层析技术简介

1、第八章 层析分离技术生物分离过程的一般流程v 层析技术(chromatography)又称色谱法，俄国植物学家Michael Tswett于1906年首先创建v 1938年俄国人首先实现了在氧化铝薄层上分离一种天然药物 v 1941年Martin 和Synge发现了液液（分配）色谱liquid- lipuid (partition)chromatography, LLC第一节 层析技术概述一、层析的基本原理v （一）基本原理 层析分离是一种物理的分离方法，利用多组分混合物中各组分物理化学性质的差别，使各组分以不同的程度分布在两个相中。v 优点：（l）分离效率高。v （2）应用范围广。v （3）

2、选择性强。v （4）设备简单，操作方便。v 缺点：处理量小、操作周期长、不能连续操作，因此主要用于实验室，工业生产上还应用较少。（三）层析的基本概念v 1.固定相v 2.流动相v 3.分配系数及迁移率（或比移值）v 4.分辨率（或分离度）v 5.正相色谱与反相色谱v 6.操作容量（或交换容量）二、层析分离技术的分类1.吸附层析2.分配层析3.凝胶过滤（分子筛）4.离子交换层析5.亲和层析6.疏水层析三、柱层析基本操作技术1.装柱2.平衡3.加样4.洗脱5.流速控制6.分部收集7.洗脱峰检测、合并收集8.层析介质的再生第二节 吸附层析 (absorption chromatography) 一、

3、吸附层析的原理与特点v 吸附是利用吸附剂对液体或气体中某一组分具有选择吸附的能力，使其富集在吸附剂表面，而从混合物中的分离的的过程。v 典型的吸附过程包括四个步骤：吸附的类型（1） 物理吸附: 放热，可逆，单分子层或多分子层，选择性差（2） 化学吸附: 放热量大，单分子，选择性强（3） 交换吸附: 吸附剂吸附后同时放出等当量的离子到溶液中吸 附 法特点v （1） 不用或少用有机溶剂v （2） 操作简便、安全、设备简单v （3） 生产过程pH 变化小v （4） 从稀溶液分离溶质v （5） 吸附剂对溶质的作用小v （6） 吸附平衡为非线性v （7）选择性较差吸附法的应用v 气体

4、过滤v 水处理v 脱色、除臭v 目标产物的分离二、吸附剂（固定相）的选择v 吸附剂通常应具备以下特征：§ 表面积大、颗粒均匀、§ 对被分离的物质具有较强的吸附能力§ 有较高的吸附选择性§ 机械强度高§ 再生容易、性能稳定§ 价格低廉。v 常用的吸附剂有极性的和非极性的两种。 羟基磷灰石、硅胶、氧化铝等属前者，活性炭属后者。 人工合成的如大网格吸附剂、分子筛等两种都有。但大多属非极性的。常用的吸附剂v 1大网格聚合物吸附剂：v 2活性碳：助滤，脱色，去热原v 使用:偏酸性(pH 5-7),加热(50-60) 搅拌30minv 活性白土：

5、脱组胺类过敏物，脱色。v 硅藻土：助滤，澄清1.大网格聚合物吸附树 脂 的 网 络 骨 架大网格吸附树脂v 大网格吸附树脂适合于提取各种有机化合物。在抗菌素工业中，用于头孢菌素、维生素B12、林可霉素的提取。大网格吸附剂结构与类型v 按骨架极性：v 非极性（苯乙烯-二乙烯苯）v 中等极性（甲基丙烯酸酯）v 极性 (硫氧基、酰胺、N-O基、磺酸基)v 孔隙度：吸附剂中空隙所占百分比v 孔容：每g吸附剂所含的空隙体积v 骨架密度(真密度)：吸附剂每ml骨架（不包括空隙)的重量。v 湿真密度：空隙充满水时的密度大网格吸附剂吸附条件选择1 吸附剂的选择（相似互溶） ：v 非极性吸附剂从极性溶剂中吸附非

