室模型，T1/2B为1.53±0.34h,表观分布容

41、积（Vd）为0.623L124。人体肌肉注射的药代动力学研究仍在进行中。九、TNF可用于临床的给药途径1. 全身用药一般认为TNF杀伤月中瘤细胞需要724小时，而人体实验表明TNF半衰期最常不超过2小时，因此要维持TNF的血浆浓度，必须持续静滴才行125。但持续静脉输入TNF可导致较严重的不良反应，病人难以耐受，且在治疗过程中机体尚可产生抗TNF的抗体，从而影响了TNF的抗癌作用。目前已用于临床试验的全身给药途径有静脉、肌肉和皮下给药等。我们公司的TNF注射剂的给药途径为肌肉注射。由于从肌肉吸收入血有一个过程，血中TNF达到的峰值水平较静脉给药平缓，故可以一次注射较大剂量而避免出现静脉给药时的

42、严重不良反应。2. 局部用药局部用药可以减少全身不良反应，肿瘤细胞可以较长时间暴露于高浓度的TNF中，以增强TNF的作用。局部给药方法有实体瘤内注射，胸膜腔、腹膜腔内注射，导管内（灌注）给药等，前面已有介绍。十、临床上与TNF联合用药的治疗方案每个月中瘤细胞表面有10002000个TNF结合位点，此位点的数目与月中瘤细胞的种类有关，也随细胞周期发生变化，一般认为在增值周期的G2-M期，受体的数目达峰值126。TNF治疗肿瘤的疗效与肿瘤细胞对其的敏感性(肿瘤细胞表面TNF受体的数量)以及TNF向肿瘤局部TNF的浓度有关。因此，设法增加肿瘤表面TNF受体的数量，以提高肿瘤的敏感性，和提高肿瘤局部T

43、NF浓度的方法，均可提高TNF的抗肿瘤疗效。肿瘤局部给药，如局部注射、局部血管内灌流等给药方法，可大大提高肿瘤局部的浓度，发挥较好的抗肿瘤效果，同时可减轻全身给药时的副作用。TNF与其他抗肿瘤药物合用，抑制蛋白质合成，破坏肿瘤周围的蛋白膜形成，可以有利于外源性TNF的渗入到月中瘤局部127;与其他细胞因子如yIFN、IL-1等合用，可以提高肿瘤细胞表面的TNF受体的含量，增加敏感性128。1. 与抗癌药物联合用药体外实验证实，rhTNF与顺铂或更生霉素联合应用有一定的协同抗癌作用，以rhTNF和更生霉素联合应用效果更好129。TNF与丝裂霉素联合应用产生协同的细胞毒作用130，其机制可能是TN

44、F通过受体进入细胞，使细胞停留在G2期，继而在M期溶解；丝裂霉素也是作用于M期的药物，故两者可产生较好的协同作用TNF与抗癌药物的协同作用可解释为共同破坏肿瘤细胞蛋白质代谢和细胞分裂，从而抑制或杀伤肿瘤细胞131。此外，TNF本身可以逆转肿瘤对化疗药物的耐药性，提高化疗药物的疗效132。2. 与其他细胞因子合用(1) TNF与丫-干扰素(IFN-丫)协同抗月中瘤作用通过不同白环节，IFN-丫可增加月中瘤细胞表面的TNF受体，协同抑制月中瘤细胞蛋白质的合成；TNF作用于G2期或M期，IFN-丫作用于S期，两种因子联合应用能协同增强抗肿瘤作用133。(2) TNF与白细胞介素-(IL-2)协同作用在TNF治疗时，肿瘤周围注射IL-2能明显增加一些肿瘤对TNF的敏感性。有研究表明，使用TNF之前，IL-2只能增加毒性反应而无抗肿瘤作用，但在TNF使用48小时后，IL-2与其产生协同作用，能明显地抑制肿瘤生长134。有研究者发现无论体内或体外，I