6、极性物质v 高极性吸附剂从非极性溶剂中吸附极性物质v 中等极性吸附剂对两种情况均有吸附能力v 孔径与比表面（孔径6倍于分子直径） 吸附法提取的生化物质大多是弱极性或非极性，一般选非极性或中等极性。大孔吸附剂解吸条件v 1. 选择洗脱剂原则 a. 洗脱剂应容易溶胀大网格吸附剂。 溶剂的溶解度参数和聚合物的溶解度参数接近时，溶剂愈易溶胀聚合物。 （d洗 » d聚） 聚苯乙烯等聚合物的溶解度参数约为18.4v b. 洗脱剂对被吸附物有较大的溶解度 大孔吸附树脂的应用1 生化制药方面的应用v 抗生素分离纯化（再生容易、产品灰分少）：-内酰胺类、大环内酯类、氨基糖苷类、肽类、博莱霉素类、含氮杂

7、环类及其他新抗生素v 维生素的提取纯化： VB12，VB2，VC v 天然产物的分离：生物碱，黄酮，多糖，苷类 、红景天甙等v 生化药物：酶, 氨基酸, 蛋白质, 肽,甾体2 活 性 炭（Active carbon）活性炭对物质的吸附规律v 活性炭是极性吸附剂，因此在水中吸附能力大于有机溶剂中的吸附能力。v 针对不同的物质，活性炭的吸附遵循以下规律：（1）对极性基团多的化合物的吸附力大于极性基团少的化合物（2）对芳香族化合物的吸附能力大于脂肪族化合物（3）对相对分子量大的化合物的吸附力大于相对分子量小的化合物（4）pH 值的影响 碱性 中性吸附 酸性洗脱 酸性 中性吸附 碱性洗脱（5）温度 未

8、平衡前 随温度升高而增加3氧化铝氧化铝的吸附能力很强，可以活化到不同程度，重演性好，再生容易，故是常用的吸附剂之一。氧化铝的活性与其含水量有很大的关系。水分会掩盖活性中心，故含水量愈高，活性愈低。分酸性、碱性和中性三种，v 酸性氧化铝(pH4-5)适合于分离酸性化合物，v 碱性氧化铝(pH9-10)适合于分离碱性化合物，v 中性氧化铝(pH7)适合于分生物碱、挥发油、萜类、甾体及在酸、碱中不稳定的甙类、酯类等化合物。 4硅胶v 硅胶是应用很广的一种极性吸附剂。是具有硅氧交联结构，表面有许多硅醇基的多孔性微粒。硅醇基可与极性化合物或不饱和化合物形成氢键而使硅胶具较强的吸附力。 v 主要优点是化学

9、惰性，具有较大的吸附量，易制备不同类型的多孔硅胶，一般以SiO2.xH2O通式表示。v 硅胶的活性与含水量有关：含水量高则 吸附力减弱。当游离水含量17%以上时， 吸附能力极低，可作为分配色谱的载体v 硅胶具有微酸性，适用于分离酸性和中 性物质，如有机酸、氨基酸、甾体等。5羟基磷灰石（磷酸钙）v 在无机吸附剂中，磷酸钙是唯一的适用于生物活性高分子物质（如蛋白质、核酸）的分离的吸附剂。v 羟基磷灰石主要适用于蛋白质的层析分离，也适用于较小的核酸，如转移RNA的分离。v 用0.5mol/L CaCl2加 0.5mol/L磷酸二钠盐，在室温下反应，得到满意的流速的磷酸钙。CaHPO4.2H2O在pH

10、 7以上，慢慢变为羟基磷灰石，即Ca5(PO4)3OH放出H3PO4。吸附操作技术 固定床吸附操作膨胀床吸附操作流化床吸附操作模拟/移动床吸附操作搅拌釜吸附操作第三节 凝胶柱层析利用凝胶层析介质(固定相)交联度的同所形成的网状孔径的大小，在层析时能阻止比网孔直径大的生物大分子通过。利用流动相中溶质的分子量大小差异而进行分离的一种方法，称之为排阻层析。 第五节 凝胶柱层析一、凝胶层析的原理 二、凝胶的种类 1.葡聚糖凝胶2.琼脂糖凝胶3.聚丙烯酰胺凝胶三、凝胶柱层析的操作与应用（一）凝胶柱层析的操作特点1、凝胶柱层析优点：（1）分离条件温和，因此不易引起生物样品的变性失活；（2）每次分离操作之后

11、，层析剂无需再生就可重复利用；（3）工作范围广，分离的分子质量范围可从几百到数百万；（4）设备简单，分离机理简单，易于操作；（5）样品回收率高，几乎可达100%。2、凝胶层析的缺点：凝胶层析上样量小，操作压力不能高，流速较慢。离子交换树脂结构骨架：接有功能基团，本身是惰性v 离子交换法是通过带电的溶质分子与离子交换剂中可交换的离子进行交换而达到分离纯化的方法。离子交换层析原理1 阳离子交换树脂2 阴离子交换树脂 1强酸性阳离子交换树脂2 弱酸性阳树脂v 功能团可以为羧基-COOH，-OH (酚羟基）v 这类树脂的电离程度小，其交换性能和溶液的pH有很大关系。在酸性溶液中，这类树脂几乎不能发生交

12、换反应，交换能力随溶液的pH增加而提高。3 强碱性阴树脂4 弱碱性阴树脂特殊类型的树脂v 大网格离子交换树脂v 两性均孔树脂v 蛇笼 树脂v 均孔树脂v 多糖交换树脂离子交换树脂命名 ×离子交换树脂命名v 强酸性 （001-099）v 弱酸性（100-199）v 强碱性 （200-299)v 弱碱性 （300-399）v X 后面交联度（对凝胶型离子交换树脂）v 对大孔型离子交换树脂，在型号的前面加¡°¡±表示。离子交换树脂的理化性能对树脂的一般要求：v （1）机械强度：膨胀度大，交联度小的树脂强度差v （2）化学稳定性：主要指耐化学试剂、耐氧

13、化、耐辐射的性能。v （3）大小及形状：制成球形，其直径为。球形的优点是增大比表面积、提高机械强度和减少流体阻力。v （4）色泽：普通凝胶型树脂是透明的球珠，大孔树脂呈不透明的雾状球珠。随合成原料、工艺条件不同，树脂的颜色也有所不同，一般有黄、白、黄褐、红棕等几种颜色。 树脂理化性能v （1）含水量v （2）膨胀度：v （3）膨胀率：v （4）湿真密度：v （5）交换容量；v （6）滴定曲线：离子交换操作方式v 静态：操作简单、但是分批操作，交换不完全v 动态：离子交换柱，交换、洗脱、再生等步骤均在柱内进行，亦称为离子交换层析法, 操作连续、交换完全，适宜多组份分离 柱式固定床（FixedBe

14、d） 模拟移动床（SMB）离子交换操作步骤v 1 树脂的选择v 2 树脂预处理v 3 装柱v 4 离子交换吸附v 5 洗脱v 6 再生2 树脂预处理v 物理处理：水洗、过筛，去杂，以获得粒度均匀的树脂颗粒；v 化学处理：转型 阳离子树脂 酸碱酸 阴离子树脂 碱酸碱 最后以去离子水或缓冲液平衡 3 离子交换吸附4 洗脱v 离子交换完成后，将树脂吸附的物质重新转入溶液的方法 洗脱一般采取梯度淋洗：先采用洗脱能力弱的溶液，使易洗脱组分流出，然后依次使用洗脱能力更强的溶液，洗脱较难洗脱的组分。树脂的再生特性与它的类型和结构有密切关系。v 强酸/强碱树脂再生比较困难，再生剂量比理论值高相当多；v 弱酸/

15、弱碱性树脂则较易再生，再生剂量只需稍多于理论值。v 大孔型和交联度低的树脂较易再生，而凝胶型和交联度高的树脂则要较长的再生反应时间。v 在实际运用中，为降低再生费用，使树脂的性能恢复7080%。再生剂的种类应根据树脂的离子类型来选用，并适当地选择价格较低的酸、碱或盐。v 钠型阳树脂可用NaCl溶液再生，用量为其交换容量的2倍 ；v 氢型阳树脂用强酸再生，盐酸或硫酸v 氯型碱性树脂，主要以NaCl  溶液来再生，但加入少量碱有助于将树脂吸附的色素和有机物溶解洗出。v OH型碱阴树脂则用4%NaOH溶液再生。腺苷蛋氨酸(SAM)的纯化流程腺苷蛋氨酸(SAM)的纯化流程第五节 亲和层析(a

16、ffinity chromatography) 在固定相载体表面偶联具有特殊亲和作用的配基这些配基可以与流动相中溶质分子发生可逆的特异性结合而进行分离的一种方法，称之为亲和层析亲和柱层析 v 一、亲和柱层析的原理v （一）配基固定化：选择合适的配基与不溶性的支撑载体偶联，或共价结合成具有特异亲和性的分离介质；v （二）吸附样品：亲和吸附介质选择性吸附酶或其他生物活性物质，杂质与层析介质间没有亲和作用，故不能被吸附而被洗涤去除；v （三）样品解析：选择适宜的条件，使被吸附的亲和介质上的酶或其他生物活性物质解吸二、亲和吸附介质v 用于亲和层析的理想载体常选用均一的珠状颗粒，特别是琼脂糖和交联葡聚糖

17、，但也使用合成的聚丙烯酰胺凝胶、纤维素衍生物、聚苯乙烯和多孔玻璃珠等。v 选作配基的分子必须具有适当的化学基团，该基团不参与配基与生物分子的特异结合，但是却可以用来连接配基与载体。v 将亲和配基共价偶联在载体的表面，即可制得亲和吸附介质。一般凝胶过滤介质均可作为亲和配基的载体来制备亲和吸附介质。 三、亲和柱层析的操作与应用v （一）亲和柱层析的操作特点v 1基本过程v （1）进料吸附v （2）杂质清洗v （3）目标产物洗脱v （4）层析柱再生（二）亲和层析的特点与应用v 1、亲和层析的特点：在生物制品分离和分析领域有宽广的应用开发前景。由于其具有简便、快速、专一和高效等特点，亲和层析的应用十分

18、广泛，已普及到生命科学的各个领域。v 2、亲和层析亲和层析的应用： v （1）分离和纯化各种生物分子v （2）分离纯化各种功能细胞v （3）用于各种生化成分的分析检测第六节 疏水层析(hydrophobic chromatography) 利用固定相载体上偶联的疏水性配基与流动相中的一些疏水分子发生可逆性结合而进行分离的方法，称之为疏水层析。第六节 疏水柱层析 一、疏水层析的原理v 亲水性蛋白质（酶）表面均含有一定量的疏水性基团。尽管在水溶液中蛋白质（酶）具有将疏水性基团折叠在分子内部而表面显露极性和荷电基团的趋势，但总会有一些疏水性基团或极性基团的疏水部位暴露在蛋白质（酶）表面。这部分疏水基

19、团可与亲水性固定相表面偶联的短链烷基、苯基等弱疏水基会发生疏水性相互作用，被固定相（疏水性吸附剂）所吸附。 二、疏水性吸附剂三、疏水柱层析的操作与应用（一）疏水柱层析的操作特点v 1、层析柱的制备v 2、平衡v 3、加样与洗脱v 4、再生（二）疏水柱层析的特点与应用v 1、疏水柱层析特点：（1）疏水柱层析可直接分离盐析后或高盐洗脱下来的蛋白质、酶等生物大分子溶液；（2）分辨率很高、流速快、加样量大；（3）疏水性吸附剂种类多，选择余地大，价格与离子交换剂相当。v 2、疏水柱层析应用：疏水柱层析适用于分离的任何阶段，尤其是样品离子强度高时，即在盐析、离子交换或亲和层析之后用。疏水柱层析主要用于蛋白

20、质类生物大分子分离纯化。第八节 分配柱层析 一、分配柱层析的基本原理v 分配柱层析是利用被分离物质中各成分在两种不相混溶的液体之间的分配系数不同而使混合物得到分离。v 固定在柱内的液体叫固定相，用作冲洗的液体叫流动相。为了使固定相固定在柱内，需要有一种固体来吸牢它，这种固体本身不起什么分离作用，也没有吸附能力，只是用来使固定相停留在柱内，这种固体叫载体。v 进行分离时先将含有固定相的载体装在柱内，加少量被分离的溶液后，用适当溶剂进行洗脱。在洗脱过程中，流动相与固定相发生接触，由于样品中各成分在两相之间的分布不同，因此向下移动的速度不同，容易溶于流动相中的成分移动快，而在固定相中溶解度大的成分移

21、动就慢，因此得到分离。 二、分配柱层析的载体（一）硅胶 吸水量为50%时仍为粉末状，当其吸水量在17%以上时，硅胶就失去其吸附作用，作为载体使用，此时硅胶层析则为分配层析。 （二）硅藻土 具有微孔结构，不具吸附作用，是现在使用最多的载体。其处理和装柱方法基本同硅胶相似 。（三）纤维素三、分配柱层析的固定相与展开剂（一）固定相 常用的固定相有水、各种缓冲溶液、酸的水溶液、甲酰胺、丙二醇以及为水所饱和的有机溶剂等。有时也采用¡°反相层析法¡±，即用有机溶剂为固定相，而以水或水溶液或与水混合的有机溶剂为流动相。 （二）展开剂 流动相一般用为水所饱和的有机溶剂或

22、水一有机溶剂互溶的混合液，一般常用的流动相溶剂有石油醚、醇类、酮类、酯类、卤代烷类、苯类等，或它们的混合物。反相层析法常用的流动相，则为正相层析法中的固定相，如水、各种水溶液（包括酸、碱、盐与缓冲液）、低级醇类等。 三、分配柱层析的基本操作（一）装柱 装柱前，将固定相与载体混合，如果用硅胶、纤维素等载体时，可以直加固定相直接混合，用硅藻土为载体先把硅藻土放在大量流动相液体中，在不断搅拌下，逐渐加入固定相。 （二）加样v 1、将被分离物配成浓溶液，用吸管轻轻沿管壁加到含固定相载体的上端，然后加流动相洗脱；v 2、被分离物溶液用少量含固定相的载体吸收，溶剂挥发后，加在层析管载体的上端，然后加流动相

23、洗脱；v 3、用一块比管径略小的圆形滤纸吸附被分离物溶液，溶剂挥发后，放在载体上，然后加流动相洗脱。四、分配柱层析的特点与应用v （一）特点：v 分配柱层析具有载体来源容易、分离成本低、流速快等特点,适用于分离极性比较大、在有机溶剂中溶解度小的成分，或极性很相似的成分。v （二）应用：v 分配柱层析多用于分离亲水性的成分，如苷类、糖及氨基酸类。 实验十 胡萝卜素的柱层析分离 一、实验准备 v （一）实验原理及目的v 1、原理v 本实验采用氧化铝为固定相的吸附层析。各种物质具有不同的吸附力，v 胡萝卜素存在于胡萝卜、辣椒等黄绿色植物中，由于在动物体内可将胡萝卜素转变为维生素A，故又称维生素A原。

24、胡萝卜素（属多烯色素类，又可分为、等几种类型）可用乙醇、石油醚和丙酮等有机溶剂从食物中提取出来，并能被氧化铝所吸附。由于胡萝卜素与其他植物色素的化学结构不同，它们在有机溶剂中的溶解度以及被氧化铝吸附的强度也不相同，故将抽提液进行氧化铝柱层析，再用石油醚等冲洗层析柱，即可将植物提取液中混合的胡萝卜素分离成不同的色带。同植物其他色素相比较，胡萝卜素的极性最小，吸附最差，用石油醚洗脱速度最快，故被最先洗脱下来，使胡萝卜素与其他色素分开。同时也可将胡萝卜素层析带洗脱下来进行比色定量。 v 2、目的 （1）了解柱层析的基本原理 （2）掌握胡萝卜素分离的操作方法v （二）试剂及器具 1、材料 新鲜红辣椒、

25、氧化铝（Al2O3，高温烘烤除去水分，提高其吸附力） 2、试剂 95%乙醇、无水硫酸钠、石油醚（沸点6090）、1%丙酮-石油醚液（丙酮：石油醚=1：1；体积比）、三氯化锑氯仿溶液（称取三氯化锑22g，加100ml氯仿溶解后，贮于棕色瓶中）。 3、器具 剪刀、研钵，层析柱（1cm×16cm）,100ml分液漏斗，量筒100ml，铁架台及蝶形夹，蒸发皿，恒温水浴，天平，烧杯、软木塞、棉花、胶头滴管、滤纸、试管 二、实验过程 乙醇 石油醚 蒸馏水 硫酸钠红辣椒 研磨 研磨 洗涤 提取液 除水 上样 层析 收集洗脱液 鉴别 三、注意事项 v （一）实验中一定要将新鲜红辣椒研细，以彻底破坏植

26、物细胞，使胡萝卜素释放更完全。丙酮可增强分离效果，有利于对胡萝卜素的提取，若分离条件控制得好，可依次提取、分离得到胡萝卜素，ß胡萝卜素、胡萝卜素，以及紧随其后的是辣椒红素，番茄红素及叶黄素等植物色素。v （二）为使分离色带整齐，装柱时层析柱一定要无裂缝和气泡，氧化铝的高度一般为玻璃柱高度的3/4，装好柱后柱上面覆一层滤纸，以保持柱上端顶部平整，若上端不平，影响分离效果而产生不规则的条带。v （三）分离洗脱过程中，要连续不断加入洗脱液，并保持一定高度的液面，在整个操作中绝不能使氧化铝表面的液体流干。v （四）三氯化锑腐蚀性较强，在实验过程中切勿触及皮肤。三氯化锑遇水生成碱式盐，再转变成

27、氯氧化锑，此化合物与胡萝卜素不发生颜色反应，而出现浑浊。v （五）石油醚提取液中的乙醇必须洗净，否则吸附不好，层析中色带也弥散不清。v （六）层析柱底部棉花的用量不宜过多，松紧要适宜，否则将影响流速。实验十一 离子交换色谱分离混合氨基酸一、实验准备 v （一）实验原理及目的v 1、原理 本实验采用磺酸型阳离子交换树脂分离酸性氨基酸天冬氨酸（Asp，pI=2.97，分子量为133.1）和碱性氨基酸赖氨酸（Lys，pI=9.74，分子量为146.2）的混合液。在pH=5.3条件下，因为pH值低于Lys的pI值，Lys可解离成阳离子结合在树脂上；Asp可解离成阴离子，不被树脂吸附而流出层析柱。在pH

28、=12条件下，因pH值高于Lys的pI值，Lys可解离成阴离子从树脂上被交换下来。这样，通过改变洗脱液的pH值可使它们被分别洗脱而达到分离的目的。v 2、目的 (1)、了解离子交换树脂分离氨基酸基本原理 (2)、掌握阳离子交换树脂处理技 v （二）试剂及器具 1、材料 磺酸型阳离子交换树脂（732型） 2、试剂 树脂处理液：2mol/LNaOH、2mol/L HCL、1mol/L HCL、1mol/L NaOH、0.45mol/L柠檬酸缓冲液（pH=5.3）、0.01mol/LNaOH缓冲液（pH=12）、天冬氨酸、赖氨酸、茚三酮、无水乙醇。 3、器具 离子交换色谱柱、量筒、吸管、收集器、试管

29、、恒流泵。 二、实验过程 树脂处理、转型 装柱 平衡 上样 洗脱 收集 测定 三、注意事项 v （一）为使分离色带整齐，装柱时层析柱一定要无裂缝和气泡。v （二）分离洗脱过程中，要连续不断加入洗脱液，并保持一定高度的液面，在整个操作中绝不能使树脂表面的液体流干。v （三）一直保持流速10滴/min12滴/ min，并注意勿使树脂表面干燥。 实验十二 凝胶柱层析分离蛋白质 一、实验准备 v （一）实验原理及目的v 1、原理：v 凝胶层析（gel chromatography）是利用某些凝胶对于不同组分因分子大小不同而阻滞作用不同的差异而进行分离的技术。当溶液在层析柱内流过时，各种物质分子在柱内同时进行向下的移动和不定向的分子扩散运动。大分子物质由于分子直径大，难于进入凝胶颗粒的微孔，只能